CN113509594B - 诱导msc细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用，以PLGA微球为核，PLGA微球表面包覆有软骨细胞膜；PLGA微球以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成的水/油/水微球；含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为软骨细胞培养中培养得到的上清液重组浓缩得到；本发明得到的仿生材料，能够实现外泌体和生长因子等在与MSC培养时进行可控释放，以此达到促进MSC成软骨分化；软骨细胞膜，提高了PLGA微球的生物相容性，能够与MSC更好的结合，增强其与细胞之间的信号交流，促进MSC向软骨方向分化。

Description

诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用。
背景技术
由于软骨细胞密度低，缺乏血管及神经，因此软骨的再生能力较低，创伤或疾病引起的局灶性或退行性病变可最终导致骨关节炎。目前热门方向是用组织工程学包括结合支架材料、细胞和生物活性因子在体外进行组织再生。即利用细胞在体外培养出组织后再移植到体内进行修复。其中一个研究方向便是利用软骨细胞与MSC(间充质干细胞)在体外共培养(两种细胞一起混合培养)，来促进MSC向软骨细胞分化。但体外培养用到的软骨细胞需要二次手术的提取，且提取的数目有限，同时细胞对于运输和存储的条件也较为苛刻，这样不仅会造成较高的技术门槛，同时也使得手术风险加大，不可控的因素增多。
发明目的
本发明针对现有技术存在的问题提供一种与MSC共培养时协同互利作用，诱导MSC向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用。
本发明采用的技术方案是：诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料，以PLGA微球为核，PLGA微球表面包覆有软骨细胞膜；PLGA微球以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成的水/油/水微球；软骨细胞条件培养基为软骨细胞培养基培养得到的上清液重组浓缩得到。
仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：提取软骨细胞，然后培养至P2～P5代；
步骤2：采用步骤1得到的软骨细胞提取软骨细胞膜；
步骤3：将步骤1得到的软骨细胞在DMEM高糖培养基中培养，收集上清液，冻干后利用DMEM高糖培养基重新溶解浓缩得到含有软骨细胞分泌因子的条件培养基；
步骤4：以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成水/油/水的PLGA微球；
步骤5：将步骤2得到的软骨细胞膜和步骤4得到的PLGA微球混合、超声、离心洗涤后，即可得到所需仿生材料。
进一步的，所述步骤2中提取软骨细胞膜的过程如下：
将步骤1得到的软骨细胞用胰蛋白酶消化后，经过三次反复冻融循环，依次用质量浓度为15wt.％、30wt.％的蔗糖溶液离心，去除生物大分子及细胞核即可得到所需软骨细胞膜。
进一步的，所述步骤4中PLGA微球制备方法如下：
S11：将质量浓度为40～100g/L的PLGA溶液和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基按照一定的比例混合，超声得到初级乳液；
S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1wt％的聚乙烯醇水溶液按照质量比为1:5～1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液；
S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。
进一步的，所述步骤3中的冻干后得到的冻干粉与DMEM高糖培养基按照一定的质量比例进行溶解浓缩。
进一步的，所述步骤5中软骨细胞膜与PLGA微球的质量比为1:1～5:1。
一种仿生材料的应用，所述仿生材料在制备MSC细胞细胞分化诱导剂中的应用。
进一步的，所述诱导剂用于诱导MSC细胞分化为软骨细胞。
进一步的，所述诱导剂用于修复软骨缺损。
本发明的有益效果是：
(1)本发明得到的仿生材料，能够实现外泌体和生长因子等在与MSC培养时进行可控释放，以此达到促进MSC成软骨分化；
(2)本发明仿生材料表面包裹的软骨细胞膜，增加了PLGA微球的生物相容性，微球上的一些特定的膜蛋白也能够促进与MSC之间的信号交流；
(3)本发明得到的仿生材料用于软骨细胞修复缺损，不需要额外的手术进行提取软骨细胞，且保存/运输方式简单，使用方便；大大简化临床治疗步骤，提高医生工作效率，减轻病患痛苦，降低手术费用，因而更容易在临床上被接收和广泛使用，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备方法流程示意图。
图2为本发明实施例得到的仿生材料的SEM图，图2a为步骤5得到的仿生材料的SEM图，图2b为步骤4得到的PLGA微球。
图3为zeta表面电位测试结果。
图4为本发明实施例得到的仿生材料的蛋白释放能力随时间变化曲线。
图5为本发明实施例得到的仿生材料与对比例分别与MSC一起培养的CCK8检测结果示意图。
图6为本发明实施例得到的仿生材料与对比例分别与MSC一起培养的细胞活死染色结果图。
图7为本发明实施例得到仿生材料与对比例分别与MSC一起培养后的糖胺聚糖分泌量随时间变化结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
如图1所示，一种仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：提取软骨细胞，然后培养至P2～P5代；
步骤2：采用步骤1得到的软骨细胞提取软骨细胞膜；具体过程如下：
将步骤1得到的软骨细胞用胰蛋白酶消化后，经过三次反复冻融循环，依次用质量浓度为15wt.％、30wt.％的蔗糖溶液离心，去除生物大分子及细胞核即可得到所需软骨细胞膜。
步骤3：将步骤1得到的软骨细胞在DMEM高糖培养基中培养，收集上清液，冻干后用DMEM高糖培养基重新溶解浓缩得到含有软骨细胞分泌因子的条件培养基；
步骤4：以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成水/油/水的PLGA微球；具体过程如下：
S11：将质量浓度为40～100g/L的PLGA溶液和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基按照质量比为1:5～1:10的比例混合，超声得到初级乳液；
S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1wt％的聚乙烯醇水溶液按照质量比为1:5～1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液；
S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。
步骤5：将步骤2得到的软骨细胞膜和步骤4得到的PLGA微球混合、超声、离心洗涤后，即可得到所需仿生材料。
得到的仿生材料，以PLGA微球为核，PLGA微球表面包覆有软骨细胞膜；PLGA微球以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成的水/油/水微球；软骨细胞条件培养基为软骨细胞培养基培养得到的上清液重组浓缩得到。
实施例
按照以下步骤制备诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料：
步骤1：提取软骨细胞，然后培养至P2～P5代；
具体过程如下：
将新生的新西兰兔浸没于质量浓度为0.2wt.％的苯扎溴铵溶液中约15min溺亡。再取出放入75％的酒精中1～2min，充分杀死表皮的细菌与真菌，随后转移至超净台。
先用一套无菌手术器械沿四肢根部剪开表皮，小心将皮肤剥离，然后用新的无菌手术器械分别在球窝关节、肩关节处将兔的后肢和前肢剪开，并尖端四肢远端的脚掌和手掌，最后将得到的四肢浸泡于含质量浓度为10wt.％青链霉素的PBS溶液中。然后用无菌的纱布将骨和表面的其它软组织分离，再置于新的含有质量浓度为10wt.％青链霉素的PBS溶液中浸泡。将骨两端软骨组织剪下收集于培养皿中。将提取的软骨用医用纱布和小剪刀剔除非软骨部分，并用PBS反复清洗，用不含EDTA的胰酶消化30min(浸没软骨即可)后，用PBS清洗两次以除去残留的胰酶。用小剪刀将软骨剪碎至粘稠状，加入3.3mg/ml的二型胶原酶消化4h。之后依次通过70μm和40μm的细胞筛网过滤，之后通过转速为1200r/min的速度离心5min。离心结束后倒出上清液，再加入含有质量浓度为20wt.％的FBS、质量浓度为1wt.％的青链霉素、90μg/ml抗坏血酸的DMEM高糖培养基中，置于细胞培养箱中(5％CO2、37℃)培养。
当软骨细胞长满80％～90％时进行传代，吸走培养基，加入5ml PBS溶液清洗3次后，加入1ml不含EDTA的胰蛋白酶消化约5min。当显微镜下细胞变为圆形时，快速吸走胰酶，并加入含质量浓度10wt.％FBS的DMEM高糖培养基终止消化，反复吹打细胞悬液，使细胞完全分散。将得到的细胞进行计数、离心，按每皿1.5×106个的细胞密度进行接种，加入10ml含质量浓度10wt.％的FBS、质量浓度1wt.％青链霉素、90μg/ml的L-抗坏血酸的DMEM高糖培养基中，待细胞长满后继续消化传代。
步骤2：采用步骤1得到的软骨细胞提取软骨细胞膜；具体过程如下：
将培养至P2～P5代的软骨细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化下来，经过三次反复冻融的循环后，依次用质量浓度为15wt.％、30wt.％的蔗糖溶液4℃下，转速为3000r/min的条件下离心10min，以去除生物大分子及细胞核等，即可得到所需软骨细胞膜。
步骤3：将步骤1得到的软骨细胞在DMEM高糖培养基中培养，收集上清液，冻干后用DMEM高糖培养基重新溶解浓缩得到软骨细胞条件培养基；
将培养至P2～P5代的软骨细胞长满至80％后，用PBS冲洗软骨细胞，在无血清的DMEM高糖培养基中培养48h后，收集上清液，在4℃下，转速为3000r/min的条件下离心30min，然后取上清液用0.22μm滤头过滤，以去除剩余的细胞和细胞碎片。最后将收集的上清液放入冻干机中冻干，将冻干成粉末的上清液用DMEM高糖培养基重新溶解浓缩。
步骤4：以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成水/油/水的PLGA微球，PLGA微球使用复乳法制备。
具体过程如下：
S11：将质量浓度为40～100g/L的PLGA溶液(溶剂采用二氯甲烷DCM)(作为油相)和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基(作为内水相)按照质量比为10:1的比例混合，超声得到初级乳液；
超声过程如下：
将混合物在冰浴的条件下利用含有微尖探针的超声器(超声波破碎仪探头)，超声30s得到初级乳液(油包水)。
S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1wt.％的聚乙烯醇水溶液(外水相)按照质量比为1:5～1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液。
乳化采用高速均质器进行，乳化时间为5min，形成二次乳液(水包油)。
S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。
在室温下连续搅拌5～10h，促进溶剂蒸发，挥发除去二氯甲烷。将微球溶液在离心机中以2000r/min离心3min，弃上清后得到初始微球，固化后得到PLGA微球。离心，在水中洗涤三次，冷冻干燥，在-80℃条件下保存。
步骤5：将步骤2得到的软骨细胞膜和步骤4得到的PLGA微球按照质量比为1:1～5:1的比例在PBS水溶液中混合、在室温下超声5min、微球在PBS中离心洗涤三次后，即可得到所需仿生材料。软骨细胞膜碎片包裹到PLGA微球上，得到仿生软骨细胞。
本实施例得到的仿生材料为含有生长因子的PLGA微球表面包裹有软骨细胞膜，附图中的CMMP2。
图2为本发明实施例得到的仿生材料的SEM图，图2a为步骤5得到的仿生材料的SEM图，图2b为步骤4得到的PLGA微球。从图中可以看出细胞膜成功包覆在微球的表面，微球的直径约为10μm。
图3为zeta表面电位测试结果。从图中可以看出，仿生软骨细胞表面的电荷与真正软骨细胞膜表面的电荷相似，而没有进行超声包覆细胞膜的PLGA微球表面电荷与软骨细胞表面的电荷差别明显。
通过BCA试剂盒来检测本实施例得到的仿生软骨细胞的蛋白释放能力，将10mg仿生软骨细胞加入1ml PBS于37℃恒温箱中，分别于24h、48h、72h、96h、120h、144h收集0.5ml上清液的同时再补进0.5ml PBS。
对比例1：
对比例为不含生长因子的PLGA微球(MP1)，按照以下步骤制备：
S11：将质量浓度为40～100g/L的PLGA溶液(溶剂采用二氯甲烷DCM)(作为油相)和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基(作为内水相)按照质量比为5:1～10:1的比例混合，超声得到初级乳液；
超声过程如下：
将混合物在冰浴的条件下利用含有微尖探针的超声器(超声波破碎仪探头)，超声30s得到初级乳液(油包水)。
S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1wt.％的聚乙烯醇水溶液(外水相)按照质量比为1:5～1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液。
乳化采用高速均质器进行，乳化时间为5min，形成二次乳液(水包油)。
S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。
在室温下连续搅拌5～10h，促进溶剂蒸发，挥发除去二氯甲烷。将微球溶液在离心机中以2000r/min离心3min，弃上清后得到初始微球，固化后得到PLGA微球。离心，在水中洗涤三次，冷冻干燥，在-80℃条件下保存。
对比例2：
对比例为含生长因子的PLGA微球(MP2)，按照以下步骤制备：
S11：将质量浓度为40～100g/L的PLGA溶液(溶剂采用二氯甲烷DCM)(作为油相)和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基(作为内水相)按照质量比为5:1～10:1的比例混合，超声得到初级乳液；
超声过程如下：
将混合物在冰浴的条件下利用含有微尖探针的超声器(超声波破碎仪探头)，超声30s得到初级乳液(油包水)。
S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1wt.％的聚乙烯醇水溶液(外水相)按照质量比为1:5～1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液。
乳化采用高速均质器进行，乳化时间为5min，形成二次乳液(水包油)。
S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。
在室温下连续搅拌5～10h，促进溶剂蒸发，挥发除去二氯甲烷。将微球溶液在离心机中以2000r/min离心3min，弃上清后得到初始微球，固化后得到PLGA微球。离心，在水中洗涤三次，冷冻干燥，在-80℃条件下保存。
对比例3：
对比例为不含生长因子的PLGA微球+软骨细胞膜(CMMP1)，按照以下步骤制备：
将对比例1中的MP1微球按照实施例步骤5步骤与软骨细胞膜按照1:1～1:5的比例在PBS水溶液中进行混合，在室温下超声5min之后，微球在PBS中离心洗涤三次，将软骨细胞膜碎片包裹到制备的PLGA微球上，得到仿生软骨细胞微球。
将本实施例得到的仿生软骨细胞与对比例1、对比例2、对比例3得到的微球分别与MSC(间充质干细胞)一起培养，将仿生软骨细胞与MSC按照1:1的比例，8×103的细胞数目接种到24孔板中培养。
培养基使用含质量浓度为10wt.％FBS的α-MEM培养基，培养至1、3、7天后做CCK8(细胞增殖检测)，结果如图5所示。细胞活死染色结果如图6所示，第一排为第1天检测结果，第二排为第3天检测结果，第三排为第7天检测结果。从图中可以看出本发明得到的仿生软骨细胞无毒性，细胞在加入材料后能够很好的增殖。
将仿生软骨细胞与MSC(间充质干细胞)一起共培养。将仿生软骨细胞与MSC按照1:1的比例，2×105的细胞数目接种到96V型底孔板中培养。培养基使用含有1wt.％FBS，1％IT，1％penicillin-streptomycin，90μg/ml VC，0.35mM L-proline，1％non-essentialamino acids的DMEM高糖培养基中培养至7,14,21,28天后收集样品做DNA/GAG的测量。测量结果如图7所示。从图中可以看出仿生软骨细胞组的细胞分泌出的糖胺聚糖要多于其他对照组，说明仿生软骨细胞能够诱导MSC更好的成软骨分化。
本发明制备得到的软骨细胞条件培养基所含软骨细胞分泌的外泌体，生长因子等是能够对MSC成软骨分化起到一定的促进作用，我们制备的负载软骨细胞条件培养基的仿生软骨细胞，能够实现外泌体和生长因子等在与MSC培养时进行可控释放，以此来达到促进MSC成软骨分化。此外，仿生软骨细胞表面包裹的软骨细胞膜，不仅增加了PLGA微球的生物相容性，而且通过与MSC细胞膜相互接触，能够促进与细胞之间的信号交流，促使其向成软骨分化。仿生软骨细胞通过结合以上两个方面的作用，来达到诱导MSC成软骨分化。

Claims (6)

1.一种诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料，其特征在于，以PLGA微球为核，PLGA微球表面包覆有软骨细胞膜；PLGA微球以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成的水/油/水微球；软骨细胞条件培养基为软骨细胞培养基培养得到的上清液浓缩得到；
仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：提取软骨细胞，然后培养至P2~P5代；
步骤2：采用步骤1得到的软骨细胞提取软骨细胞膜；所述步骤2中提取软骨细胞膜的过程如下：
将步骤1得到的P2代细胞用胰蛋白酶消化后，经过三次反复冻融循环，依次用质量浓度为15 wt.%、30 wt.%的蔗糖溶液离心，去除生物大分子及细胞核即可得到所需软骨细胞膜；
步骤3：将步骤1得到的软骨细胞在DMEM高糖培养基中培养，收集上清液，冻干后与DMEM培养基重新溶解，浓缩得到含有软骨细胞分泌因子的条件培养基；
步骤4：以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成水/油/水的PLGA微球；
步骤5：将步骤2得到的软骨细胞膜和步骤4得到的PLGA微球混合、超声、离心洗涤后，即可得到所需仿生材料；
所述步骤4中PLGA微球制备方法如下：
S11：将质量浓度为40～100 g/L的PLGA溶液和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基按照质量比为5:1~10:1的比例混合，超声得到初级乳液；
S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1 wt.%的聚乙烯醇水溶液按照质量比为1:5~1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液；
S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。
2.根据权利要求1所述的一种诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料，其特征在于，所述步骤3中的冻干后得到的冻干粉与DMEM培养基按照质量比例为1:50~1:100的比例溶解浓缩。
3.根据权利要求1所述的一种诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料，其特征在于，所述步骤5中软骨细胞膜与PLGA微球的质量比为1:1~5:1。
4.一种如权利要求1所述仿生材料的应用，其特征在于，所述仿生材料在制备MSC细胞细胞分化诱导剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诱导剂用于诱导MSC细胞分化为软骨细胞。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诱导剂用于修复软骨缺损。
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