KR20220029531A - 엑소좀이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 엑소좀을 포함하는 하이드로젤 패치에 관한 것이다.

Description

엑소좀이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치{EXOSOME-LOADED BIO-INSPIRED TISSUE-ADHESIVE HYDROGEL PATCH}
본 발명은 엑소좀이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치에 관한 것이다.
약물 제어방출 기술 시장은 2016년 285억 달러를 기록한 이후 2025년까지 13.8 %의 지속적인 연평균복합성장률을 보일 것으로 전망된다. 그러나 많은 경우 약물전달 효율의 향상이 필요하며 전달 가능한 약물의 유형 및 적응증이 제한적이다. 따라서 다양한 약물을 탑재할 수 있으며 보다 효율적인 서방형 방출이 가능한 약물전달 시스템은 경제적으로 큰 부가가치를 가지는 의료기술이며 보건사회적으로도 큰 파급효과를 창출할 수 있다.
한편, 현재 난치성 질환 치료 및 조직 재생을 위해 다양한 줄기세포를 이용한 세포치료제가 활발히 연구되고 있다. 그러나 줄기세포는 암 유발, 면역반응 등 부작용 및 안전성 문제로 인해 임상적용이 쉽지 않고 제품화가 어렵다. 따라서 최근에는 줄기세포 치료를 대체하기 위해 줄기세포에서 분비되는 인자들을 세포 대신 치료제로 적용하는 전략이 각광받고 있다. 특히, 줄기세포가 분비하는 엑소좀(exosome)에는 조직 재생을 촉진시키고 항염증 작용을 유도하는 다양한 인자들이 포함되어 있다고 알려져 있어 줄기세포에서 추출, 분리된 엑소좀을 창상, 심근경색, 뇌경색, 척수손상, 염증성 장 질환, 각종 허혈성 질환 등 다양한 난치성 질환에 적용하는 연구가 활발히 진행 중이다.
줄기세포에서 추출하는 엑소좀은 안전성 문제로 임상적용이 쉽지 않은 줄기세포 치료제를 대체하여 당뇨성 창상, 심근경색, 뇌경색, 척수손상, 염증성 장 질환, 각종 허혈성 질환, 탈모 등 다양한 질환의 치료에 있어 뛰어난 효능을 보여주는 연구결과가 많이 보고되었다. 엑소좀을 활용한 치료제 시장 규모는 37.8%의 연평균복합성장률이 예상되며 2022년까지 3.68억 달러(USD)에 육박할 것으로 예측되는데 이에 따라 자연스레 생체 내로 엑소좀 전달 효율을 극대화할 수 있는 전달 시스템의 개발이 필수적으로 요구될 것이다. 따라서 엑소좀 기반 치료가 적용될 수 있는 다양한 질환의 막대한 시장규모까지 고려하면 본 발명에서 개발된 하이드로젤 패치 기반의 엑소좀 전달 기술은 막대한 고부가가치를 창출할 수 있을 것으로 기대된다.
그러나, 엑소좀의 뛰어난 재생 치료 효능에도 불구하고 엑소좀을 생체 내로 효율적으로 전달하는 기술은 개발이 매우 미비한 상황이다. 단백질 성장인자 및 항염증 약물을 전달하기 위한 생체소재 및 나노소재 기반의 약물전달 시스템이 개발되어 왔으나 이러한 기존 시스템이 엑소좀 전달에 적용된 경우는 많지 않다. 특히, 하이드로젤 기반의 국소 약물전달 시스템이 개발되어 왔으나 기존의 액상형 하이드로젤 제형의 경우 생체적합성, 기계적 물성, 조직 접착성 및 사용 편의성을 향상시키고 서방형 전달 효율이 더욱 개선되어야 할 필요성이 있다.
따라서, 본 발명에서는 종래 약물전달 기술의 한계를 극복하고 엑소좀 서방형 전달이 가능한 패치 제형의 하이드로젤을 제작하였다. 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 페놀기가 수식된 히알루론산 유도체 기반의 하이드로젤 패치에 탑재함으로써 기존의 액상형 하이드로젤 제형과 비교하여 조직 접착성, 기계적 물성 및 서방형 엑소좀 방출 능력을 크게 개선하였다.
KR 10-2014-0006661
본 발명은 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수하면서, 엑소좀을 담지하는 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치를 제조하기 위한 것으로, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 하이드로젤 패치 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 홍합, 멍게 등 해양생물의 접착 성분을 모사한 페놀기(카테콜, 갈롤기)로 수식된 히알루론산 유도체 하이드로젤 패치를 기반으로 하는 엑소좀 서방형 국소전달 시스템을 개발하였다. 줄기세포에서 추출되는 엑소좀은 조직재생에 도움이 되는 다양한 성장인자와 항염증 인자 등을 함유하고 있어 임상적용이 쉽지 않은 줄기세포를 대신할 치료제로서 현재 활발히 연구되고 있다. 본 발명에서는 인간 지방 유래 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 페놀기 수식 히알루론산 하이드로젤 패치에 탑재한 제형을 제작하였다.
페놀기로 수식된 히알루론산 고분자 유도체를 가교하여 하이드로젤을 제작하기 위해서는 산화제와 같은 가교제를 첨가해야 한다. 하지만 엑소좀을 탑재하면 엑소좀의 막을 구성하는 단백질 및 지질 성분들의 작용기와 페놀기가 반응하여 추가적인 가교제 처리 없이도 하이드로젤을 형성할 수 있으며 엑소좀이 탑재되지 않은 하이드로젤 패치와 비교하여 향상된 기계적 물성을 유도할 수 있었다. 나아가 엑소좀의 농도를 조절함으로써 하이드로젤의 물리적 특성 및 기계적 물성을 조절할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서는 탑재된 엑소좀이 산화된 페놀기와의 반응을 통해 가교에 직접 참여하여 하이드로젤 내부에 효율적으로 포집될 수 있을 뿐 아니라 기계적 물성을 강화함과 동시에 지속적인 엑소좀의 서방형 방출이 가능함을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 구축된 페놀기 수식 히알루론산 하이드로젤 패치 기반의 엑소좀 전달 시스템은 엑소좀만을 단순 주입하는 방식이나 기존 하이드로젤 기반 엑소좀 전달 기술에 비해 더욱 향상된 조직 재생 및 치료 효능을 보여줄 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 하이드로젤 패치를 제공한다.
먼저, 본 발명에 따른 엑소좀 하이드로젤 패치는 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치를 포함한다.
본 명세서 내 "페놀기"라 함은 말단에 페놀계 화합물 유래 작용기, 바람직하게, 하이드록시기(-OH) 두개가 인접 위치한 1,2-디하이드록시벤젠(dihydroxybenzene)을 포함하는 카테콜계 화합물 유래 작용기 또는 하이드록시기(-OH) 세개가 인접 위치한 1,2,3-트리하이드록시벤젠(trihydroxybenzene)을 포함하는 파이로갈롤계 화합물 유래 작용기로서, 상기 페놀기는 산화반응에 의해서 여러가지 작용기(functional group)와 공유 가교(cross-linking)를 형성할 수 있다. 상기 페놀기 외에 상기 생체적합성 고분자와 반응하기 위한 말단 작용기를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 카테콜계 화합물은 카테콜(catechol), 4-tert-부틸카테콜(4-tert-butylcatechol; TBC), 우루시올(urushiol), 알리자린(alizarin), 도파민(dopamine), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA), 카페익산(caffeic acid), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(3,4-dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC), 이소프레날린(isoprenaline), 이소프로테레놀(isoproterenol) 및 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명에서는 카테콜계 화합물로서, 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 사용하였고, 이때, 상기 도파민 하이드로클로라이드의 말단 작용기 중에 -NH2가 상기 생체적합성 고분자(특히, 히알루론산)와 반응할 수 있다.
또한, 상기 파이로갈롤계 화합물은 파이로갈롤(pyrogallol), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산(tannic acid), 갈산(gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명에서는 파이로갈롤계 화합물로서, 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사 용하였고, 이때, 상기 5-하이드록시도파민의 말단 작용기 중에 -NH2가 상기 생체적합성 고분자(특히, 히알루론산)와 반응할 수 있다.
특히, 상기 페놀기가 파이로갈롤기인 경우, 특히 빠르게 산화되는 특성으로 인해 생체 내 존재하는 산소에 노출되면 산화제 처리 없이 자연산화가 수 분내로 이루어질 수 있으므로 엑소좀 하이드로젤 패치를 실제 임상에 적용할 때 별도의 산화제 처리 없이 바로 적용이 가능한 장점이 있다.
본 명세서 내 "생체적합성 고분자"라 함은 상기 페놀계 화합물에 존재하는 말단 작용기와 반응하여 페놀기가 수식될 수 있고, 구체적으로, 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산, 펙틴, 케라틴 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 히알루론산인 것이 바람직하고, 분자량이 100 kDa 내지 10 MDa인 히알루론산인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 히알루론산의 말단 작용기 중에 -COOH가 상기 페놀계 화합물과 반응할 수 있다.
본 명세서 내 "하이드로젤 패치"라 함은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 것으로, 일정 두께를 갖는 얇은 막 형태의 구조물을 말하며, 공지의 방법을 이용하여, 예컨대, 잘라서 또는 몰드를 통해, 원하는 형태로 사용할 수 있는 장점이 있다. 용액 기반의 벌크 하이드로젤과 비교하여 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수한 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 하이드로젤 패치는 하기 단계를 통해 제조될 수 있다:
(a) 평평한 표면에 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 고르게 붓는 단계; 및
(b) 상기 용액을 영하 0.5 ℃내지 영하 100 ℃에서 5시간 내지 48시간 동안 동결건조시키는 단계.
구체적으로, 상기(a) 단계는 원통 몰드에 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 40~200 ㎕씩 붓는 방식으로 이루어질 수 있으며, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액은 0.1 내지 5(w/v)% 농도, 바람직하게 0.5 내지 3(w/v)% 농도로 사용될 수 있다. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액의 용량은 0.8 내지 3.2 ㎜ 두께의 하이드로젤 패치를 만들기 위한 것으로 두께 조절이 용이하다.
또한, 상기(b) 단계는 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 영하 0.5 ℃ 내지 영하 100 ℃에서 5시간 내지 48 시간 동안 동결건조시키거나, 바람직하게, 영하 50 ℃내지 영하 100 ℃에서 12시간 내지 36시간 동안 동결건조시키는 방법으로 이루어질 수 있다. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 동결건조시키면 용액의 부피가 축소하면서 일정한 두께를 갖는 얇은 막 형태의 하이드로젤 패치가 만들어질 수 있다.
이로써, 상기 하이드로젤 패치는 i) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜, 바람직하게, 0.1 내지 5.0 ㎜, 보다 바람직하게, 1.6 mm 내지 5.0 mm이고, ii) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1Х103 Pa 내 지 1Х106 Pa, 바람직하게, 2Х103 Pa 내지 1Х106 Pa 저장탄성률(G′) 및 0.01 내지 0.15의 tanδ를 가질 수 있고, 5 N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4이며, iv) 접착강도는 0.1 N 내지 10 N, 바람직하게는 0.2 N 내지 1.6 N, 더욱 바람직하게, 0.25 N 내지 1.55 N, 가장 바람직하게는 0.3 N 내지 0.57 N이다. 상기 하이드로젤 패치가 파이로갈롤기 수식 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치인 경우, 기계적 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 엑소좀 하이드로젤 패치는 상기 하이드로젤 패치에 담지된 엑소좀을 포함한다. 상기 엑소좀 하이드로젤 패치의 총 함량에 대하여, 상기 엑소좀의 함량은 0.002 중량% 내지 10 중량%일 수 있고, 0.002 중량% 내지 4 중량%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 다시 말해, 상기 하이드로젤 패치(0.05~10.0 mm 직경 및 0.05-10.0 ㎜ 두께 기준, 바람직하게, 0.1~5.0 mm 직경 및 0.1-5.0 ㎜ 두께 기준) 당, 상기 엑소좀 100 ng 내지 2 mg을 담지시킬 수 있다. 구체적으로 엑소좀 하이드로젤 패치는 전술한 하이드로젤 패치 제조 시 엑소좀을 1 내지 250 μg/ml, 더욱 구체적으로 50 내지 100 μg/ml, 보다 구체적으로는 50 또는 100 μg/ml의 농도로 포함하여 제조될 수 있다.
이는 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있어 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있다. 상기 엑소좀에는 다양한 친핵성 작용기들이 존재할 수 있어, 산화된 페놀기와 강한 결합을 일으킬 수 있다.
구체적으로, 상기 엑소좀에 존재하는 친핵성 작용기들(아민기, 티올기, 이미다졸기 등)은 산화된 페놀기와 강한 결합을 일으킬 수 있으므로, 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있다.
구체적으로, 상기 하이드로젤 패치에 상기 엑소좀을 담지하는 방법은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액과 엑소좀을 혼합시켜 하이드로젤 패치를 제조하거나, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치에 엑소좀을 도포한 후 산화제를 처리하여 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치에 엑소좀을 가교시키는 방법을 사용할 수 있다. 이때, 산화제의 처리는 엑소좀이 도포된 하이드로젤 패치에 산화제 용액을 도포하거나 분사하는 방식으로 이루어질 수 있다. 다만, 상기 하이드로젤 패치에서 파이로갈롤기가 수식된 경우, 별도의 산화제 처리 없이도 생체 내 환경에서 자연산화되므로 실제 임상에서 간편하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 개발된 엑소좀 탑재 페놀기 수식 히알루론산 하이드로젤 패치는 엑소좀을 탑재한 상태로 동결 건조된 ready-to-use & off-the-shelf 제형으로 제작이 가능하므로 사용자의 편의성이 크게 증대되고 의료진이 다양한 질환 부위에 손쉽게 적용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 엑소좀 뿐만 아니라 세포가 분비하는 다양한 세포외소포체 및 베지클들을 마찬가지 방식으로 효율적으로 탑재하고 전달하여 치료에 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 세포에서 분비되는 인자들을 기반으로 하는 치료 기술은 세포 이식 없이도 세포 치료의 효과를 유도할 수 있으므로 개발 과정이 빠르고 안전성 측면에서도 더욱 유리하여 상업화 가능성이 매우 높다. 따라서 막대한 줄기세포 치료제 시장을 상당 부분 대체할 수 있는 난치성 질환 치료 기술로 무궁한 가능성이 있다.
도 1은 HA-CA의 구조식(a)과, HA-CA 하이드로젤 패치의 팽윤도(b) 및 효소에 의한 분해 속도(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HA-CA 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HA-CA 하이드로젤 패치의 마찰계수(a), 마모도 여부(b) 및 마모도 면적(c)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HA-PG의 구조식(a)과, HA-PG 하이드로젤 패치의 팽윤도(b) 및 효소에 의한 분해 속도(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HA-PG 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HA-PG 하이드로젤 패치의 마찰계수(a), 마모도 면적(b) 및 마모도 여부(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 엑소좀이 탑재된 HA-PG 하이드로젤의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 8은 사용된 인간 지방 유래 중간엽줄기세포에서 추출된 엑소좀(exosome)을 분석한 결과와 이를 HA-PG 하이드로젤 패치에 도입하였을 때 하이드로젤 내부의 구조적 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 물리적 특성 및 기계적 물성을 확인한 결과이다.
도 10은 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 접착 기능성을 확인한 결과이다.
도 11은 제조된 하이드로젤 패치의 화학적 가교 기전을 분석한 결과이다.
도 12는 제조된 하이드로젤 패치의 구조적 안정성을 팽윤 및 분해 양상 분석으로 확인한 결과이다.
도 13은 제조된 하이드로젤 패치의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 14는 제조된 하이드로젤 패치의 엑소좀 방출 거동 및 활성을 분석한 결과이다.
도 15는 제조된 하이드로젤 패치의 당뇨성 창상 치료 효능을 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1
(1) HA-CA 하이드로젤 패치 제작
도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 사용하여 카테콜기가 수식된 히알루론산(catechol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-CA로 기재함, 도 1의 a)(분자량 = 200 kDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 8 ㎜ 원통 몰드에 1(w/v)% HA-CA 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HA-CA 하이드로젤 패치를 제작하였다. 제작된 HA-CA 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다.
한편, HA-CA를 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해시키고, 이 용액에 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 첨가하여 HA-CA 벌크 하이드로젤을 제작하였다. 제작된 HA-CA 벌크 하이드로젤에서 HA-CA의 최종 농도는 1(w/v)%이다.
(2) HA-CA 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석
생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 14일 동안 담그고, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 팽윤도가 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)에 비해 높은 것으로 확인된다(도 1의 b).
한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(100 U/샘플). 일정 시간마다 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)은 히알루론산 분해효소를 처리한 후 2시간 이내에 빠르게 분해되어 6시간 후에는 완전히 분해되나, HA-CA 하이드로 젤 패치(Patch)는 히알루론산 분해효소 처리 24시간 이후에도 남아 있어 효소에 의한 분해 속도가 느려지는 것으로 확인된다(도 1의 c).
(3) HA-CA 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석
레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch) 및 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)은 모두 저장탄성률(G')가 손실탄성률(G”)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 2의 a).
또한, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)의 평균 저장탄성률(G')은 약 450 Pa 수준인 반면, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 평균 저장탄성률(G')은 약 2500~2600 Pa 수준인 것으로 나타나 평균 저장탄성률(G')이 약 5배 이상 증가한 것으로 확인된다(도 2의 b).
한편, HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤이 코팅된 스틸 표면 사이에 5 N의 수직항력을 가한 상태에서 0.01 m/s의 속도로 마찰력 분석 장비를 이동시켜 마찰계수를 측정하였다. 측정 결과, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰계수가 가장 높게 나왔고, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch) 순 이였다(도 3의 a). 또한, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰로 인해 마모도(wear scar)가 크게 생겼고, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)를 코팅한 경우 마모도(wear scar)가 적게 생긴 것으로 확인된다(도 3의 b). 따라서, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)를 코팅한 경우, 코팅되지 않은 경우(No treatment)에 비해 마모도 면적이 유의미하게 감소한 것으로 확인된다(도 3의 c).
제조예 2
(1) HA-PG 하이드로젤 패치 제작
5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사용하여 파이로갈롤기가 수식된 히알루론산(pyrogallol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-PG로 기재함, 도 4의 a) (분자량 = 200 kDa 및 1 MDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 8 ㎜ 원통 몰드에 1(w/v)% HA-PG 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HA-PG 하이드로젤 패치를 제작하였다. 제작된 HA-PG 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다.
한편, HA-PG를 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해시키고, 이 용액에 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 첨가하여 HA-PG 벌크 하이드로젤을 제작하였다. 제작된 HA-PG 벌크 하이드로젤에서 HA-PG의 최종 농도는 1(w/v)%이다.
(2) HA-PG 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석
생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 14일 동안 담그고, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)의 팽윤도가 HA-PG 벌크 하이드로젤(Gel)에 비해 높은 것으로 확인된다(도 4의 b).
한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(200 U/샘플). 일정 시간마다 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel)은 히알루론산 분해효소를 처리한 후 초기에 빠르게 분해되나, HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)는 히알루론산 분해효소 처리 28일 이후에도 남아 있어 효소에 의한 분해 속도가 상당히 느려지는 것으로 확인된다(도 4의 c).
(3) HA-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석
레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch) 및 HA-PG 벌크 하이드로젤(Gel)은 모두 저장탄성률(G')가 손실탄성률(G”)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 5의 a).
또한, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel)의 평균 저장탄성률(G')은 모두 매우 낮은 수준인 반면, HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)의 평균 저장탄성률(G')은 각각 약 14 kPa 및 약 24 kPa 수준인 것으로 나타나 평균 저장탄성률(G')이 상당히 증가한 것으로 확인된다(도 5의 b).
한편, HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤이 코팅된 스틸 표면 사이에 5 N 의 수직항력을 가한 상태에서 0.01 m/s의 속도로 마찰력 분석 장비를 이동시켜 마찰계수를 측정하였다. 측정 결과, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰계수가 가장 높게 나왔고, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch) 순이였다(도 6의 a). 또한, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰로 인해 마모도(wear scar)가 크게 생겼고, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)를 코팅한 경우 마모도(wear scar)가 적게 생긴 것으로 확인된다(도 6의 b). 따라서, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)를 코팅한 경우, 코팅되지 않은 경우(No treatment)에 비해 마모도 면적이 유의미하게 감소한 것으로 확인된다(도 6의 c).
실시예 1: 엑소좀이 탑재된 HA-PG 하이드로젤의 특성 확인
1-1. 엑소좀이 탑재된 HA-PG 하이드로젤 (엑소좀 하이드로젤 패치)의 제조
본 발명에서는 천연고분자 히알루론산(HA)에 갈롤기(PG)를 도입하여 HA-PG 유도체를 합성하고 HA-PG 용액에 인간 지방 유래 중간엽줄기세포에서 추출된 엑소좀(exosome)을 함께 혼합한 후 동결건조하여 엑소좀이 탑재된 패치 제형을 제작하였다 (도 7).
사용된 인간 지방 유래 중간엽줄기세포에서 추출된 엑소좀(exosome)은 DLS 분석하여 크기 분포 양상을 확인한 결과, 평균 96.6 nm 직경 값을 가지며 PdI 값이 0.476으로 균일한 크기를 가지는 것을 확인하였다 (도 8 a). 또한, 투과전자현미경(TEM) 분석을 이용하여 엑소좀의 형태와 크기를 다시 관찰하여 94.17 nm 크기의 구형 나노입자 형태를 가지고 있음을 확인하여 DLS 분석 결과와 일치하는 양상을 확인하였다 (도 8 b).
HA-PG 용액에 엑소좀이 혼합된 1% (w/v) 농도의 HA-PG 용액을 준비한 뒤 동결 건조하여 제작한 패치의 내부 구조를 주사전자현미경(SEM) 분석을 이용하여 관찰하였을 때, 엑소좀이 탑재된 HA-PG 패치가 더욱 촘촘한 다공성 구조를 가지며, 내부 구조 표면에 100 nm 직경의 엑소좀 입자 형태가 관찰되는 것을 확인하였다 (도 8 c).
1-2. 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 물리적 특성 확인
HA-PG 유도체는 본래 시간에 따른 갈롤기의 자연산화를 통해 가교가 가능하지만 엑소좀의 도입으로 인해 더욱 빠르고 안정적인 가교가 가능하였다. 엑소좀에 포함된 다양한 단백질의 작용기(아민기, 티올기, 이미다졸기 등)와 산화된 갈롤기 사이의 높은 반응성을 통해 탑재된 엑소좀이 HA-PG 하이드로젤 내부의 가교를 더욱 증진시킬 수 있었다.
구체적으로, 본래 HA-PG 하이드로젤은 산화가 진행될 수록 짙은 노란 색깔을 띄게 되는데 같은 시간 동안 엑소좀이 탑재된 패치와 탑재되지 않은 패치를 PBS 조건에서 37℃에서 gelation 유도 후 가교의 정도를 색깔의 차이로 확인하였다(도 9 a).
Rheometer (frequency sweep mode) 분석을 통해 엑소좀의 농도가 증가함에 따라 하이드로젤 패치의 물성이 개선되고 elasticity가 유지됨을 확인하였다 (도 9 b, Exo 0 그룹; 1% HA-PG 패치, Exo 50 그룹; 50 μg/ml 엑소좀이 탑재된 1% HA-PG 패치, Exo 100 그룹; 100 μg/ml 엑소좀이 탑재된 1% HA-PG 패치, BSA 100 그룹; 100 μg/ml BSA가 탑재된 1% HA-PG 패치). 또한, 엑소좀과 동일한 농도의 BSA 단백질을 첨가한 패치 (BSA 100 그룹) 보다 엑소좀 패치 (100 그룹)의 modulus 물성이 더 높게 측정되었는데 이를 통해 엑소좀 성분이 HA-PG 하이드로젤 패치의 물성 강화를 유도할 수 있음을 알 수 있다 (도 9 b).
1-3. 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 접착 기능성 확인
Tack test 용 기판과 하이드로젤 패치를 자연산화로 가교시킨 후 접착력을 확인하였다 (도 10 a)
HA-PG 패치에 50 μg/ml 엑소좀을 탑재했을 때 (Exo 50 그룹) 엑소좀이 탑재되지 않은 경우 (Exo 0 그룹)와 비교하여 접착력이 감소하였으나 엑소좀의 농도를 증가하여 탑재하면 (Exo 100 그룹) 하이드로젤 패치의 최대 접착력이 엑소좀이 탑재되지 않은 패치의 36.8% 수준까지 다시 회복되는 것을 확인하였다 (도 10 b, Exo 0 그룹; 1.55 N, Exo 100 그룹; 0.57 N).
또한, 접착력 그래프를 적분하여 하이드로젤 패치가 tack test 용 기판에서 떨어지는데 필요한 에너지를 계산하였을 때 비슷한 경향을 나타내는 것을 확인하였다 (도 10 c). 특히, Exo 100 그룹에서 하이드로젤 패치가 tack test용 기판에서 떨어지는데 필요한 에너지가 Exo 0 그룹의 57.9%인 것을 확인하여 HA-PG 패치에 엑소좀이 탑재되더라도 패치의 접착력을 상당 수준 유지할 수 있음을 확인하였다 (도 10 c, Exo 0 그룹; 25.1 mJ, Exo 100 그룹; 12.4 mJ).
1-4. 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 화학적 가교 기전 분석
엑소좀에 존재하는 다양한 단백질과 지질의 작용기 (amine, thiol, imidazole 등)들은 갈롤기와 반응하여 HA-PG 하이드로젤의 가교 속도를 증진시킬 수 있을 것으로 기대되며, 이를 확인하였다.
구체적으로, 엑소좀 패치의 화학적 가교 기전 분석을 위해 2% HA-PG 용액 (HA-PG 그룹)과 200 μg/ml 엑소좀이 첨가된 HA-PG 용액 (HA-PG/Exo 그룹)을 자연산화 (37℃ incubation)하여 UV-vis spectroscopy 분석을 진행하였을 때, HA-PG/Exo 그룹에서 300~450 nm 구간의 peak가 HA-PG 그룹보다 빠른 속도로 증가하는 것을 확인하였다 (도 11 a). 또한, 해당 peak는 HA-PG 유도체의 자연산화로 인해 생성되는 semi-quinone intermediate (350-380 nm peak 해당)와 phenoxyl radical (350-380 nm peak 해당), purpurogallin (325, 420-440 nm peak 해당)에 의해 형성되는 broad peak이므로 엑소좀의 첨가가 HA-PG 유도체의 자연산화 속도를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 더불어 510-530 nm에서 HA-PG/Exo 그룹에서만 특이적으로 peak이 증가하는 것을 확인하였다. 해당 peak은 갈롤기와 엑소좀의 lipid surface와의 상호작용에 의해 변화가 생기는 것으로 추정할 수 있다.
또한, FT-IR 분석으로 HA-PG와 HA-PG/Exo을 비교하였을 때 1500-1700 cm-1 부근에서 amide I & II peak에서의 spectra 양상이 다른 것으로 보아 엑소좀과 HA-PG간의 상호작용이 있음을 알 수 있다 (도 11 b).
1-5. 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 구조적 안정성 확인 (팽윤 및 분해 양상 분석)
엑소좀 하이드로젤 패치 (100 μg/ml 엑소좀 탑재된 1% HA-PG 패치 사용)의 팽윤 및 분해 양상을 엑소좀이 탑재되지 않은 HA-PG 패치 (1% HA-PG 패치 사용)와 비교하여 확인하였다.
생리학적 조건(37℃, PBS)에서 엑소좀 HA-PG 패치는 HA-PG 패치보다 낮은 팽윤도를 나타내었다 (도 12 a). 이는 엑소좀이 탑재된 HA-PG 하이드로젤 패치가 HA-PG 패치보다 더 조밀한 내부 구조를 가지고 있음을 간접적으로 확인할 수 있는 것이다.
엑소좀 HA-PG 패치와 HA-PG 패치에 같은 농도 (활성)를 가진 히알루론산 분해 효소 (HAdase)를 처리하였을 때, 높은 농도 (5 U/ml HAdase)에서는 분해 양상에 큰 차이가 없었으나 낮은 농도 (1 U/ml HAdase)에서는 엑소좀 하이드로젤 패치가 HA-PG 패치에 비해 분해가 다소 빠른 것을 확인하였다 (도 12 b).
1-6. 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 세포독성 평가
HA-PG 패치 (1% HA-PG 패치 사용) 또는 엑소좀 HA-PG 패치 (50 또는 100 μg/ml 엑소좀 탑재된 1% HA-PG 패치 사용)를 생리학적 조건(37℃, 세포 배양액)에서 24시간 incubation한 뒤 세포 배양액을 회수하여 인간 지방 유래 중간엽줄기세포(도 13 a, b)와 인간 섬유아세포(도 13 c, d)에 처리하여 배양하는 방식으로 세포 독성을 평가하였다 (도 13).
6일간 배양하면서 Live/Dead 염색법을 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과, 모든 그룹에서 우수한 cell viability를 보이는 것을 확인하여 HA-PG 패치 및 엑소좀 HA-PG 패치 모두 우수한 생체적합성을 가지고 있음을 확인하였다.
1-7. 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 엑소좀 방출 거동 및 활성 분석
엑소좀 HA-PG 하이드로젤 패치 (100 μg/ml 엑소좀 탑재된 1% HA-PG 패치 사용)를 엑소좀 서방형 제제로 활용 가능할지 평가하기 위해 인체 내에 존재하는 히알루론산 분해효소를 처리하면서 (1 U/ml HAdase) 방출된 엑소좀 양을 BCA assay를 통해 확인하였다 (도 14 a). 이러한 결과를 통해 엑소좀 하이드로젤 패치가 3일에 걸쳐 서방형 엑소좀 방출이 가능한 것을 확인하여 창상 부위와 같이 히알루론산 분해효소의 활성이 증가된 조직 결손 부위에서 효과적인 엑소좀 전달을 통해 치료 효과를 보일 것을 알 수 있다.
인간 섬유아세포를 하이드로젤 패치에 삼차원 배양하고 4일 뒤 MTT 분석으로 세포 증식 양상을 비교하였을 때, HA-PG 하이드로젤 패치에서 하루 배양한 샘플을 기준으로 엑소좀 하이드로젤 패치에서 배양된 세포의 증식이 1.5~1.7배 이상 촉진된 것을 확인하였다 (도 14 b). 엑소좀 하이드로젤 패치에서 방출된 엑소좀이 세포의 생존과 증식에 효과적이며 이러한 성질을 이용해 질환 부위의 조직 재생을 위한 서방형 제제로서 활용 가능할 것을 알 수 있다.
실시예 2: 제조된 엑소좀 하이드로젤 패치의 당뇨성 창상 치료 효능 확인
조직 재생 치료제로서의 엑소좀 패치의 활용 가능성을 동물모델 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 마우스에 0.1 g/kg streptozotocin을 2회 (24시간 간격) 복강 주사하여 당뇨를 유발한 뒤, 14일 후 공복 혈당을 측정하여 300 md/dL 이상의 혈당 수치를 가지는 마우스만 사용하여 당뇨성 창상 모델을 제작하였다. 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 마우스 등 피부에 지름 8 mm의 원형 창상을 유발 후, 하이드로젤 패치를 처리하여 서방형 엑소좀 방출을 통한 조직 재생 효과 개선 여부를 관찰하였다 (도 15 a).
엑소좀 하이드로젤 패치 (100 μg/ml 엑소좀 탑재된 1% HA-PG 패치 사용)는 접착 기능성을 기반으로 별도의 가교제 없이 질환 부위에 안정적인 부착이 가능했으며, 기존 HA-PG 패치보다 개선된 물성으로 외부 자극으로부터 창상 부위를 보호하고 효과적인 엑소좀 전달을 유도할 수 있었다.
패치 적용 후 14일까지 육안으로 관찰되는 창상의 크기는 그룹별로 큰 차이를 보이지 않았으나 (도 15 a) 재생된 조직을 수거하여 조직학 분석하였을 때 엑소좀 패치의 조직 재생 증진 효과를 확인할 수 있었다 (도 15 b-f).
Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색법과 Masson’s trichrome (MT) 염색법을 통해 엑소좀 패치가 적용된 경우 새롭게 재생된 진피층이 가장 두껍고 (도 15 c), 비정상적인 상처 조직의 크기가 가장 작은 것을 확인하여 (도 15 d) 효과적인 피부 재생이 유도되었음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 엑소좀 패치 그룹에서 keratin 10 양성인 표피층의 두께가 유의미하게 두꺼워지고 (도 15 e), 피지 샘 (sebaceous gland)과 같은 피부 소기관의 수가 가장 많이 증가한 것을 확인하여 (도 15 f) 엑소좀 패치를 이용하여 유도한 서방형 엑소좀 방출이 손상된 피부의 기능적 조직재생을 극대화할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 하이드로젤 패치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 페놀기는 카테콜(catechol), 4-tert-부틸카테콜(4-tert-butylcatechol; TBC), 우루시올(urushiol), 알리자린(alizarin), 도파민(dopamine), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4- dihydroxyphenylalanine; DOPA), 카페익산(caffeic acid), 노르에피네프린 (norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(3,4- dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC), 이소프레날린(isoprenaline), 이소프로테레놀(isoproterenol) 및 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)로 이루 어진 군으로부터 선택된 카테콜계 화합물 유래 카테콜기; 또는 파이로갈롤(pyrogallol), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산 (tannic acid), 갈산(gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tertButylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)로 이루어진 군으로부터 선택된 파이로갈롤계 화합물 유래 파이로갈롤기인, 엑소좀 하이드로젤 패치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산, 펙틴, 케라틴 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택된, 엑소좀 하이드로젤 패치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀 하이드로젤 패치는
    i) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜이고,
    ii) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1Х103 Pa 내지 1Х106 Pa의 저장탄성률(G') 및 0.01 내지 0.15의 tanδ를 가지고,
    iii) 5 N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4이며,
    iv) 접착강도가 0.1 N 내지 10 N인, 엑소좀 하이드로젤 패치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 줄기세포 유래인 엑소좀 하이드로젤 패치.
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