CN110124107A

CN110124107A - 一种用于关节软骨修复的plga细胞支架及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110124107A
Application number: CN201910329156.7A
Authority: CN
Inventors: 王克维; 王文波; 孙殿军
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2039-04-23
Also published as: CN110124107B

Abstract

本发明公开了一种用于关节软骨修复的PLGA细胞支架及其制备方法和应用。所述的PLGA细胞支架包括PLGA多孔支架以及种植于该PLGA多孔支架中的软骨细胞、骨髓间充质干细胞以及脂肪干细胞；其中，所述的PLGA多孔支架是由不同聚合比例聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)的聚合产物组成的多层次复合支架；PLGA多孔支架分为外侧区、中间区、内侧区三个区域，向PLGA多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射PLGA支架接种软骨细胞与骨髓间充质干细胞。本发明的支架材料使用了梯度比例的人工合成高分子材料与天然生物蛋白相结合，呈现多层次复合结构，实验证明，本发明的PLGA细胞支架对软骨缺损具有良好的修复效果。

Description

一种用于关节软骨修复的PLGA细胞支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种关节软骨修复材料及其制备方法和应用，特别涉及一种通过使用具有机械强度、组织相容性、生物降解性兼备的复合材料支架与成体细胞结合，制成的PLGA细胞支架，可用于临床治疗各种原因导致的软骨损伤。本发明属于医药技术领域。

背景技术

软骨损伤是临床上的常见病与多发病，尤其在50岁以上的群体中关节损伤非常普遍。病变关节发生于身体不同部位，可单发也可多发，伴有不同程度的功能障碍。关节镜下能够发现不同程度的炎症反应，以及软骨缺损。一般情况下，医生会对症治疗，例如止痛、抗炎、理疗等；如果病变持续加重，软骨变薄，甚至软骨损失殆尽，活动时骨组织之间直接硬性摩擦,导致关节疼痛、肿胀、变形、骨刺增生等多种症状，此时会考虑手术治疗、甚至人工关节置换。软骨损伤治疗从最初的微骨折技术到近期的软骨修复技术，几十年的发展，走过了几个时代，概述如下：

微骨折手术。微骨折手术是一种骨髓刺激技术，也就是通过在关节面软骨缺损的部位钻出直径2mm、深度8mm、间隔2-3mm的微孔。骨髓血从这些微孔流出凝固形成血块，血块中的骨髓干细胞在关节内形成血痂，最后形成纤维软骨组织填补缺损。这种技术简单有效，短期效果好。但是，新形成的修复组织不是真正的关节透明软骨，几年后退化为骨组织，失去软骨的功能。

骨膜—软骨细胞移植术。该技术将软骨组织分离出来的软骨细胞，进行体外培养、扩增，然后再把细胞悬液注射至缺损处，以骨膜覆盖并严密缝合。缺点包括软骨组织样本量小、细胞数量少、培养周期长、细胞渗漏、骨膜增生、骨膜供区受损等等。

胶原膜—软骨细胞移植术。由于摘取骨膜而使供区受损，为了克服此不足，采用胶原膜替代前述骨膜的技术应运而生，但是伴随着与骨膜—软骨细胞移植术同样的弱点，比如周期长、细胞渗漏、细胞去分化等。

基质诱导软骨细胞移植术。以不同基质材料制备生物支架，诱导软骨细胞增殖的一种软骨损伤修复技术。它将软骨细胞种植于过渡性支架上，支架为细胞提供了三维生长空间，有利于软骨细胞表型维持和生长，然后再将含有增殖细胞的支架植入关节软骨缺损处，修复软骨损伤。其缺点包括细胞数量少、培养周期长、细胞去分化、基质材料残留毒性、基质细胞识别信号弱、材料单一及仿生效果差等。

目前市场上，有一款德国专利产品—关节面软骨缺损修复胶原膜，它是水解胶原蛋白后重新制备的蛋白膜，已经在欧盟、澳洲、日本、美国等地临床应用。鉴于该产品仅为胶原蛋白成分，无任何活细胞和生长因子，虽然可以广泛应用，但是与我们申报的产品不是同一类别，仅作参考。

软骨细胞移植技术修复软骨损伤，近年来已经有了长足进步，遗憾的是由于初始取材的软骨组织样本小，增殖缓慢的软骨细胞必须经过长时间的扩增才能达到一定的数量，治疗周期长，以及诱导基质吸收过快、基质材料细胞识别信号差、仿生效果不佳、细胞去分化等不利因素，导致治疗结果仍不尽人意。现在临床上亟需一种能够克服上述弱点的修复材料，治疗关节软骨损伤。组织学上，关节透明软骨呈现“洋葱”样多层次结构，每一层次包裹形态各异、不同数量的细胞。基于上述生物学特点，本发明结合干细胞技术、细胞三维(3D)培养技术，使用能够促进细胞增殖、调节多功能间充质细胞向软骨细胞表型特征分化的细胞生长因子，提出了一种新的软骨修复材料制备技术。

发明内容

本发明的目的在于克服既往软骨材料制备中的不足，提供了一种可用于关节软骨修复的PLGA细胞支架及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于关节软骨修复的PLGA细胞支架，所述的PLGA细胞支架包括PLGA多孔支架以及种植于该PLGA多孔支架中的软骨细胞、骨髓间充质干细胞以及脂肪干细胞；

其中，所述的PLGA多孔支架是由不同聚合比例聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)的聚合产物组成的多层次复合支架；PLGA多孔支架分为外侧区、中间区、内侧区三个区域，向PLGA多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射PLGA支架接种软骨细胞与骨髓间充质干细胞；

其中，外侧区是由聚乳酸(PLA)：聚羟基乙酸(PGA)聚合比例分别为100:0、85:15、75:25的聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)的聚合产物依次叠加组成的三层结构；

其中，中间区是由聚乳酸(PLA)：聚羟基乙酸(PGA)聚合比例分别为50:50、25:75的聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)的聚合产物依次叠加组成的两层结构；

其中，内侧区是由聚乳酸(PLA)：聚羟基乙酸(PGA)聚合比例分别为15:85、0:100的聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)的聚合产物依次叠加组成的两层结构。

其中，优选的，所述的PLGA多孔支架表面采用多聚赖氨酸、明胶蛋白以及Ⅱ型胶原蛋白进行修饰。

其中，优选的，所述的PLGA多孔支架是通过冷冻干燥方法或氯化钠盐颗粒方法制备。

其中，优选的，所述的PLGA多孔支架是通过以下方法制备得到：

PLGA多孔支架的制备：

a)将聚乳酸(PLA)与聚羟基乙酸(PGA)分别按照聚合比例100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100得到的PLA/PGA聚合产物(PLGA)，依次命名为PLGA1(PLA：PGA＝100:0)、PLGA2(PLA：PGA＝85:15)、PLGA3(PLA：PGA＝75:25)、PLGA4(PLA：PGA＝50:50)、PLGA5(PLA：PGA＝25:75)、PLGA6(PLA：PGA＝15:85)、PLGA7(PLA：PGA＝0:100)，将上述PLGA1-7分别称重，置于合适容器中，分别加入有机溶剂溶解PLGA1-7，得到含有PLGA1-7的有机溶液，PLGA1-7聚合物重量百分比终浓度为1～30％，在温度45℃条件下，低速搅拌1.5～2小时，直至完全溶解；

b)将溶解的PLGA1倾倒于锡纸造型的模具中，依需要铸成不同形状、高度，置-18～-20℃2～4小时；

c)在-20～-80℃，真空度10^-1mbar下，干燥17～36小时；

d)释放真空之前，将冷冻干燥容器内的PLGA1干燥物缓慢恢复至室温；

e)释放真空，将溶解的PLGA2倾倒于含有PLGA1干燥物的锡纸造型的模具中，使其位于PLGA1上方，置-18～-20℃2～4小时；

f)重复上述步骤c)-d)，将冷冻干燥容器内的PLGA1/PLGA2干燥物缓慢恢复至室温；

g)重复上述步骤e)-f)，分别将溶解的PLGA3、PLGA4、PLGA5、PLGA6、PLGA7依次倾倒于模具中，制备得到含有7种不同聚合比例PLA/PGA产物(PLGA)的多层次PLGA多孔支架；

h)从锡纸模具上小心地取下PLGA多孔支架，存放于干燥器中备用；

PLGA多孔支架的碱化处理：

a)配制浓度为3.0～5.0％w/v氢氧化钠溶液，取适量体积上述氢氧化钠溶液浸泡PLGA多孔支架，氢氧化钠体积要确保整个支架被液体完全覆盖；

b)低速磁力搅拌约1小时；

c)弃掉溶液，用高纯水洗涤PLGA多孔支架，低速磁力搅拌1小时，该步骤重复两次；

d)真空干燥PLGA多孔支架；干燥时间不少于24小时，然后存放PLGA多孔支架在密封容器中，以避免阳光紫外线分解作用；

多聚赖氨酸包被PLGA多孔支架：

a)多聚赖氨酸储液制备：Poly-L-Lysine用去离子水稀释，制备成浓度为15％w/v的储液；

b)将多聚赖氨酸储液稀释成工作浓度为0.2～5％w/v的L-多聚赖氨酸溶液用于包埋PLGA多孔支架，37℃恒温孵育4小时或常温过夜，4℃冰箱保存；

c)去除L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗PLGA多孔支架，冷冻干燥备用；

PLGA多孔支架的蛋白包埋修饰：

a)制备蛋白包被液：配制浓度为4～10％w/v的明胶蛋白溶液，加入Ⅱ型胶原蛋白使其终浓度为0.4～1.0％w/v，制备明胶蛋白—Ⅱ型胶原蛋白包被液；

b)蛋白交联反应：放置PLGA多孔支架于含30～70mM 2-吗啉乙磺酸的30～50％w/v的乙醇溶液中(pH 4.8～5.2)平衡20-40分钟，接着进行交联反应，交联反应使用含有EDC、NHS、透明质酸、硫酸软骨素以及L-多聚赖氨酸的蛋白包被液进行，其中EDC的质量百分比浓度为0.6％～11％，NHS的质量百分比浓度为0.15％～0.275％，透明质酸的质量百分比浓度为0.1％，硫酸软骨素的质量百分比浓度为5％，L-多聚赖氨酸浓度为2～10mM/L，反应时间为4～6小时；

c)用0.1M的Na₂HPO4溶液清洗PLGA支架0.5小时，重复一次。去离子水反复清洗3次，置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用；

d)京尼平交联反应：PLGA多孔支架浸泡在100ml的含有L-多聚赖氨酸以及京尼平的蛋白包被液中，其中，L-多聚赖氨酸浓度为2～10mM/L、京尼平浓度为5～15mM/L，室温下放置18～30小时；

e)再用PBS溶液冲洗步骤d)得到的PLGA多孔支架1小时，去离子水反复清洗3次,置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用。

其中，优选的，步骤a)中所述的有机溶液为二恶烷。

其中，优选的，采用软骨细胞与脂肪干细胞共培养、软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养的方式获得软骨细胞、脂肪干细胞以及骨髓间充质干细胞。

其中，优选的，所述的PLGA细胞支架通过以下方法制备得到：

PLGA多孔支架预处理：

a)根据软骨损伤创面形状修整PLGA多孔支架，将PLGA多孔支架剪成适宜大小，用75％v/v酒精浸泡消毒、干燥；

b)用DMEM完全培养基润洗PLGA多孔支架；

PLGA多孔支架上的细胞接种：

a)调整细胞浓度为5×10⁷/ml，用于接种PLGA多孔支架；向PLGA多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种共培养的软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射PLGA支架接种共培养的软骨细胞与骨髓间充质干细胞；每立方毫米支架细胞植入量为0.8～2×10⁵个；

b)将接种细胞的PLGA多孔支架置于含8～15％v/v血清的DMEM培养基中，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，72小时后换第一次培养基，之后每隔48小时更换培养基1次，得到所述的PLGA细胞支架。

其中，优选的，对PLGA细胞支架施加负载进行细胞的3D培养，在PLGA多孔支架上进行细胞3D培养时，通过增加培养基液面高度，施以静态压力，同时旋转培养容器使冲击压力达到1～2pa/cm²。给PLGA多孔支架施加一定的负载压力，不但增加了Ⅱ型胶原表达水平，而且模拟了生理状态下软骨组织受力的实际情况。

进一步的，本发明还提出了所述的PLGA细胞支架在制备关节软骨修复材料中的应用。

关节软骨修复材料制备，需要三个主要条件：(A)合适的支架材料。需要兼顾到细胞毒性、降解速率、机械强度等要素；(B)功能正常、足够数量的种子细胞。该方案使用成体软骨细胞、多功能骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等；(C)促进细胞增殖、调节多功能细胞向软骨细胞表型特征分化的细胞因子。本发明的技术方案概述如下：

1)支架材料。既往的研究证实，尚无一种单一材料或单一制备技术，制造出适合软骨组织特征的生物工程支架，细胞支架一定是复合材料，而且是应用综合技术制备的多层次复合材料，模拟透明软骨组织学上多层次生物学特点。

2)支架材料的组成成分、支架形貌结构对引导细胞增殖方向，以及诱导组织形成起到重要作用。支架的设计需要仿生软骨基质的结构特征，即“洋葱”样多层次结构。人工合成材料聚乳酸(PLA)具备一定的机械强度,又有弹性,选用其作为生物材料中的基本成分,为了增加它的可降解性,将它与聚羟基乙酸(PGA)复合,两者随机聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)已在美国通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录于美国药典。作为可降解的高分子有机化合物，具有较好的成膜性能与良好的生物相容性。在生物工程材料领域，它已经作为心脏支架材料得以在临床上广泛应用。然而，PLGA材料本身存在着疏水性，细胞识别位点弱等不足，亟待于克服。

3)增加细胞粘附性提高支架的生物兼容性。为了改善有机高分子材料的生物相容性,利用天然生物成分如多聚赖氨酸、胶原蛋白等，对支架进行表面修饰。

4)透明软骨组织的基质中，蛋白多糖则可控制其中的水分渗透，使占总重量80％的水分保存于软骨组织中。透明质酸与硫酸软骨素的蛋白交联对引导细胞增殖方向,诱导组织形成起到关键作用，这样制备的支架能够很好地仿生软骨组织的细胞外基质结构。

5)功能正常足够数量的软骨种子细胞以及辅助细胞(脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞)，其中软骨细胞体外扩增和间充质干细胞分离提取，细胞的三维(3D)培养等内容是关键的技术环节。软骨组织有很高的硬度和耐冲击力。因此，组织培养过程中，接种了细胞的支架要承载一定的机械压力，才能更好地模拟体内生理环境。

6)细胞培养过程中，使用能够促进软骨细胞增殖、调节辅助细胞向软骨细胞表型特征分化的细胞因子，例如细胞生长因子、转化生长因子等。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明制备得到的新型软骨修复材料(PLGA细胞支架)努力克服既往的技术不足之处，具有以下优势：(a)构建多层次复合支架。通常用于制备生物支架的基本材料，包括天然高分子材料如蚕丝蛋白、胶原蛋白、壳聚糖等，有机高分子材料聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸等。考虑到机械强度、组织相容性、生物降解性等相关因素，需要将不同材料的优点整合，期待获得优良的复合支架。已被FDA认可的人工合成材料PLA、PGA、PLGA具有不同特点。相对于PLA而言，PGA降解快，体内第四周时质量损失率达到近60％，力学强度也下降迅速。使用不同比例的PLA/PGA(100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)，可以调节细胞支架机械强度与降解速度。(b)分层设计的理念。组织学上关节软骨排列为四层，即表层、中间层、辐射层和钙化层。软骨基质中的胶原纤维大致排列为“拱型结构”，使其具有一定的强度和弹性。而蛋白多糖则可控制基质中的水分渗透，使占总重量80％的水分保存于软骨组织中，使软骨有很高的硬度和耐冲击力。透明软骨组织的基质与细胞并不是均匀分布的。依据其生物学特点，制备的软骨组织采取分层设计。通过层层组装方法获得具有类似“洋葱”结构的多层软骨移植体。(c)不同类别细胞之间的协同作用。多层软骨基质材料中包裹不同比例的软骨细胞、骨髓间充质干细胞(BM)、脂肪干细胞(SVF)。软骨细胞如同种子一样，起着中坚作用，SVF可以分泌II型胶原强化软骨细胞的作用，同时受BM细胞分泌的生长因子刺激而加快增殖速度，而且BM细胞加入提高了细胞粘附率。此外骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞也能够在细胞因子诱导下，具有分化为软骨细胞的趋势。(d)特殊培养条件。多种细胞生长因子、机械压力在内的特殊培养条件,增加了细胞II型胶原蛋白表达，充分模拟了软骨细胞生理状况下的生长条件；(e)令人满意的实验动物结果。贯彻分层设计的理念制备的软骨修复材料，采用不同类别细胞共培养技术，模拟了生理状态下软骨细胞承重的生物学特点。实验动物研究中，利用大鼠模型进行了关节损伤修复的初步探讨，结果显示尽管不同程度的损伤创面，在手术修复后的一年时间里，几乎所有的实验大鼠，其损伤都得到了满意的修复效果。

附图说明

图1为制备的PLGA多孔支架中聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)的比例关系；

支架用聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)作为基质材料，它是由有机高分子聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)，按照一定梯度比例(100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)的聚合反应产物。

图2表示支架材料分层组装示意图；

图3为骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养提高软骨细胞粘附率；

图4为对PLGA细胞支架采取负载加压，进行细胞3D培养。该图表示细胞支架材料在机械压力下的内部构造示意图；

图5为不同培养时间内PLGA支架上的细胞DNA含量；

图6为甲苯胺蓝染色观察软骨细胞；

图7为阿利辛蓝染色观察软骨细胞；

图8为Western blotting技术显示细胞共培养过程中Ⅱ型胶原蛋白表达水平；

注：CH-软骨细胞；SVF-脂肪干细胞；BM-骨髓间充质干细胞；

图9为软骨修复复术改良ICRS组织学评分；

图10为软骨修复术后Ⅱ型胶原蛋白表达水平比较；

图11为软骨修复术后病理组织学观察。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：PLGA多孔支架的制备

1.制备PLGA多孔支架。关节软骨修复材料的支架部分用聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)作为基质材料，它是由有机高分子聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)，按照一定梯度比例(聚乳酸(PLA)：聚羟基乙酸(PGA)＝100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)的聚合反应产物(图1)。

聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)单体化学结构式如下所示：

聚乳酸[poly(lactic acid)，PLA]：

聚羟基乙酸[poly(glycolic acid),PGA]：

聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]：

通过冷冻干燥技术制备PLGA多孔支架，步骤如下：

a)将不同比例(聚乳酸(PLA)：聚羟基乙酸(PGA)＝100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)的PLA/PGA聚合产物—多聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)，依次命名为PLGA1(PLA：PGA＝100:0)、PLGA2(PLA：PGA＝85:15)、PLGA3(PLA：PGA＝75:25)、PLGA4(PLA：PGA＝50:50)、PLGA5(PLA：PGA＝25:75)、PLGA6(PLA：PGA＝15:85)、PLGA7(PLA：PGA＝0:100)，将上述PLGA1-7分别称重，置于合适容器中，分别加入有机溶剂，例如二恶烷(dioxane，别名二氧六环)溶解PLGA，得到含有不同比例的PLA/PGA聚合产物(PLGA1-7)的有机溶液。PLGA1-7与有机溶剂的重量体积分数可根据孔隙率及密度要求调整，PLGA1-7聚合物重量百分比终浓度为1～30％。在温度45℃条件下，低速搅拌固体颗粒PLGA1-7约1.5～2小时，直至完全溶解。

b)将溶解的PLGA1倾倒于锡纸造型的模具中，可以依需要铸成不同形状、高度，置-18～-20℃约2～4小时。

c)在-20～-80℃，真空度10^-1mbar下，干燥17～36小时。

d)释放真空之前，将冷冻干燥容器内的PLGA1干燥物缓慢恢复至室温。

e)释放真空，将溶解的PLGA2倾倒于锡纸造型的模具中，使其位于PLGA1上方，置-18～-20℃约2～4小时；

g)重复上述步骤e)-f)，分别将溶解的PLGA3、PLGA4、PLGA5、PLGA6、PLGA7依次倾倒于模具中，制备得到含有7种不同聚合比例PLA/PGA产物(PLGA)的多层次PLGA多孔支架。PLGA多孔支架材料分层组装示意图如图2所示。

h)从锡纸模具上小心地取下PLGA多孔支架，存放于干燥器中备用。通过扫描电镜直接观察孔隙是否存在，以及孔隙形状、大小，进行孔隙计数，计算平均孔径，结果发现制得的PLGA支架，其内部贯穿范围在50～400μm相互连通的孔隙，益于粘附细胞，而且酯键易于水解具有较好的生物相容性。不同聚合比例PLGA的组合有效改善了PLGA支架的力学性能及其降解速率。

除了通过冷冻干燥技术制备PLGA多孔支架外，也可以通过氯化钠盐颗粒方法制备。在步骤b)PLGA1-7溶解后，加入不同大小的氯化钠盐颗粒，脱盐即可获得不同孔隙率的支架。经过比较后，冷冻干燥技术优于脱盐方法制备的PLGA多孔支架。

2.PLGA多孔支架碱化处理。

该操作在通风柜内完成，最好是带有负压管道装置的II类生物安全柜内进行，以保护样品不受污染。

a)配制浓度为3.0～5.0％w/v氢氧化钠溶液。取适量体积上述氢氧化钠溶液浸泡PLGA多孔支架，氢氧化钠体积要确保整个支架被液体完全覆盖。

b)低速磁力搅拌约1小时。

c)弃掉溶液，用高纯水洗涤PLGA多孔支架，低速磁力搅拌1小时，该步骤重复两次。

d)真空干燥PLGA多孔支架。干燥时间不少于24小时，然后存放PLGA多孔支架在密封容器中，以避免阳光紫外线分解作用。

除了应用氢氧化钠碱化处理PLGA多孔支架外，也可以使用盐酸进行酸化处理，但是细胞生长实验研究表明碱化优于酸化。

3.多聚赖氨酸包被PLGA多孔支架

a)多聚赖氨酸储液制备：一般采用分子量30000的Poly-L-Lysine(L-多聚赖氨酸)完成包被过程，虽然多聚赖氨酸分子量越大，黏附力越强，但完全溶解相对较困难。Poly-L-Lysine用去离子水稀释，制备成浓度为15％w/v的储液。15％L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量15g L-多聚赖氨酸，溶于100ml灭菌去离子水，0.22μm正压滤器过滤分装，-20℃保存。

b)将多聚赖氨酸储液稀释成工作浓度为0.2～5％w/v的L-多聚赖氨酸溶液用于包埋PLGA多孔支架，37℃恒温孵育4小时或常温过夜，4℃冰箱保存。

c)去除L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗PLGA多孔支架，冷冻干燥备用。包被多聚赖氨酸的PLGA多孔支架能够提高细胞在支架上的附着率，促进细胞增殖。细胞接种时孵育超过10分钟可以增加细胞附着率。

4.PLGA多孔支架的蛋白包埋修饰。

a)制备蛋白包被液。配制浓度为4～10％w/v的明胶蛋白溶液，加入Ⅱ型胶原蛋白使其终浓度为0.4～1.0％w/v，制备明胶蛋白—Ⅱ型胶原蛋白包被液。

b)蛋白交联反应。应用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联液，进行明胶蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、多聚赖氨酸、透明质酸、硫酸软骨素的交联反应，对PLGA多孔支架进一步包埋修饰。放置PLGA多孔支架于含30～70mM 2-吗啉乙磺酸的30～50％w/v的乙醇溶液中(pH 4.8～5.2)平衡20-40分钟，接着进行交联反应。交联反应使用含有EDC、NHS、透明质酸、硫酸软骨素以及L-多聚赖氨酸的蛋白包被液进行，其中EDC的质量百分比浓度为0.6％～11％，NHS的质量百分比浓度为0.15％～0.275％，透明质酸的质量百分比浓度为0.1％，硫酸软骨素的质量百分比浓度为5％，L-多聚赖氨酸浓度为2～10mM/L，反应时间为4～6小时。

c)用0.1M的Na₂HPO4溶液清洗PLGA支架0.5小时，重复一次。去离子水反复清洗3次，置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用。

d)京尼平交联反应。PLGA支架浸泡在100ml的含有L-多聚赖氨酸以及京尼平的蛋白包被液中，其中，L-多聚赖氨酸浓度为2～10mM/L、京尼平浓度为5～15mM/L，室温下放置18～30小时。

实施例2：成体细胞原代培养

1.软骨细胞。成体软骨细胞源于非承重部位的关节透明软骨。

a)软骨取材准备。需要准备的物品包括胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、DMEM高糖培养基、PBS缓冲液、吸管、不同容量的培养皿或培养瓶、离心管、滤网、纱布、外科器材如镊子、剪刀等消毒后用品。

b)软骨取材。麻醉后，碘伏消毒，75％酒精脱碘，于非承重部位取关节透明软骨约50～100mg，放入已盛好PBS缓冲液的培养皿中。

c)用含抗生素的冷PBS缓冲液反复吹打清洗3次。第三次洗涤后静置5分钟，弃去上层液体及漂浮组织，将软骨组织移入干净无菌器皿中。

d)用消毒剪刀将软骨剪为1mm³碎块，吸走多余PBS缓冲液，转移软骨碎块至含有0.25％胰蛋白酶的2ml离心管中，在37℃的恒温摇床上，振荡孵育20～40分钟。

e)在离心管中加入2ml含血清培养基，转速1000rpm离心3分钟，弃掉上清液

f)加入3ml浓度为0.15～0.45％Ⅱ型胶原酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化3～6小时，加入生长培养基终止消化。

g)用200目滤网将液体滤入另一离心管，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，弃上清，加入2ml PBS缓冲液，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，再重复清洗一次，用DMEM培养基重新悬浮细胞。

h)对软骨细胞进行台盼蓝染色计数后，转移细胞至25cm²培养瓶，放入37℃培养箱。

i)细胞培养使用含DMEM高糖培养基，添加10％FBS、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml、血小板促生长因子(制备方法见PRP部分)。软骨细胞培养条件为37℃,5％CO₂。培养2天后换液，以后每隔2-3天换1次液，显微镜下观察细胞形态与生长情况。

2.脂肪干细胞。取材于皮下脂肪，分离制备的脂肪干细胞，有时也称为脂肪间充质干细胞或者脂肪多功能干细胞。步骤如下：

a)脂肪取材术前准备。碘伏、酒精、利多卡因注射液、生理盐水、注射器、抽脂器械包等等。

b)麻醉后，碘伏消毒，75％酒精脱碘，取皮下脂肪组织，放入盛好PBS缓冲液的无菌培养器皿中。

c)将脂肪组织用PBS缓冲液清洗三遍后，于15ml离心管中加入终浓度为2mg/ml的Ⅱ型胶原酶，封闭管口，放入37℃水浴中消化3小时。

d)转速1300rpm离心10分钟，吸去上层漂浮物和上清液，取细胞沉淀，此为脂肪间充质多功能干细胞。

e)对细胞进行台盼蓝染色计数后，转移脂肪干细胞至无菌培养瓶。培养瓶中加入含10％FBS的DMEM培养基，细胞培养条件为37℃,5％CO2。显微镜下观察细胞形态与生长情况，隔1～3天换液

f)细胞传代。首先用PBS缓冲液洗涤3次。吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培养箱内消化3分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300r离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，隔日换液。

3.骨髓间充质干细胞

a)术前准备。消毒孔巾、碘伏、酒精、肝素抗凝剂、生理盐水、利多卡因制剂、注射器、骨髓穿刺包等等。

b)麻醉后，暴露穿刺部位，碘伏消毒，75％酒精脱碘，用含有肝素(500～1200U/ml)的穿刺针抽取骨髓。

c)将骨髓缓慢推入培养皿中，以1:1的比例与PBS缓冲液混合，过200目滤网除掉结缔组织。

d)在离心管中，将5ml细胞悬液小心铺于体积为5ml的Percoll(密度1.073kg/L)分离液表面,转速1800rpm/min离心20分钟，取中间黄褐色环状的云雾样细胞，PBS缓冲液冲洗两遍，转速1300r/min离心5分钟，用含10％FBS的DMEM培养基将细胞吹散悬浮，转移至培养瓶中。

e)将沉淀细胞吹打散开后，对细胞进行台盼蓝染色计数。细胞悬液浓度为4～6×10⁵/ml，每个25cm²培养瓶定容体积约3～5ml。间隔24小时后观察细胞贴壁情况，然后倒掉培养基，在培养瓶内加入3～4ml的PBS缓冲液，轻度摇晃去除血细胞等不贴壁细胞。细胞传至第三代时，可得到形态良好的纯净骨髓间充质干细胞。

实施例3：富血小板血浆(PRP)制备及其促生长因子释放

1.使用20ml无菌注射器和含有ACD-A抗凝剂的真空采血管，于室温下(22℃)，抽取血液约18ml，将血液分别放入4个5ml离心管，每管4ml。富血小板血浆液制备要在4～6小时内完成。

2.富血小板血浆液制备。采用二次离心法制备有效浓度的富血小板血浆，该方法制备的血小板血浆中细胞因子PDGF、TGF-β1活性水平增加显著(P<0.01)。

a)每管4ml对称放置于离心机，以200～400g×10min第一次离心，取离心后白膜层以上及其下血浆3mm，置于另一离心管，

b)再以200～400g×10min进行第二次离心，移去上清为贫血小板血浆，剩余约400μl为PRP血浆。

3.使用氯化钙或凝血酶激活血小板(PRP)释放生长因子。PRP制备后10～15min，用5～15％氯化钙(凝血酶>5000U)作为激活剂。激活剂与PRP以1:1(v/v)的比例混合，室温静止l0min，使血小板激活释放生长因子。上述过程也可以把氯化钙与凝血酶结合使用。

4.酶联免疫分析法(ELISA)测定激活前后PRP中各种细胞因子例如PDGF、TGF-β1水平，ELISA检测按照说明书进行。

实施例4：细胞共培养技术

1.软骨细胞与脂肪干细胞共培养。软骨细胞增殖缓慢，因此共培养时采取不同的细胞培养代数。一般情况下，软骨细胞培养至第一或第二代，骨髓间充质干细胞培养至第三或第四代后开始共培养。首先用PBS缓冲液洗涤细胞3次。吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培养箱内消化3～5分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300r离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml的DMEM培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。按照软骨细胞与脂肪干细胞共培养2～4:8～6比例，取不同体积的细胞悬液于离心管中进行混合，细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，培养过程中加入源于血小板(PRP)促生长因子与5～15ng/ml转移生长诱导因子等。隔日换液。

2.软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养。软骨细胞培养至第一或第二代，骨髓间充质干细胞培养至第三或第四代后开始共培养。使用PBS缓冲液洗涤细胞3次。吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培养箱内消化3分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300r离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml的DMEM培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。按照软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养2～4:8～6比例，取不同体积的细胞悬液于离心管中进行混合，细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，培养过程中加入源于血小板(PRP)促生长因子、5～7ug/ml胰岛素、5～7ug/ml转铁蛋白、5～15ng/ml转移生长诱导因子等。隔日换新培养基。

从图3结果可以看出，采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养，可以提高软骨细胞的粘附率。

3.细胞生长至70％覆盖率时，用胰蛋白酶-EDTA消化液处理细胞，转速1300r离心10分钟，弃上清，于离心管中加入1～3ml的DMEM培养基，调整细胞浓度为5×10⁷/ml，用于接种PLGA多孔支架。

实施例5：PLGA多孔支架接种细胞—PLGA细胞支架的制备方法

1.PLGA多孔支架预处理

a)根据软骨损伤创面形状修整PLGA多孔支架，将PLGA多孔支架剪成适宜大小，用75％酒精浸泡消毒、干燥；

b)用DMEM完全培养基润洗PLGA多孔支架；

2.PLGA多孔支架上的细胞接种

a)PLGA多孔支架按照PLA/PGA比例的不同分为外侧区、中间区、内侧区三个区域，即面向关节腔的为外侧区(第1～3层，对应于PLGA1-3)，然后是中间区(第4～5层，对应于PLGA4-5)，接触骨髓腔面的为内侧区(第6～7层，对应于PLGA6-7)。向PLGA多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种共培养的软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射PLGA支架接种共培养的软骨细胞与骨髓间充质干细胞。

b)根据PLGA多孔支架的体积调整接种细胞量。每立方毫米支架细胞植入量为0.8～2×l0⁵个。

c)将接种细胞的PLGA多孔支架置于含8～15％v/v血清的DMEM培养基中，放入37℃、5％CO₂细胞培养箱对PLGA细胞支架施加负载进行加压技术3D培养(图4)。72小时后换第一次培养基，之后每隔48小时更换培养基1次。

在PLGA多孔支架上进行细胞3D培养时，通过增加培养基液面高度，施以静态压力，同时旋转培养容器使冲击压力达到1～2pa/cm²。给PLGA多孔支架施加一定的负载压力，不但增加了Ⅱ型胶原表达水平，而且模拟了生理状态下软骨组织受力之实际情况(例如75公斤体重的个体在直立静止状态下，其每平方厘米关节软骨压力估计值1.5～3.0pa，漫步行走时关节软骨压力会增加10倍，跑步或上楼梯时增加更多)。

3、PLGA支架上细胞DNA含量测定

对不同培养时间内PLGA多孔支架上的细胞DNA含量进行测定，结果如图5所示。

4、软骨细胞的染色观察

a)甲苯胺蓝染色观察软骨细胞。甲苯胺蓝染色法的准备工作，包括配制20％乙醇即10mL无水乙醇加入到40mL去离子水中；配制体积分数1％甲苯胺蓝原液即0.5mL的甲苯胺蓝加到49.5mL的20％乙醇中；配制PBS缓冲液。实验过程首先移去培养基，用PBS缓冲液冲洗2～3次。取适量4％多聚甲醛覆盖所有细胞，固定30分钟后弃掉溶液，PBS缓冲液洗涤细胞2～3次。加入适量体积浓度为1％甲苯胺蓝以覆盖细胞，室温下染色10～30分钟，用无水乙醇洗至无色，显微镜下观察、拍照。结果如图6所示。

b)阿利辛蓝染色观察软骨细胞。阿利新蓝染色法实验过程，包括吸走培养基，用PBS缓冲液冲洗2～3次。取适量4％多聚甲醛覆盖细胞，固定30分钟后弃掉溶液，PBS洗涤2～3次。加入适量阿利新蓝酸化液(试剂盒中的A液)覆盖细胞约3分钟，再加入适量阿利新蓝染色液(试剂盒中的B液)覆盖细胞染色30分钟，流水冲洗。加入核固红染色液(试剂盒中的C液)复染约5分钟，流水冲洗1分钟，显微镜下观察、拍照。结果如图7所示。

5、Ⅱ型胶原表达。

应用Western blotting技术Ⅱ型胶原蛋白表达水平。在含有蛋白酶抑制剂的冷RIPA缓冲液中裂解细胞，转速12000g离心20分钟提取总蛋白，用BCA检测试剂盒测定总蛋白浓度。取20μg细胞裂解蛋白溶液通过8～10％SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移蛋白至Immobilon-P膜(BIO-RAD)。在室温下，蛋白转移膜与TBST盐水缓冲液(含有5％牛血清白蛋白和0.1％Tween-20)杂交1小时后，洗膜三次。加Ⅱ型胶原蛋白抗体于4℃过夜，用TBST洗涤杂交膜4次后，室温下与horseradish peroxidase(HRP)结合的第二抗体(1:3000稀释)孵育1小时。使用强化发光试剂盒(ECL)检测Ⅱ型胶原蛋白/抗体结合的信号强度。结果如图8所示。

实施例6：软骨缺损修复的实验动物研究

为了探索本发明制备的关节软骨修复材料，在关节软骨损伤治疗中的效果，设计了如下软骨缺损修复的动物实验。实验动物为大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.)。首先对动物称重，在全麻状态下抽取骨髓，通过Percoll密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞。在腹部获取脂肪组织，通过酶消化与离心技术，制备脂肪多功能干细胞(SVF)。通过手术方式于膝关节股骨外侧髁处取关节软骨组织，同时制备直径2～3mm的全厚软骨缺损模型。一部分软骨缺损动物经历修复手术归为修复治疗组；另外未经修复治疗的软骨缺损大鼠作为损伤对照组。修复术后12个月实验终止，通过大体观察、修复组织Ⅱ型胶原蛋白表达水平分析及病理切片观测，检验修复结果。此项大鼠实验研究，通过探索软骨缺损修复材料的治疗效果，验证该修复策略的可行性，为后期的临床运用奠定基础。

1.实验方法如下：

按照随机法将大鼠分为损伤对照、修复治疗两组，其中损伤对照组6膝，修复治疗组10膝。损伤对照组动物仅造成单纯软骨缺损；而实验组则实施软骨损伤修复术。于术后8个月，分别从实验组与对照组各取一只动物进行观察、检测及评价；12个月后获取剩余动物标本，评估实验结果。

a)骨髓间充质干细胞获取：大鼠称重、麻醉后，剃毛，置于手术台上，取仰卧位，对穿刺区碘伏消毒，酒精脱碘，铺孔巾。使用骨髓穿刺针旋转刺入，直到有落空感后再取出针芯，使用肝素(500～1000U/ml)或者10％枸橼酸钠预湿的注射器抽取骨髓血，调整穿刺针的位置及深度抽吸适量的髓血，进行骨髓间充质干细胞分离。将抗凝骨髓液注入离心管中，再加入等体积的无菌PBS缓冲液，过200目滤网除掉结缔组织。将滤过后的骨髓-PBS液，缓慢注入到含等体积的Percoll(1.073kg/L)分离液中。注入过程沿离心管壁缓慢进行，保持分离液与骨髓混合液体之间界面的完整，防止因速度过快使骨髓液与分离液混合，影响分离效果。转速1600～2200rpm/min离心18～25分钟，可见液体分层，自上至下分别为血浆、云雾状骨髓间充质干细胞、分离液及红细胞层。取中间黄褐色环状的云雾样细胞，PBS缓冲液冲洗两遍，转速1200～1600rpm/min离心3～8分钟，用培养基将细胞吹散悬浮，转移至培养瓶中。将沉淀细胞吹打散开后，对细胞进行台盼蓝染色计数。细胞悬液浓度为4～6×10⁵/ml，每个25cm²培养瓶定容体积约3～5ml。间隔24小时后观察细胞贴壁情况，然后倒掉培养基，在培养瓶内加入3～4ml的PBS缓冲液，轻度摇晃去除血细胞等不贴壁细胞。细胞传至第三代时，可得到形态良好的纯净骨髓间充质干细胞。

b)脂肪干细胞获取：于腹部取材脂肪组织后，放入盛好PBS缓冲液的无菌培养器皿中。用PBS缓冲液将脂肪组织清洗三遍后，于15ml离心管中加入终浓度为2mg/ml的Ⅱ型胶原酶，封闭管口，放入37℃水浴中消化3小时。转速1300rpm离心10分钟，吸去上层漂浮物和上清液，取细胞沉淀。用培养液散开沉淀细胞，对细胞进行台盼蓝染色计数，转移脂肪干细胞至无菌培养瓶。培养瓶中加入含10％FBS的DMEM培养基，细胞培养条件为37℃,5％CO₂。显微镜下观察细胞形态与生长情况，隔1～3天换液。细胞传代前，先用PBS缓冲液洗涤3次，吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培养箱内消化3分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300rpm/min离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，隔日换液。

c)软骨细胞获取及软骨损伤模型制备步骤：取膝关节外侧髌旁入路，纵行切开皮肤长约0.6～1.0cm，逐层切开皮下组织，将髌骨推向内侧使其脱位，显露股骨外侧髁关节软骨，用套筒取材软骨组织，同时制备直径2～3.0mm的全厚软骨缺损模型。软骨缺损深度与关节软骨层厚度一致，确保无髓血渗出，修整缺损底部及边缘。复位髌骨后，生理盐水冲洗创面及关节腔，逐层缝合皮下及皮肤，创面敷红霉素软膏。术后即刻施用止痛剂及青霉素钾肌注预防感染。术后膝关节不固定，每日术区敷红霉素软膏，肌注抗生素1次，连续3天。常规饮食饲养，每日观察动物基本情况、伤口愈合情况及行走步态等。软骨取材后，放入已盛好PBS缓冲液的培养皿中。用含抗生素的冷PBS缓冲液反复吹打清洗3次。第三次洗涤后静置5分钟，弃去上层液体及漂浮组织，将软骨组织移入干净无菌器皿中。用消毒剪刀将软骨剪为1mm³碎块，吸走多余PBS缓冲液，转移软骨碎块至含有0.25％胰蛋白酶的2ml离心管中，在37℃的恒温摇床上，振荡孵育20～40分钟。在离心管中加入2ml含血清培养基，转速1000rpm离心3分钟，弃掉上清液，加入3ml浓度为0.15～0.45％Ⅱ型胶原酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化3～6小时，加入生长培养基终止消化。用200目滤网将液体滤入另一离心管，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，弃上清，加入2ml PBS缓冲液，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，再重复清洗一次，用DMEM培养基重新悬浮细胞。对软骨细胞进行台盼蓝染色计数后，转移细胞至25cm²培养瓶，放入37℃培养箱。细胞培养使用含DMEM高糖培养基，添加10％FBS、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml、血小板促生长因子(制备方法见实施例3)。软骨细胞培养条件为37℃,5％CO₂。培养2天后换液，以后每隔2-3天换1次液，显微镜下观察细胞形态与生长情况。此后，软骨细胞共培养与支架接种请分别参照实施例1、实施例3-5。

d)软骨损伤修复术：PLGA细胞支架制备后，需要手术修复损伤软骨。按照常规程序进行麻醉、消毒、皮肤切开、暴露创面等系列操作。利用眼科剪与手术刀进行关节软骨损伤创面清理与修整，用生理盐水冲洗造模区清除组织碎削。用针头刺破造模创面的钙化软骨层，直至骨髓血渗出，将适宜形状的PLGA细胞支架置于损伤处，用生物胶固定。复位髌骨后，用可吸收线逐层缝合皮下及皮肤组织，创面敷红霉素软膏。术后即刻施用止痛剂及青霉素钾肌注预防感染。术后膝关节不固定，每日术区敷红霉素软膏，肌注抗生素1次，连续3天。常规饮食饲养，每日观察动物基本情况及行走步态，特别是观察伤口是否干燥，有无异常渗液等伤口愈合情况。本研究于术后8个月，分别从实验组与对照组各取一只动物进行疗效评估，术后12个月终止观察，获取各组动物标本进行实验结果的检测及评价。修复手术过程中，一只大鼠由于初始麻醉剂量不足，二次补注麻醉剂后导致死亡。其它动物术后7～10天左右切口愈合良好，没有出现术后感染及关节脱位等并发症。共13只大鼠完成了全部的手术及术后观察评估，

2.软骨损伤修复实验结果评估

a)动物的一般状况。观察术后大鼠关节切口对和是否良好，皮肤是否干燥，有无异常渗出等等。术后2天观察到关节及其周围软组织肿胀，触痛明显，膝关节活动减少，力量较弱。手术7～10天后各组切口愈合良好，周围软组织肿胀已消退，缝线已自行脱落或拆除，未发现感染，膝关节活动正常。

b)大体标本观察

损伤对照组：表面光泽度差，颜色呈暗灰色。虽然损伤周边有软骨修复迹象，表面仍有较大面积的缺损，触摸软骨面不平整、不光滑，可见损伤周围组织增生。

修复治疗组:关节面缺损部分已经被新生组织取代，光泽度正常，颜色与正常软骨无明显差异。触摸关节表面光滑平整，未见周围软组织充血或增生现象。

c)采用改良ICRS组织学评分，对软骨缺损修复效果进行评价分析。该评分系统综合多项指标，涵盖了大体标本观察如修复组织颜色、新生组织与邻近软骨整合、缺损修复程度，以及修复组织力学强度等方面进行估值分析，结果如图9所示。损伤对照组及修复治疗组在术后12个月改良ICRS组织学评分分别为：损伤对照组12.7±1.57(n＝5)；修复治疗组18.8±1.02(n＝8,p<0.01)。结果表明PLGA细胞支架修复软骨损伤效果显著优于损伤对照组。

d)Ⅱ型胶原蛋白表达水平分析。软骨缺损后，即使不使用修补材料，也会刺激组织增生填补缺损部位，但是上述增生是否是真正意义上的软骨自身修复，可以用Ⅱ型胶原蛋白在组织中的表达水平予以验证。软骨缺损进行PLGA细胞支架修复治疗一年后，检测修复组织中的Ⅱ型胶原蛋白表达水平，并使用正常关节软骨Ⅱ型胶原蛋白量作为参照，进行比值比较，计算相对含量(图10)。

e)病理切片观测

取材及制作标本：观察大体标本情况后，收集关节组织，进行病理学检查。将标本置于10％的中性福尔马林液中固定，遂放置于酸性脱钙液中浸泡4～5天进行脱钙，完成脱钙处理后，烘干、脱水，截取标本观察部位进行石蜡包埋，组织切片，苏木精伊红(HE)染色。

光镜观察结果如图11所示：

损伤对照组:表层分离、组织缺失、有较多失染。缺损区域由大量无细胞的红染成分填充，粗糙不平，可以见到少量形态各异的细胞分布其间，软骨下骨质及骨小梁断裂，潮线消失或者模糊不清难分辨，属关节炎的中晚期表现。

修复治疗组:镜下观察苏木精伊红染色均匀，未见失染现象。表层较为平整，软骨细胞梭形排列，表层厚度基本正常，中间层有散在分布的圆形细胞组成，偶见细胞聚集排布不均匀，柱状层与钙化层分化良好，未见骨质破坏及骨小梁断裂，潮线分布清晰，无炎细胞浸润或炎性增生现象。

上述结果表明，PLGA细胞支架对大鼠软骨缺损具有良好的修复效果。软骨缺损区域被新生软骨样修复组织填充，新生修复组织表面平整，与邻近正常软骨整合良好。PLGA细胞支架中接种细胞分裂，具有自我更新能力，细胞形态与正常软骨细胞相似，多功能间充质干细胞成软骨分化。修复组织内Ⅱ型胶原含量明显高于损伤对照组，其ICRS组织学评分也明显优于损伤对照组，具备临床转化潜能。

Claims

1.一种用于关节软骨修复的PLGA细胞支架，其特征在于，所述的PLGA细胞支架包括PLGA多孔支架以及种植于该PLGA多孔支架中的软骨细胞、骨髓间充质干细胞以及脂肪干细胞；

2.如权利要求1所述的PLGA细胞支架，其特征在于，所述的PLGA多孔支架表面采用多聚赖氨酸、明胶蛋白以及Ⅱ型胶原蛋白进行修饰。

3.如权利要求1所述的PLGA细胞支架，其特征在于，所述的PLGA多孔支架是通过冷冻干燥方法或氯化钠盐颗粒方法制备。

4.如权利要求3所述的PLGA细胞支架，其特征在于，所述的PLGA多孔支架是通过以下方法制备得到：

PLGA多孔支架的制备：

c)在-20～-80℃，真空度10^-1mbar下，干燥17～36小时；

PLGA多孔支架的碱化处理：

a)配制浓度为3.0～5.0％w/v氢氧化钠溶液，取适量体积上述氢氧化钠溶液浸泡得到的PLGA多孔支架，氢氧化钠体积要确保整个支架被液体完全覆盖；

b)低速磁力搅拌约1小时；

多聚赖氨酸包被PLGA多孔支架：

PLGA多孔支架的蛋白包埋修饰：

b)蛋白交联反应：放置PLGA多孔支架于含30～70mM2-吗啉乙磺酸的30～50％w/v的乙醇溶液中(pH4.8～5.2)平衡20-40分钟，接着进行交联反应，交联反应使用含有EDC、NHS、透明质酸、硫酸软骨素以及L-多聚赖氨酸的蛋白包被液进行，其中EDC的质量百分比浓度为0.6％～11％，NHS的质量百分比浓度为0.15％～0.275％，透明质酸的质量百分比浓度为0.1％，硫酸软骨素的质量百分比浓度为5％，L-多聚赖氨酸浓度为2～10mM/L，反应时间为4～6小时；

c)用0.1M的Na₂HPO4溶液清洗PLGA多孔支架0.5小时，重复一次。去离子水反复清洗3次，置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用；

5.如权利要求1所述的PLGA细胞支架，其特征在于，步骤a)中所述的有机溶液是二恶烷。

6.如权利要求1所述的PLGA细胞支架，其特征在于，采用软骨细胞与脂肪干细胞共培养、软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养的方式获得软骨细胞、脂肪干细胞以及骨髓间充质干细胞。

7.如权利要求1所述的PLGA细胞支架，其特征在于，PLGA细胞支架通过以下方法制备得到：

PLGA多孔支架预处理：

b)用DMEM完全培养基润洗PLGA多孔支架；

PLGA多孔支架上的细胞接种：

8.如权利要求7所述的PLGA细胞支架，其特征在于，对PLGA细胞支架施加负载进行细胞的3D培养，在PLGA多孔支架上进行细胞3D培养时，通过增加培养基液面高度，施以静态压力，同时旋转培养容器使冲击压力达到1～2pa/cm²。给PLGA多孔支架施加一定的负载压力，不但增加了Ⅱ型胶原表达水平，而且模拟了生理状态下软骨组织受力的实际情况。

9.权利要求1-8任一项所述的PLGA细胞支架在制备关节软骨修复材料中的应用。