CN115970001B - 多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体涉多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料的应用。多巴胺修饰的水凝胶微球包括多微孔水凝胶和在多微孔水凝胶表面覆盖的多巴胺自聚涂层，多微孔水凝胶与多巴胺自聚涂层之间以共价和非共价两种键接方式形成化学连接，再利用所述水凝胶微球表面负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体。体外实验和动物实验证明，负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球具有极低的干细胞毒性，可有效抑制肌腱干细胞衰老，抑制成骨向分化，促进成肌腱向分化。对衰老肌腱损伤大鼠模型局部注射负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球可有效促进衰老肌腱的快速修复。

Description

多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体 复合材料的应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种多巴胺修饰的水凝胶微球、其负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体及制备方法及其在制备促进肌腱修复药物或抑制肌腱干细胞衰老药物中的应用。

背景技术

肌腱损伤是临床上的一种常见疾病，常常由于创伤、剧烈运动或继发于慢性肌腱炎症、肿瘤等。成年后肌腱细胞密度低，血管含量少，导致其自身修复再生能力差。目前，传统的肌腱再生修复的治疗方法依然存在众多问题，例如功能恢复不理想、二次损伤率高等。肌腱干细胞(Tendon stem cells,TSCs)是肌腱组织工程首选的种子细胞，高表达肌腱特异性基因。损伤早期TSCs的干性功能的特异性激活直接影响肌腱的再生效果。值得关注的是，临床上中老年患者肌腱损伤发病率高，常常伴有慢性炎症或者系统性疾病，TSCs干性功能下降，肌腱再生能力低下。因此，探究特异、安全的生物干预措施替代传统生物因子用于修复早期增强TSCs干性，对于增强病理情况下的肌腱再生修复效果具有重要意义。

细胞外囊泡(EVs)是外泌体和微泡的总称，是发挥再生能力的重要因素。与基因编辑、生长因子相比，EVs来源广泛、安全性高，是组织再生修复有效的治疗载体。研究表明“年轻”间充质干细胞的EVs可以通过传递分子信号增强干细胞干性，逆转衰老特征，从而改善组织修复能力。乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是发育早期的牙髓间充质细胞，可以从脱落的乳牙中获得。从再生医学角度研究发现，SHED是最接近胚胎时期细胞特征，干性功能更强，且前期临床研究显示SHED通过旁分泌效应在组织损伤、尤其是骨组织修复中起到治疗性作用。然而，如何有效在肌腱损伤区域局部递送SHED外泌体，增强肌腱干细胞功能，提高SHED外泌体局部治疗效率仍然是需要解决的重要问题。

发明内容

<技术问题>

为了解决现有技术的问题，本发明提供一种多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体及其制备方法，以及将该水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体用于制备促进肌腱修复的药物或抑制肌腱干细胞衰老药物的应用。本发明的多巴胺修饰的水凝胶微球，其结合了水凝胶微球的三维多孔隙性、亲水性好、粘弹性高、生物相容性好等优点和多巴胺涂层的高黏附性特点，可有效负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体并提高单位载量，进而制得一种可注射的、高细胞黏附和细胞运载能力的制剂，其用于抑制肌腱干细胞衰老、抑制肌腱干细胞成骨向分化、促进成肌腱向分化，实现肌腱损伤的修复。

<技术方案>

第一方面，本发明提供一种多巴胺修饰的水凝胶微球，其包括多微孔水凝胶和在多微孔水凝胶表面覆盖的多巴胺自聚涂层，所述多微孔水凝胶与多巴胺自聚涂层之间以共价和非共价两种键接方式形成化学连接。

第二方面，本发明提供一种多巴胺修饰的水凝胶微球的制备方法，其包括：步骤1：制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)水凝胶；

向明胶溶液中加入甲基丙烯酸酐反应，反应结束后，去除游离的甲基丙烯酸酐，得到甲基丙烯酰化明胶，经过冷冻干燥获得白色泡沫状冻干凝胶，即甲基丙烯酰化明胶(GelMA)水凝胶；

步骤2：制备多微孔GelMA水凝胶微球；

将预先产生临时物理交联且带有光引发剂的GelMA水凝胶暴露在紫外光下以引发光交联，再通过梯度冷冻干燥处理，得到多微孔GelMA水凝胶微球；

步骤3：制备多巴胺修饰的多微孔GelMA水凝胶微球；

采用浸渍法，将多微孔GelMA水凝胶微球浸入多巴胺碱性溶液中，之后经洗涤，冷冻干燥，得到多巴胺修饰的多微孔GelMA水凝胶微球。

优选地，步骤1中，制备GelMA水凝胶的方法为：

将明胶按照1g：8-12ml溶于40-60℃的PBS中，加入等体积的甲基丙烯酸酐，边搅拌边加，接着加入PBS将反应体系稀释3-10倍以终止反应；

使用透析袋透析，每天更换双蒸水，以彻底去除游离的甲基丙烯酸酐直至透析袋内液体澄清为止，产物即为甲基丙烯酰基取代度为100％的GelMA，经过冷冻干燥，获得白色泡沫状冻干凝胶，即GelMA水凝胶。

优选地，步骤2中，制备多微孔GelMA水凝胶微球的方法为：

将GelMA水凝胶配成浓度为3-8％(w/v)的GelMA溶液，滴加到含有亲脂型非离子表面活性剂的液体石蜡中，在室温下搅拌以形成油包水乳液，在油相中形成若干水性微球；继续在冰浴中连续搅拌，使微球之间产生临时物理交联，然后暴露在紫外光(405nm)下引发光交联，之后用丙酮去除油相，将分离的微球通过梯度冷却和冷冻干燥处理，形成多微孔GelMA水凝胶微球。

优选地，步骤3中，制备多巴胺修饰的多微孔GelMA水凝胶微球的方法为：将多微孔GelMA水凝胶微球浸入多巴胺碱性溶液中4h以上，取出，用PBS洗涤未结合的多巴胺，冷冻干燥。

优选地，步骤1和步骤3中，制备的产物均置于-20℃保存备用。

优选地，步骤2中，所述亲脂型非离子表面活性剂为Span80；步骤3中，所述多巴胺溶液含有2-4mg/ml的多巴胺、10mM Tris-HCL，pH 8-9。

第三方面，本发明提供一种多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料，其包括多巴胺修饰的水凝胶微球和负载在其上的人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体；所述多巴胺修饰的水凝胶微球为上述任一实施例制备的多巴胺修饰的水凝胶微球。

第四方面，本发明提供一种多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料的制备方法，其包括：采用浸渍吸附法，将上述任一实施例制备的多巴胺修饰的水凝胶微球置于人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的溶液中孵育1-6h，洗净，冻干；或者将人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的溶液滴加到多巴胺修饰的水凝胶微球上，完成外泌体的自组装，洗净，冻干。

优选地，所述人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的制备方法为：

对含有外泌体的蔗糖垫采用联合超速离心法离心，重复多次以去除蔗糖重水溶液，收集到的浓缩液即为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)外泌体(Exo)，随后用0.22μm孔径过滤除菌，分装、保存于-80℃冰箱。

第五方面，本发明提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备抑制肌腱干细胞衰老药物、抑制肌腱干细胞成骨分化药物、促进肌腱干细胞肌腱分化药物、肌腱损伤修复药物、或提高肌腱细胞增殖能力药物中的应用。

第六方面，本发明提供一种多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料在制备抑制肌腱干细胞衰老药物、抑制肌腱干细胞成骨分化药物、促进肌腱干细胞肌腱分化药物、肌腱损伤修复药物、或提高肌腱细胞增殖能力药物中的应用。其中，所述肌腱干细胞主要是指衰老肌腱干细胞。

优选地，所述药物为注射剂。

<技术方案的效果>

(1)本发明通过细胞水平实验及大鼠实验验证，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体可以明显抑制肌腱干细胞衰老、抑制肌腱干细胞成骨分化，促进肌腱干细胞成肌腱分化的能力，对自然衰老肌腱退化模型进行注射脱落乳牙牙髓干细胞外泌体治疗证实了，注射人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体可以促进老年肌腱损伤修复，促进肌腱胶原纤维结构的修复。因此，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体可以用于制备抑制肌腱干细胞衰老药物、抑制肌腱干细胞成骨分化药物、促进肌腱干细胞肌腱分化药物、肌腱损伤修复药物或提高肌腱细胞增殖能力药物。

(2)本发明进一步采用多巴胺修饰水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体，该复合材料结合了水凝胶微球的三维多孔隙性、亲水性好、粘弹性高、生物相容性好等优点和多巴胺涂层的高黏附性特点，以提高细胞粘附性能，具有很低的细胞毒性，可提高细胞对微球及其表面生物活性分子的运载能力。

(3)本发明采用乳液-溶剂萃取技术制成水凝胶多孔微球，再置于多巴胺PDA溶液中，多巴胺自聚形成多巴胺涂层，该涂层与水凝胶多孔微球以共价键和非共价的双重连接，所述多微孔水凝胶微球因具有球形而具有较大比表面积，水凝胶的多孔性更进一步增加了微球比表面积和吸附(吸附外泌体和粘附细胞)的能力，多巴胺一方面可作为负载外泌体的桥接，提高外泌体单位载量，另一方面多巴胺具有高黏附性，有利于细胞的粘附和运载，提高外泌体的生物利用率。由图1a、1b可观察到水凝胶多孔微球总体呈现均匀的圆形，形态规则，表面均匀布满了蜂窝状的微孔。

(4)体外研究证实，负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球可有效抑制肌腱干细胞衰老，抑制成骨向分化，促进成肌腱向分化。利用衰老肌腱损伤模型，局部注射负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球可有效抑制异位骨化的形成，促进衰老肌腱的快速安全修复。

本发明的负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的水凝胶微球制作简单方便，可操作性大，能够有效、长期用于制备治疗老年化肌腱损伤相关疾病的药物，且优选地该药物为注射剂。

附图说明

图1a为乳液-溶剂萃取初级多微孔水凝胶微球(GM)及多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA)的体示镜拍摄图。

图1b为乳液-溶剂萃取初级多微孔水凝胶微球(GM)以及多巴胺修饰水凝胶微球(GM@PDA)的SEM图。

图2为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA&SHED-Exos)的免疫荧光图。

图3为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA&SHED-Exos)与肌腱干细胞混合培养至3天后的活/死细胞免疫荧光染色图。

图4中，左图为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA&SHED-Exos)处理情况下肌腱干细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色图(带有黑色斑点细胞为染色阳性细胞)，右图为对应的染色阳性细胞比例的统计图。

图5a中，左图为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA&SHED-Exos)在成骨诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后的茜素红染色图(图中着色较深区域为染色阳性区域)，右图为对应的染色强度的统计图。

图5b中，为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA&SHED-Exos)在成骨诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后成骨标志物Runx2、Bglap基因表达检测结果。

图6为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA&SHED-Exos)在成肌腱诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后的肌腱标志物Tnc、Fmod的免疫荧光染色图(图中白色亮点区域为阳性表达区域)。

图7为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的水凝胶(GM@PDA&SHED-Exos)制剂促进老年肌腱损伤修复的HE染色组织图。

具体实施方式

水凝胶是一种具有三维孔隙度的高分子材料，其具有亲水性好、粘弹性高、生物相容性好等优点。水凝胶微球具有类似大块状水凝胶一样的三维网络结构，独特微米级尺寸(通常在1-1000μm)，赋予了它模块化的功能属性。与宏观水凝胶相比，水凝胶微球可以提高智能水凝胶的响应速度，具有保护、传递和局部释放药物、生长因子的能力。乳化-溶剂萃取法是将水凝胶预聚物溶液加入到含有适量体积油的容器中搅拌即可，通过简单的机械混合，得到油包水型乳液，水凝胶预聚物会被分散不同程度大小的液滴(水凝胶微球的雏形)，随后液滴交联洗涤、离心去除油相即得水凝胶，该制备方法设备依赖度低，操作简单、易大规模生产。水凝胶经临时物理交联和光引发交联，最终制得具有大量微孔结构的水凝胶微球。多巴胺是含有邻苯二酚(位置4处的氢被2-氨基乙基取代)和氨基的化合物，在碱性条件下邻苯二酚会转化为醌并自我聚合形成聚多巴胺，赋予材料极强的细胞黏附能力。近年来，聚多巴胺涂层由于其极强的黏附性能被广泛应用在生物领域，但在高均一性水凝胶微球表面镀聚多巴胺以提高细胞对微球的运载能力的报道相对少见。

本发明则采用多巴胺修饰水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体，该复合材料结合了水凝胶微球的三维多孔隙性、亲水性好、粘弹性高、生物相容性好等优点和多巴胺涂层的高黏附性特点，以提高细胞粘附性能，具有很低的细胞毒性，可提高细胞对微球及其表面生物活性分子的运载能力。

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明实施例范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例为多微孔水凝胶微球(GM)及多巴胺修饰的水凝胶微球(GM@PDA)的制备，制备步骤如下：

(1)GelMA水凝胶的制备：

①将明胶按照1g/10ml溶于50℃的PBS当中，加入等体积的甲基丙烯酸酐，边搅拌边微量泵入，接着用PBS稀释5倍终止反应；

②使用透析带透析2周，每天更换双蒸水，彻底去除游离的甲基丙烯酸酐，直至液体澄清为止，反应产物即为甲基丙烯酰基取代度为100％的GelMA。

③经过冷冻干燥获得白色泡沫状冻干凝胶，置于-20℃备用。

(2)初级多微孔水凝胶微球(GM)的制备

①将5％w/v GelMA的水溶液滴加到含有Span80的液体石蜡中，并在室温下搅拌30分钟形成W/O(油包水型)乳液。

②将W/O乳液在冰浴中连续搅拌30分钟，进而使GelMA球体产生临时物理交联。

③将带有光引发剂(甲基丙烯酰基)的GelMA球体暴露在405nm紫外光下引发光交联。

④用丙酮分离去除油相后，将分离的GelMA球体通过梯度冷却和冷冻干燥处理，形成多微孔GelMA水凝胶微球。

(3)多巴胺修饰水凝胶微球(GM@PDA)的制备

①将多孔的GelMA水凝胶微球浸入多巴胺溶液中(2mg/ml，10mM Tris-HCL，pH8.5)中6小时。

②使用10mM的PBS溶液中充分摇晃洗涤3次出去多余的多巴胺溶液，之后冷冻干燥后，置于-20℃备用。

将冷冻干燥后的GM和GM@PDA微球分别置于体示镜下进行拍摄，多微孔GelMA水凝胶微球的拍摄图片如图1a的上图所示，GM@PDA水凝胶微球的拍摄图片如图1a的下图所示。多微孔GelMA水凝胶微球的形状为规则的球体，粒径分布在100-180μm，主要是集中在120-160μm，而粒径120-150μm占到80％以上，130-140μm占到60％以上。GM@PDA水凝胶微球的形状为规则的球体，其粒径相对GM有所增大，粒径主要集中分布在120-170μm，而粒径130-160μm占到80％以上，130-150μm占到70％以上。

如图1b所示，进一步将冷冻干燥后的多微孔GM和GM@PDA水凝胶微球分别喷金后，进行扫描电镜拍摄。多微孔GM水凝胶微球的拍摄图片如图1b的上图所示，GM@PDA水凝胶微球的拍摄图片如图1b的下图所示。如图所示，在多微孔GM水凝胶微球和GM@PDA水凝胶微球均匀密布着孔洞，这些孔洞使微球呈蜂窝状结构。在GM@PDA的孔洞中和表面覆盖具有纤维状物质，为多巴胺自聚涂层。

实施例2

本实施例为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球的制备例，制备步骤如下：

(1)人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的提取和制备

细胞培养基收集至50ml离心管(上清液体积不超过离心管体积的2/3)，使用Beckman台式冷冻离心机进行如下离心步骤：300×g 4℃离心10min去除死细胞，2000×g 4℃离心10min去除细胞碎片，5000×g 4℃离心30min去除大分子囊泡。离心结束后将上清分别转移到10KD和100KD超滤管中进行浓缩，使用10KD超滤管5000×g 4℃离心30min后得到SHED的条件培养基浓缩液(Conditional Medium，CM)，命名为SHED-CM；使用100KD超滤管5000×4℃离心10min得到超滤浓缩液。

将100KD超滤浓缩液置于离心管中，然后无菌注射器抽取5ml 30％蔗糖垫(注：30％蔗糖垫为蔗糖与重水按照质量/体积比等于30％配制)，将针头抵住管底，缓慢注入30％蔗糖垫溶液，培养基和蔗糖垫出现分层后，将剩余浓缩培养基沿离心管上1/3管壁缓慢加入，使液面高度至管口3mm处，使用Beckman Optima^TM XPN-100超速离心机SW 32Ti水平转子在100000×g 4℃下离心70min，离心结束后，小心吸弃蔗糖垫上培养基，收集下方含外泌体的蔗糖垫。

(2)外泌体的洗涤、收集

将含外泌体的蔗糖垫使用PBS稀释后置于100KD的超滤管中，5000×g4℃离心10min，重复离心3次去除蔗糖重水溶液，收集到的浓缩液即为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)来源的外泌体(Exo)，即，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)，随后0.22μm针头式滤器过滤除菌，分装、保存于-80℃冰箱。

(3)多巴胺修饰水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体：将人脱落乳牙干细胞外泌体溶液滴加在多巴胺自聚修饰的多孔微球上，完成外泌体自组装，洗净后冻干备用。

(4)取适量人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体室温与荧光染料PKH26孵育，离心后用PBS洗涤3次去除多余染料，将PKH26标记的外泌体与多巴胺修饰的水凝胶微球室温孵育后加入到培养有肌腱干细胞的培养皿当中，通过激光共聚焦显微镜检测，见图2。如图2所示结果可知，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体确实已经被负载到多巴胺修饰水凝胶微球的表面，同时表达F-actin的肌腱干细胞同时很好地附着在微球表面。

实施例3

本实施例为多微孔水凝胶微球(GM)以及多巴胺自聚修饰水凝胶微球(GM@PDA)、负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球的生物性能检测，检测方法如下：

获取16-18月龄大鼠Achilles肌腱，充分切碎，使用胶原酶和分散酶消化后，得到肌腱肌腱干细胞，使用DMEM培养基重悬细胞，置于5％CO₂浓度的37℃孵箱中培养，每隔2-3天更换新鲜培养基。培养至P1、P2代的细胞呈梭形用于后续实验，用于验证负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球对肌腱干细胞是否具有毒性。

对照组是将干细胞加入至单纯的GelMA水凝胶微球溶液(GM)或多巴胺修饰的GelMA水凝胶微球溶液(GM@PDA)中；实验组是将肌腱干细胞TSCs加入负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的GelMA水凝胶微球溶液(GM@PDA&S-Exos)中，进行以下处理：

在相同条件下培养后，进行活/死细胞染色，镜下检测肌腱干细胞在水凝胶微球上的分布。检测结果如图3所示。由该图可知，与GelMA水凝胶微球组(GM组)相比，多巴胺修饰GelMA微球组(GM@PDA组)和负载SHED-Exos的多巴胺修饰GelMA微球组(GM@PDA&S-Exos组)有更多的细胞粘附，活细胞数目更多，见图3。这说明，多巴胺修饰的GelMA微球以及负载SHED-Exos的多巴胺修饰GelMA微球具有非常低的细胞毒性和很高的细胞粘附性。

实施例4

本实施例是关于负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球抑制肌腱干细胞(TSCs)衰老的生物学功能的验证实验。

为了验证负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球对肌腱干细胞增殖、衰老的影响，以下通过β-半乳糖苷酶染色实验进行验证。

对照组是将肌腱干细胞TSCs加入至单纯的GelMA水凝胶微球溶液(GM组)或多巴胺修饰的GelMA水凝胶微球溶液(GM@PDA组)中，实验组是将肌腱干细胞TSCs加入至负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰的GelMA水凝胶微球溶液(GM@PDA&S-Exos组)中，进行以下处理：

相同条件下连续培养7-10天后，用β-半乳糖苷酶染色(β-半乳糖苷酶为衰老细胞标志物)，镜下随机拍照并分别统计阳性染色细胞数目。实验结果如图4所示，其中带有黑色斑点细胞为染色阳性细胞(即衰老细胞)。由图4的结果显示：对照组衰老细胞数目较多，实验组衰老细胞数目较少，实验组和对照组相比具有统计学意义。通过β-半乳糖苷酶染色实验证明：体外使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球与肌腱干细胞共孵育后，可显著抑制肌腱干细胞的衰老。

实施例5

本实施例是关于负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球抑制肌腱干细胞(TSCs)成骨分化的生物学功能的验证实验。

为了验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)具有抑制肌腱干细胞成骨向分化的作用，以下通过茜素红染色(Alizarin Red S,即ARS，为一种成骨细胞分化或骨细胞标志物)和RT-qPCR实验进行验证。

对照组是将TSCs加入至单纯的GelMA微球溶液(GM组)或多巴胺修饰的GelMA水凝胶微球溶液(GM@PDA组)中，实验组是将TSCs加入人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球的溶液(GM@PDA&S-Exos组)中，对照组和实验组每隔2-3天加入更换新鲜的成骨诱导培养基，进行以下处理：

(1)在连续培养14天后，进行ARS染色，镜下随机拍照并统计染色阳性强度；(2)相同条件下连续培养14天后，使用RT-qPCR技术，统计成骨相关基因Alp、Bglap表达情况，通过检测成骨细胞中的Alp、Bglap的表达水平高低反应出肌腱干细胞成骨分化能力。实验结果如图5a和图5b所示：

其中，对照组阳性染色面积比例较高，而实验组阳性染色面积比例较低，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图5a；实验组相较于对照组成骨相关基因Alp、Bglap表达明显降低，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图5b。由实验结果可知，使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球成骨诱导培养基条件下处理肌腱干细胞TSCs后，可明显抑制肌腱干细胞的成骨分化能力。

实施例6

本实施例是关于负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球促进肌腱干细胞(TSCs)肌腱向分化的生物学功能的验证实验。

为了验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球具有促进肌腱干细胞肌腱向分化的作用，以下通过天狼星红染色、细胞免疫荧光染色实验进行证明。

对照组是将肌腱干细胞TSCs加入至单纯的GelMA水凝胶微球溶液(GM组)或多巴胺修饰GelMA水凝胶微球溶液(GM@PDA组)中，实验组是将肌腱干细胞TSCs加入至人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球溶液(GM@PDA&S-Exos组)中，对照组和实验组每隔2-3天加入更换新鲜的成肌腱诱导培养基，进行以下处理：

相同条件下连续培养14天后，使用细胞免疫荧光技术，统计成肌腱相关标志物TNC、FMOD的表达情况，通过检测成肌腱细胞中的TNC、FMOD的表达水平高低反应出肌腱干细胞肌腱向分化的能力。

实验结果如图6所示：实验组(GM@PDA&S-Exos组)相较于对照组(GM@PDA组和GM组)成肌腱相关标志物TNC、FMOD表达明显增高。

由上述实验结果可知，通过细胞免疫荧光实验证明，使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球GM@PDA&S-Exos在肌腱诱导培养基条件下处理肌腱干细胞TSCs，可明显促进肌腱干细胞肌腱向分化的能力。

实施例7

本实施例为负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球促进老年肌腱损伤修复的生物学功能的验证实验。

为了验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exos)具有促进老年肌腱损伤修复的生物学功能，以下通过HE染色实验进行验证，HE染色可便于细胞组织的形态。

治疗组(GM@PDA&S-Exos组)：选取雄性SD大鼠(18月龄)为自然衰老肌腱损伤模型，对大鼠使用4％水合氯醛以每250g大鼠体重按照1mL剂量范围进行腹腔注射麻醉，进入深麻醉状态后，俯卧位固定大鼠，进行跟腱部分离断，每隔一周注射一次(注射液为50微升负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球的溶液，注射部位为大鼠后腿跟腱处)，共注射3次，术后8周实行安乐处死，并取肌腱组织进行检测分析。取小鼠上颌骨于4％多聚甲醛固定，之后用于HE染色实验。

对照组(GM组、GM@PDA组)：将治疗组中注射的溶液替换成等浓度的GM水凝胶微球溶液或GM@PDA水凝胶微球溶液。

空白组：即Normal组，为正常未损伤的肌腱。

进行以下处理：

术后8周后，进行HE染色，检测胶原纤维完整程度。实验结果见图7所示：治疗组中胶原纤维完整且排列较为整齐，而对照组胶原纤维断裂且不整齐。本实验结果证明，注射负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的多巴胺修饰水凝胶微球的溶液，可促进老年肌腱损伤的修复，促进肌腱胶原纤维结构的修复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种多巴胺修饰的水凝胶微球负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体复合材料在制备抑制肌腱干细胞衰老药物、抑制肌腱干细胞成骨分化药物、促进肌腱干细胞肌腱分化药物、肌腱损伤修复药物、或提高肌腱细胞增殖能力药物中的应用；所述多巴胺修饰的水凝胶微球包括多微孔水凝胶和在多微孔水凝胶表面覆盖的多巴胺自聚涂层，所述多微孔水凝胶与多巴胺自聚涂层之间以共价和非共价两种键接方式形成化学连接。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用浸渍吸附法将所述多巴胺修饰的水凝胶微球置于人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的溶液中孵育1-6h，洗净，冻干；或者将所述人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的溶液滴加到多巴胺修饰的水凝胶微球上，完成外泌体的自组装，洗净，冻干。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴胺修饰的水凝胶微球的制备方法如下：

步骤1：制备GelMA水凝胶；

向明胶溶液中加入甲基丙烯酸酐反应，反应结束后，去除游离的甲基丙烯酸酐，得到甲基丙烯酰化明胶，经过冷冻干燥获得白色泡沫状冻干凝胶，即GelMA水凝胶；

步骤2：制备多微孔GelMA水凝胶微球；

将预先产生临时物理交联且带有光引发剂的GelMA水凝胶暴露在紫外光下以引发光交联，再通过梯度冷冻干燥处理，得到多微孔GelMA水凝胶微球；

步骤3：制备多巴胺修饰的多微孔GelMA水凝胶微球；

采用浸渍法，将多微孔GelMA水凝胶微球浸入多巴胺碱性溶液中，之后经洗涤，冷冻干燥，得到多巴胺修饰的多微孔GelMA水凝胶微球。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1中，制备GelMA水凝胶的方法为：

将明胶按照1g：8-12ml溶于40-60℃的PBS中，加入等体积的甲基丙烯酸酐，边搅拌边加，接着加入PBS将反应体系稀释3-10倍以终止反应；使用透析袋透析，每天更换双蒸水，以彻底去除游离的甲基丙烯酸酐直至透析袋内液体澄清为止，产物即为甲基丙烯酰基取代度为100％的GelMA，经过冷冻干燥，获得白色泡沫状冻干凝胶，即GelMA水凝胶。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2中，制备多微孔GelMA水凝胶微球的方法为：

将GelMA水凝胶配成质量体积浓度为3-8％的GelMA溶液，滴加到含有亲脂型非离子表面活性剂的液体石蜡中，在室温下搅拌以形成油包水乳液，在油相中形成若干水性微球；继续在冰浴中连续搅拌，使微球之间产生临时物理交联，然后暴露在紫外光下引发光交联，之后用丙酮去除油相，将分离的微球通过梯度冷却和冷冻干燥处理，形成多微孔GelMA水凝胶微球。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3中，制备多巴胺修饰的多微孔GelMA水凝胶微球的方法为：

将多微孔GelMA水凝胶微球浸入多巴胺碱性溶液中4h以上，取出，用PBS洗涤未结合的多巴胺，冷冻干燥。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。