CN111110912B - 具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法 - Google Patents

具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111110912B
CN111110912B CN202010124022.4A CN202010124022A CN111110912B CN 111110912 B CN111110912 B CN 111110912B CN 202010124022 A CN202010124022 A CN 202010124022A CN 111110912 B CN111110912 B CN 111110912B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silk fibroin
solution
scaffold
functional
fibroin scaffold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010124022.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111110912A (zh
Inventor
顾宁
刘鑫
杨芳
陈博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN202010124022.4A priority Critical patent/CN111110912B/zh
Publication of CN111110912A publication Critical patent/CN111110912A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111110912B publication Critical patent/CN111110912B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/025—Other specific inorganic materials not covered by A61L27/04 - A61L27/12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials

Abstract

本发明公开了一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法，包括如下步骤：⑴先将天然蚕丝进行脱胶化处理、溶解、透析获得丝素蛋白溶液；⑵将浓缩纯化后的丝素蛋白溶液注入特定的模具中，通过冷冻干燥获得成型的支架；⑶将成型支架浸泡在氧化铁纳米颗粒溶液中浸泡，获得功能性组分；⑷将载有氧化铁纳米颗粒的支架内外层包覆一层DPPC膜；⑸将步骤⑷所得的支架外层涂覆PVA膜，即可获得良好稳定性的功能性支架。该方法制备的支架具有良好的细胞相容性和温控的降解性，且具有显著的细胞响应迁移效应，可以促进多种组织的修复，在组织工程修复领域具有巨大的应用潜能。

Description

具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及其制备方法，属于血管组织工程支架制备和细胞作用领域。
背景技术
动脉血管断裂损伤是临床极为常见的疾病之一。动脉血管断裂损伤不仅会导致严重的供血不足，引起包括失血性休克、血肿、创伤性疼痛以及血管参与的其它组织修复细胞信号分子通路的阻断，还会给患者带来严重的精神和生活负担。目前，临床上以自体血管移植作为一线治疗手段，但自体移植的血管来源有限且易产生严重的二次创伤。为了克服上述缺陷，组织工程血管支架是目前有效的替代方法，临床实践已表明可以有效的治疗动脉血管损伤。丝素蛋白是一种被FDA批准的可医用的天然生物材料，因其具有良好的生物相容性、低免疫排斥和生物降解性被广泛应用于人体组织修复，近年来，在血管修复中也展现了巨大的应用价值。目前丝素蛋白的应用也存在一定的瓶颈：一般动脉血管的修复周期是3-6个月，而丝素蛋白支架在人体模拟酶的作用下一个月就会降解70％左右，在血管的动态生长过程中无法维持支架的完整性而大大降低修复的效果。因此在丝素蛋白支架中需要进行适当的疏水化和功能化处理，对重塑血管完整性，提高修复效果，降低修复周期至关重要，这也是目前血管工程领域研究的热点。
氧化铁纳米药物(Ferumoxytol，FMT)已被批准用于治疗慢性肾病(CKD)成人患者的缺铁性贫血，同时也作为磁共振造影剂开展临床实验。而且由于其良好的磁效应，在引导细胞示踪、远程刺激、磁热疗等磁生物效应中发挥着越来越多的应用。本课题组制备的氧化铁纳米药物(CN106830096A,2017-06-13)颗粒分散均匀、晶体性能高，且具有良好的生物安全性和多种生物效应：例如，可通过调控在ZEB2中非编码RNA促进骨髓间充质干细胞成骨分化(Wang et al.Nano research,2017,10(2):626–642)；构建磁性纳米脂质体用于肿瘤的多模态成像与治疗一体化，表现出明显的抗癌效果(Liu et al.ACS nano,2017,11(2):1509-1519)；将氧化铁纳米颗粒负载于支架中磁化后，通过调控巨噬细胞表型的变化增强骨再生等。还有许多新的生物效应在不断发现与报道出来。
二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)是一种药用高分子，是带有两个长链的两亲分子,是脂类生物膜的主要成分,磷脂与水形成的分子有序组合体(如脂质体等)常被作为运载药物的载体，还可被用来模拟生物膜及在血管栓塞微球中应用。DPPC具有相变特性，相变温度41℃左右，相变温度以下材料呈现固体状态，相变温度以上则呈现流动的液体状态。因此DPPC的应用能够赋予支架一个温控开关，在相变温度以下形成固体薄膜，在升温并发挥功能后到相变温度以上则形成流动液态而除去。
医用级聚乙烯醇(PVA)，因其具有良好的生物相容性，对人体无毒，无副作用，尤其在医疗中的如其水性凝胶在眼科、伤口敷料和人工关节方面的有着广泛应用，可作为造血干细胞培养液。同时聚乙烯醇薄膜在药用膜，人工肾膜等方面也有使用。聚乙烯醇具有两亲性，可以在高温下形成透明的固体薄膜，其疏水端可以有效地降低水溶性物质例如酶溶液、水溶性有毒试剂等的浸润，从而避免薄膜内物质的破坏。
本发明旨在通过将氧化铁纳米颗粒负载在丝素蛋白支架中，形成功能性的支架，使其具备新的生物效应，应用于动脉血管组织修复。前期的研究表明负载氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架对巨噬细胞具有响应迁移效应，众所周知巨噬细胞的迁移对于促进血管的修复至关重要。巨噬细胞的迁移过程可以分泌包括MCP-1、VEGF、bFGF、TGF-β、IL-10等多种促血管生长因子，这些因子的分泌可以动态参与血管的修复。进一步将DPPC包覆在支架表面，避免细胞从孔隙中渗出，能够更好的进行原位修复；参与血管修复的种子细胞如平滑肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等前期会在薄膜表面堆积形成细胞薄膜，这时利用氧化铁纳米颗粒的磁热效应升温至薄膜相变温度以上，DPPC变为流动的液体排出，支架的三维多孔微环境打开，为细胞的增殖提供粘附位点加速增殖，从来加快血管的修复。PVA的引入，使其亲水端可以有效与裸露在外面DPPC亲水端结合，疏水端可以暴露在支架外面有效的降低水解酶的浸润，从而减缓支架的降解，同时可以有效地防止支架管内的血液渗出引起血肿，这些在血管修复中至关重要。因此由丝素蛋白，氧化铁纳米颗粒，DPPC和PVA复合而成的功能性支架用于动脉血管断裂损伤修复具有重大的应用前景。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种具有细胞响应迁移效应的功能性支架及其制备方法，是针对现有丝素蛋白支架在修复动脉血管断裂损伤中降解速度快，而无法维持修复周期中支架完整性及原位修复效果不佳而开发，以促进病变和缺损的动脉血管组织的原位再生和功能恢复。
技术方案：本发明的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架组分主要是基本组分丝素蛋白、功能性组分氧化铁纳米颗粒、相变材料二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC和两亲性材料聚乙烯醇PVA；所述的四种材料的质量比为2-3：500-800：10-20：5-20。
本发明的具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法包括以下步骤：
步骤1.丝素蛋白溶液的制备：将天然蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸进行脱丝胶处理数次，即可获得蚕丝纤维，拉松、置于通风橱晾干、待用；然后将蚕丝纤维用无水氯化钙、无水乙醇和超纯水混合的三元溶液溶解后进行透析处理，透析完放入洁净的通风橱浓缩至适用浓度后，离心，滤膜过滤，得到纯化后的丝素蛋白溶液，2-5℃待用；
步骤2.支架的制备：将步骤1所得的丝素蛋白溶液注入特定的导管模具当中，放置于-20到-40℃冰箱预冷冻过夜，然后将其模具内芯去除放置于冷冻干燥机中进行冻干，取出后放入无水乙醇中交联，得到丝素蛋白支架晾干待用；
步骤3.纳米颗粒载入：将步骤2所得到的丝素蛋白支架放入氧化铁纳米颗粒溶液中浸泡，直至丝素蛋白支架被溶液均匀浸润，然后将浸润后的丝素蛋白支架放入冷冻干燥机中再次冷冻干燥，得到载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架；
步骤4.膜包覆：先将磷脂膜溶于溶剂中得到磷脂膜溶液，然后将步骤3所得的具有功能组分的丝素蛋白支架放入相变磷脂膜溶液中，然后放入通风橱中干燥，即可得到内外包覆有磷脂膜的丝素蛋白支架；
步骤5.膜再次包覆：将PVA溶液涂敷在步骤4所得的内外包覆有磷脂膜的丝素蛋白支架外表面，然后放入烘箱中进行干燥即可得到具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架。
其中，
步骤1所述的碳酸钠溶液浓度为0.5±0.01wt％，所述的脱丝胶处理次数≥3次。
步骤1所述的三元溶液是无水氯化钙、无水乙醇和超纯水的摩尔比为1:2:8，所述的透析分子量为12000-14000Da，所述的浓缩浓度为5-10％(g/ml)，所述的离心速率是1200-1500rpm,所述的滤膜是50-100μm。
步骤2所述的模具包括套管、内芯和封盖三部分结构，套管采用的是聚乙烯吸管，直径4-6mm，内芯是直径2-3mm纤维增强塑料棒，封盖采用不锈钢设计，一端密闭一端不密闭，直径大小和套管直径吻合，所述的预冷冻时间为12-24h，所述的无水乙醇交联时间为14-24h。
步骤3所述的氧化铁纳米颗粒溶液的浓度20-80％(g/mL)；所述的氧化铁纳米颗粒是一种聚葡萄糖山梨醇羧甲醚PSC包裹的γ-Fe2O3,粒径为19-31nm，平均分子量为600-750KDa；所述的支架在氧化铁纳米颗粒的浸泡时间为24-48h。
步骤4所述的磷脂膜材料DPPC溶液浓度为1-3mg/mL；所述的DPPC相变温度为41-43℃；所述的溶剂为氯仿、甲醇中的氯仿或混合液。
步骤5所述的PVA溶液的浓度为3-8％(g/mL)，所述的烘箱温度为37-60℃；所述的时间为30-180min；所述的细胞是巨噬细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞中的一种及以上。
所述的滤膜材料选自尼龙、聚四氟乙烯、聚醚砜、混合纤维素酯、聚偏氟乙烯中的一种。
本发明的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架应用于血管损伤修复。
有益效果：与现有的支架相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明制备的功能性丝素蛋白支架与普通的纯丝素蛋白支架相比，降解缓慢可控，可以有效的维持动脉血管断裂损伤修复过程中支架的完整性。
2、本发明制备的功能性丝素蛋白支架具有响应巨噬细胞迁移效应，促进巨噬细胞分泌大量促血管生长因子参与加快血管修复。
3、本发明制备的功能性丝素蛋白支架可以有效的防止血管修复过程中血液渗出引起血肿等严重性副作用。
4、本发明制备的功能性丝素蛋白支架具有一个温度可控的开关，可以调控功能组分的渗漏速率。
附图说明
图1为功能支架制备及对细胞的响应迁移效应示意图，
图2为本发明实施例3制备的功能性丝素蛋白支架与巨噬细胞划痕实验光镜图，
图3为本发明实施例4制备的功能性丝素蛋白支架与巨噬细胞共培养观察巨噬细胞响应迁移效应的免疫荧光图，
图4为本发明实施例5制备的功能性丝素蛋白支架与巨噬细胞共培养观察迁移过程中促血管生长因子表达量变化ELISA结果图。
具体实施方式
本发明提供的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，该方法包括以下步骤：
⑴丝素蛋白溶液的制备：将天然蚕丝置于碳酸钠溶液中进行脱丝胶处理获得蚕丝纤维，然后将蚕丝纤维晾干后溶解于三元溶液中进行透析、浓缩、离心、过滤，即可获得丝素蛋白溶液；
⑵支架制备：将步骤⑴所得的溶液注入特定的导管模具当中，放置于-20℃冰箱预冷冻过夜，然后将其模具内芯去除放置于冷冻干燥机中进行冻干，取出后放入无水乙醇中交联，然后晾干待用；
⑶纳米颗粒载入：将步骤⑵所得的支架放入氧化铁纳米颗粒溶液中浸泡，直至丝素蛋白支架被溶液均匀浸润，然后将浸润后的支架放入冷冻干燥机中再次冷冻干燥，得到载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架。
⑷膜包覆：先将DPPC粉末溶于溶剂中得到DPPC溶液，然后将步骤⑶所得的具有功能组分的支架放入相变脂质材料DPPC溶液中，然后放入通风橱中干燥，即可得到内外包覆有DPPC膜的支架。
⑸膜再次包覆：将PVA溶液涂敷在步骤⑷所得的支架外表面，然后放入烘箱中进行干燥一段时间即可得到具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架。
其中步骤⑴所述的天然蚕丝是桑蚕丝；所述的碳酸钠溶液的浓度为0.5±0.01％(g/mL)，脱胶温度为沸腾温度，脱胶次数为3-4次；所述的三元溶液分别是无水氯化钙、无水乙醇和超纯水，三者的摩尔比为1:2:8，溶解温度70-75℃，溶解时间为当溶液全部溶解后继续在此温度下加热搅拌30-40min，丝素蛋白与溶液体积比1:4-6；所述的透析采用12000-1400Da截留分子量的透析袋，透析溶液是ddH20,透析时间为3-4天，每天更换ddH20 3-5次；所述的浓缩浓度为5-10％(g/mL)；所述的离心速度为1200-1500rpm；所述的过滤采用50-100μm尼龙过滤网。
其中步骤⑵所述的导管模具主要包括套管、内芯和封盖三部分结构，套管采用的是聚乙烯吸管，直径4-6mm，可以有效地防止丝素蛋白溶液的粘附，内芯是直径2-3mm纤维棒FRP，封盖采用不锈钢设计，一端密闭一端不密闭，直径大小和套管直径大下吻合，模具整体形状和大小可按照需求设计；所述的冻干时间约为40-50h；所述的无水乙醇交联时间为14-24h。
其中步骤⑶所述的氧化铁纳米颗粒是本课题组制备的PSC包裹的γ-Fe2O3纳米颗粒(CN106830096A,2017-06-13)，粒径为19-31nm，平均分子量为750KDa；所述的氧化铁纳米颗粒浓度为20-80wt％；所述的氧化铁纳米颗粒浸泡时间为24-48h；所述的再次冷冻干燥时间为18-24h；所述的载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架存储于干燥的环境中。
其中步骤⑷所述的膜包覆负载氧化铁纳米颗粒丝素蛋白支架具体步骤为：将DPPC粉末溶于氯仿溶液中或者溶于氯仿与甲醇体积比为3：1混合液中得到浓度为1-3mg/mL的DPPC溶液，然后将载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架浸泡于所述的DPPC溶液中1-2h，最后将支架从DPPC溶液中取出置于通风橱晾干，即可得到包有DPPC膜的支架；所述的DPPC相变温度为41-43℃。
其中步骤⑸所述的膜再次包覆具体步骤为：将PVA粉末与超纯水按照质量体积比3-8:100(g/mL)比例制备PVA溶液，然后将PVA溶液用涂覆在步骤⑷所述的支架上，然后去除多余的PVA溶液，将涂覆有PVA溶液的支架放入所述37-60℃烘箱中30-180min，即可获得具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架；所述的细胞是巨噬细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞中的一种以上。
为了加深对发明的理解，下面结合实施例对本发明做进一步详述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1丝素蛋白支架的制备
步骤1：脱丝胶
称取天然桑蚕丝40-50g到洁净的容器中，然后称取无水碳酸钠固体10.18g充分溶解到2000ml的超纯水中，待其完全溶解后倒入不锈钢容器中，然后将称量好的天然桑蚕丝浸没其中，将容器放于电磁炉上进行加热直至煮沸，从煮沸时开始计时，约0.5h后取出，为了使丝胶充分溶解，脱胶期间需使用玻璃棒反复搅拌，然后将煮好的桑蚕丝用超纯水洗涤3-5次，此时丝胶被脱掉，蚕丝纤维裸露。为了使丝胶完全被脱掉，需要重复上述步骤2-3次，最后将煮好的蚕丝纤维用超纯水洗涤数次，直至PH计检测呈中性，然后拧干，置于通风橱内晾干，待用。
步骤2：丝素蛋白溶液的制备
称取实施例1中获得的蚕丝纤维20g放置于洁净的保鲜袋中待用，准备一个250ml的烧杯，然后称取无水氯化钙37g放于烧杯中，加入超纯水48ml，无水乙醇40ml使其充分溶解，将溶解后的溶液放入磁力搅拌器中搅拌均匀，烧杯上面覆盖一层保鲜膜以防止乙醇挥发，加热温度维持在72℃，在搅拌条件下将20g蚕丝纤维分多次加入，加完后继续搅拌20-30min使丝素蛋白充分溶解，然后取出室温下放凉，最后放入透析袋(截留分子量：12000-14000Da)透析3天，每天更换透析液(超纯水)3-4次。最后取出放入通风橱浓缩至8％，放置4℃冰箱保存、待用。
步骤3：丝素蛋白导管支架的制备
将1.5ml的步骤2制备的丝素蛋白溶液注入外径6mm，内径3mm，长度8cm的模具中，然后将其放置15ml的离心管中置于试管架中于-20℃冰箱预冷冻过夜，然后将冻干机冷冻打开降温直至层板温度达到-40℃，然后将丝素蛋白冷冻液取出以最快的速度去除模具的封盖和内芯且丝素蛋白不呈现流动相，然后将其放到预冷冻温度-40℃的层板上维持时间60-180min，然后关闭制冷，打开预先设定好的自动冻干程序，运行结束48-60h后取出样品，然后放入无水乙醇交联24h，晾干即可。
实施例2具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备
步骤1：将氧化铁纳米颗粒按25:1(mg/ml)的比例放入超纯水中，于旋转震荡仪中震荡15-30min使氧化铁纳米颗粒充分溶解，然后将配置好的溶液用超纯水进一步稀释，稀释比例按照1:9(ml/ml)，即可得到所需的氧化铁纳米颗粒溶液。然后将实施例1制备的丝素蛋白导管浸没于上述配置好的氧化铁纳米颗粒溶液中24h，然后取出于冷冻干燥机中进行冷冻干燥24h，即可获得负载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架，氧化铁纳米颗粒也是支架的功能组分。
步骤2：将DPPC粉末按2:1(mg/ml)的比例溶于浓度为99％的氯仿溶液中使其充分溶解，然后将步骤1负载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架浸泡于DPPC溶液中1h，取出后放于保鲜袋上置于通风橱中，待氯仿完全挥发后，即可获得包覆有DPPC膜的支架。
步骤3：将PVA粉末按1:20(g/ml)的比例溶于超纯水中，于96-100℃充分溶解即可获得浓度为5％的PVA溶液，然后将PVA溶液涂覆于步骤2所获得支架的外表面，使用滤纸吸掉多余的溶液，然后置于37℃烘箱中180min，即可获得具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架。
实施例3功能性丝素蛋白支架与巨噬细胞划痕实验进行响应迁移效应观察
将实施例2制备的功能性丝素蛋白支架裁剪成长度10mm，两端平整的结构，然后使用环氧乙烷进行性密封灭菌处理，待用，无丝素蛋白支架作为空白对照，无功能组分的纯丝素蛋白支架作实验对照。细胞选用小鼠来源巨噬细胞Raw264.7。首先，向60mm×150mm细胞培养皿中接种5×105个细胞/皿，然后加入3ml完全培养基(45ml DMEM+5ml FBS+500ΜlPS)，置于37℃5％CO2培养箱孵育，待细胞密度为100％时将细胞培养皿从培养箱取出于超净工作台，使用细胞刮刀刮出一个直径为10mm的无细胞圆的区域，然后将上述裁剪好的功能型支架垂直放置于这个区域，支架不漂浮，此时采用无FBS培养基进行培养，用以观察细胞的迁移效应。设置观察的时间为0h、6h、18h、24h、48h，分别在设置的时间点进行拍照，每次拍完照用PBS洗涤3次冲洗非贴壁细胞，然后重新放入无FBS培养基进行培养。结果如图2所示，结果表明功能支架组与空白对照组和丝素蛋白支架组在前三个时间点未表现出明显的差异，但是在24h和48h的时候，功能支架组细胞迁移数量显著超越空白对照组和丝素蛋白组，且随之时间的增长，这种差异表现的更加明显，这表明功能性丝素蛋白支架具有对巨噬细胞响应迁移效应。
实施例4功能性丝素蛋白支架与巨噬细胞共培养进行响应迁移效应的观察
将实施例2制备的功能性丝素蛋白支架裁剪成长度10mm，两端平整的结构，然后使用环氧乙烷进行性密封灭菌处理，待用，设置两组(一组37℃，另一组43℃)，无功能组分的纯丝素蛋白支架作对照。细胞选用小鼠来源的巨噬细胞Raw264.7，细胞培养采用12孔板，细胞接种数量是2.5×104个/孔/次，然后将上述裁剪好的支架放入孔中，支架自由漂浮，然后加入2ml完全培养基(45ml 1640+5ml FBS+500μL PS)，置于37℃5％CO2培养箱孵育，每隔12h在按相同的要求再次加入上述数量的细胞，一共加入到第五次后停止，其中43℃功能支架组再加入第三次细胞后将培养板放入43℃培养箱20min(目的是将相变材料DPPC膜变为流动相)后在再转移至37℃培养条件下，待细胞铺满孔底将其从培养箱取出，采用4％的多聚甲醛固定留作免疫荧光染色。首先将4％的多聚甲醛移除，然后用0.01M PBS洗涤3次，每次10min，然后加封闭液(100μL 0.3％TritonX-100+3g BSA+10μL正常羊血清,加0.01M PBS定容至100ml)封闭1h，倾去封闭液不洗，加一抗CD14(Proteintech公司采购，RabbitPolyclonal antibody，使用时1:200配制用)4℃24h，然后倾去液体，用0.01M PBS洗涤3次，每次10min，然后加FITC标记的荧光二抗(Proteintech公司采购，Goat Anti-Rabbit IgG,使用时1:50配制用)4℃避光过夜。然后倾去液体，用0.01M PBS避光洗涤3次，每次10min，最后用抗荧光淬灭封片液封片，荧光体式显微镜下拍照。如图3所示，功能支架组(37℃和43℃)细胞密度明显高于无功能组分的纯丝素蛋白支架组，而两组功能支架组截面细胞分布显示，37℃时，相变材料呈现膜结构，阻碍了细胞进入支架内部，细胞会在膜表面堆积形成连续的绿色荧光分布，而43℃时候相变材料由固体膜结构变为流动相，支架表面多孔结构暴露，细胞开始迁移至支架内部，呈现密集的绿色荧光点状分布，这表明功能支架具有明显的巨噬细胞响应迁移效应，并通过相变材料DPPC实现细胞分布的温控调控。
实施例5功能性丝素蛋白支架与巨噬细胞共培养观察迁移过程中促血管生长因子表达量的变化将实施例2制备的功能性丝素蛋白支架裁剪成长度10mm，两端平整的结构，然后使用环氧乙烷进行性密封灭菌处理，待用，无丝素蛋白支架作为空白对照，无功能组分的纯丝素蛋白支架作实验对照。细胞选用小鼠来源巨噬细胞Raw264.7。首先，向60mm×150mm细胞培养皿中接种5×105个细胞/皿，然后加入3ml完全培养基(45ml DMEM+5ml FBS+500μLPS)，置于37℃5％CO2培养箱孵育，待细胞密度为100％时将细胞培养皿从培养箱取出于超净工作台，使用细胞刮刀刮出一个直径为10mm的无细胞圆的区域，然后将上述裁剪好的功能型支架垂直放置于这个区域，支架不漂浮，此时采用无FBS培养基进行培养，用以观察巨噬细胞的迁移效应引起促血管生长因子表达量的变化。细胞培养48h后从培养箱取出，收集培养基，离心，收集上清，待用。采用ELISA实验(酶免生物采购，使用时依据说明书要求操作)检测MCP-1、TGF-β、bFGF、IL-10、PDGF、VEGF表达量的变化。如图4所示，功能支架组6种因子的表达量相比对照组和无功能组分的纯丝素蛋白支架组明显升高，与迁移相关的MCP-1因子表达上调最为明显，这表明支架促进巨噬细胞迁移可以引起促血生长因子表达量的上调，这对于加速血管修复具有重要的意义。

Claims (10)

1.一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1.丝素蛋白溶液的制备：将天然蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸进行脱丝胶处理数次，即可获得蚕丝纤维，拉松、置于通风橱晾干、待用；然后将蚕丝纤维用无水氯化钙、无水乙醇和超纯水混合的三元溶液溶解后进行透析处理，透析完放入洁净的通风橱浓缩至适用浓度8%后，离心，滤膜过滤，得到纯化后的丝素蛋白溶液，2-5℃待用；
步骤2.支架的制备：将步骤1所得的丝素蛋白溶液注入特定的外径6mm，内径3mm，长度8cm导管模具当中，放置于-20到-40℃冰箱预冷冻过夜，然后将其模具内芯去除放置于冷冻干燥机中进行冻干，取出后放入无水乙醇中交联，得到丝素蛋白支架晾干待用；
步骤3.纳米颗粒载入：将步骤2所得到的丝素蛋白支架放入2.5 mg/mL氧化铁纳米颗粒溶液中浸泡，直至丝素蛋白支架被溶液均匀浸润，然后将浸润后的丝素蛋白支架放入冷冻干燥机中再次冷冻干燥，得到载有氧化铁纳米颗粒的丝素蛋白支架；
步骤4.膜包覆：先将磷脂膜溶于溶剂中得到磷脂膜溶液2mg/mL，然后将步骤3所得的具有功能组分的丝素蛋白支架放入相变磷脂膜溶液中，然后放入通风橱中干燥，即可得到内外包覆有磷脂膜的丝素蛋白支架；
步骤5.膜再次包覆：将5%PVA溶液涂敷在步骤4所得的内外包覆有磷脂膜的丝素蛋白支架外表面，然后放入烘箱中进行干燥即可得到具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架。
2.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，步骤1所述的碳酸钠溶液浓度为0.5±0.01wt%，所述的脱丝胶处理次数≥3次。
3.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，步骤1所述的三元溶液是无水氯化钙、无水乙醇和超纯水的摩尔比为1:2:8，所述的透析分子量为12000-14000Da，所述的浓缩浓度为5-10%（g/mL），所述的离心速率是1200-1500rpm,所述的滤膜是50-100μm。
4.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，步骤2所述的模具包括套管、内芯和封盖三部分结构，套管采用的是聚乙烯吸管，直径4-6mm，内芯是直径2-3mm纤维增强塑料棒，封盖采用不锈钢设计，一端密闭一端不密闭，直径大小和套管直径吻合，所述的预冷冻时间为12-24h，所述的无水乙醇交联时间为14-24h。
5.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，步骤3所述的氧化铁纳米颗粒溶液的浓度20-80%（g/mL）；所述的氧化铁纳米颗粒是一种聚葡萄糖山梨醇羧甲醚PSC包裹的γ-Fe2O3, 粒径为19-31nm，平均分子量为600-750KDa；所述的支架在氧化铁纳米颗粒的浸泡时间为24-48h。
6.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述的DPPC相变温度为41-43℃；所述的溶剂为氯仿或甲醇/氯仿的混合液。
7.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述的烘箱温度为37-60℃，加热时间为30-180min；所述的细胞是巨噬细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞中的一种及以上。
8.根据权利要求1所述的一种具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述的滤膜材料选自尼龙、聚四氟乙烯、聚醚砜、混合纤维素酯、聚偏氟乙烯中的一种。
9.一种如权利要求1所述方法制备的具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的应用，其特征在于，所述的功能性丝素蛋白支架应用于多种组织的修复。
10.根据权利要求9所述的具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架的应用，其特征在于，所述的修复是血管损伤修复。
CN202010124022.4A 2020-02-27 2020-02-27 具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法 Active CN111110912B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010124022.4A CN111110912B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010124022.4A CN111110912B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111110912A CN111110912A (zh) 2020-05-08
CN111110912B true CN111110912B (zh) 2021-12-07

Family

ID=70493245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010124022.4A Active CN111110912B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111110912B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111437435A (zh) * 2020-05-19 2020-07-24 中国科学院长春应用化学研究所 一种水凝胶细胞支架及其制备方法
CN113082287A (zh) * 2021-04-14 2021-07-09 东南大学 一种角膜修复水凝胶及其制备方法与应用
CN114984313B (zh) * 2022-04-26 2023-06-20 江苏省中医药研究院(江苏省中西医结合医院) 一种提高丝素蛋白支架压电效应的方法
CN115737934B (zh) * 2022-12-07 2024-04-02 西安理工大学 三明治结构纤维梯度释药骨水泥支架的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103272267A (zh) * 2013-06-07 2013-09-04 浙江大学 一种丝素蛋白与纳米Fe3O4复合材料的制备方法
CN103691007B (zh) * 2013-12-16 2014-12-17 安毅 一种温敏水凝胶复合涂层血管支架的制备方法
KR102012036B1 (ko) * 2016-10-11 2019-08-19 인천대학교 산학협력단 바이오 3ｄ 프린팅 지지체용 원료, 및 이를 이용한 3차원 지지체의 제조방법
CN106902386B (zh) * 2017-01-20 2019-11-22 三的部落（上海）科技股份有限公司 具有药物释放功能的3d打印生物支架及其制备方法
CN107875443A (zh) * 2017-08-04 2018-04-06 深圳市第二人民医院 双相磁性纳米复合支架材料及其制备方法
CN110295142B (zh) * 2019-07-11 2021-04-27 中国医学科学院北京协和医院 促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111110912A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111110912B (zh) 具有细胞响应迁移效应的功能性丝素蛋白支架及制备方法
US20230320837A1 (en) Multilayered Vascular Tubes
Zhu et al. Mechanical matching nanofibrous vascular scaffold with effective anticoagulation for vascular tissue engineering
Cui et al. Collagen-tussah silk fibroin hybrid scaffolds loaded with bone mesenchymal stem cells promote skin wound repair in rats
CN111714706B (zh) 可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管
WO2016023140A1 (zh) 一种用于细胞三维培养的基质支架及其构建方法和应用
CN103083723B (zh) 胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用
Xie et al. Adult stem cells seeded on electrospinning silk fibroin nanofiberous scaffold enhance wound repair and regeneration
Shen et al. Construction of ureteral grafts by seeding urothelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells into polycaprolactone-lecithin electrospun fibers
WO2021068743A1 (zh) 一种自支撑丝素蛋白导管支架的成型方法
Xiao et al. Bi-layer silk fibroin skeleton and bladder acellular matrix hydrogel encapsulating adipose-derived stem cells for bladder reconstruction
Zhou et al. A silk fibroin/chitosan/nanohydroxyapatite biomimetic bone scaffold combined with autologous concentrated growth factor promotes the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs and repair of critical bone defects
CN110124107B (zh) 一种用于关节软骨修复的plga细胞支架及其制备方法和应用
CN111714248A (zh) 一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管
Zhang et al. Polyethylene glycol crosslinked decellularized single liver lobe scaffolds with vascular endothelial growth factor promotes angiogenesis in vivo
CN110755174B (zh) 一种生物混合型人工血管及其制备方法
Liu et al. Construction of functional magnetic scaffold with temperature control switch for long-distance vascular injury
CN105031724B (zh) 一种组织工程软骨支架及其制备方法
Jiang et al. A composite scaffold fabricated with an acellular matrix and biodegradable polyurethane for the in vivo regeneration of pig bile duct defects
CN113509594B (zh) 诱导msc细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用
CN115154669B (zh) 仿生型脱落乳牙干细胞细胞外基质复合神经支架的制备和应用
CN115252897B (zh) 一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法
CN111529125B (zh) 一种组织工程血管补片制作模板及组织工程血管补片
CN109876187B (zh) 球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架及其制备方法
Chen et al. Decellularized Scaffold in Central Nervous System (CNS): A New Strategy to Treat CNS Injury

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant