CN103083723B

CN103083723B - 胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103083723B
Application number: CN201310020814.7A
Authority: CN
Inventors: 郭瑞; 张渊明; 李卫昌
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: CN103083723A

Abstract

本发明公开了一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用。本发明以具有良好生物相容性和降解性的胶原为基因载体材料，通过控制生长因子的种类和负载量，将可表达促血管化的生长因子负载在的明胶微球上；将该微球与胶原/纳米微晶纤维素组织工程皮肤支架复合，利用生长因子对创面细胞进行原位转染，实现促血管生成因子的可控持续分泌，促进皮肤再生材料的血管化，获得具有良好再生修复效果的皮肤再生材料。本发明为创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了性能良好的皮肤替代物，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，减轻病人的痛苦。本发明到制备方法简单，生产效率高，成本较低，适用于产业化生产。

Description

胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于皮肤再生材料制备技术领域，特别涉及一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是机体与外界的天然屏障。皮肤的组成与结构具有高度的复杂性，包括多种细胞、弹性纤维、胶原纤维、蛋白多糖等生物大分子以及葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等小分子。人体的皮肤由表皮、基底膜、真皮以及皮下组织四个部分构成的。临床上，外伤、溃疡、发炎、烧伤、手术及先天性畸形等皮肤缺损与异常，不仅造成患者身体的痛苦，同时也常造成心灵创伤。皮肤组织工程便是这一新兴学科中发展最早、最快的领域之一。人工皮肤作为一种皮肤创伤修复材料和损伤皮肤的替代品，在自体皮有限的情况下，可以使皮肤大面积受损和深度烧伤者，进行修复治疗并使之恢复相关的生理功能。

皮肤再生材料血管化速度是影响其再生性能、决定材料移植成活率的关键。因此，如何促进皮肤再生材料的血管化速度，进而缩短创面缺血时间，提高移植存活率，是皮肤再生与修复研究中的关键问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法。

本发明的另一目的在于提供有上述制备方法得到的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料。

本发明的再一目的在于提供所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）将山梨糖醇酐油酸酯（斯盘-80，Span80）加入植物油中，于40～60℃边机械搅拌边加入明胶溶液，机械搅拌2～3h后，边冰浴搅拌边加入戊二醛，冰浴搅拌2～3h后加入丙酮A，静置，过滤，得到微球；将微球置于丙酮B中，室温固化12～24h后转移到氨基乙酸中，离心，取微球沉淀，分别用丙酮C和异丙酮交替洗涤3～6次后浸泡于去离子水中，-20～-60℃冷冻干燥，得到明胶微球；将明胶微球加入生长因子溶液中，混合均匀，得到负载生长因子的明胶微球溶液；每毫升植物油中含有1.00～6.25mg山梨糖醇酐油酸酯，每毫克明胶微球加入10～100μl生长因子溶液；植物油、明胶溶液、戊二醛、丙酮A、丙酮B、氨基乙酸与去离子水的体积比为100～200：5～30：0.5～1：20～50：50～100：50～100：100～200；

（2）将0.1～1.0wt%的纳米微晶纤维素溶液（CNC溶液）加入0.5～1.0wt%的胶原溶液中，纳米微晶纤维素与胶原的质量百分比为1～10%，机械搅拌2～3h，真空脱泡，得到胶原/纳米微晶纤维素混合溶液；将胶原/纳米微晶纤维素混合溶液注入模具中，于-5～-60℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架；将胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架浸泡于0.25～1.00wt%的戊二醛水溶液中，4～25℃反应6～24h后用去离子水清洗3～6次，于-5～-60℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素支架；

（3）将步骤（1）的负载生长因子的明胶微球按质量比0.5:100～5:100加到步骤（2）的胶原/纳米微晶纤维素支架上，室温放置2～5h，自然干燥，得到胶原/纳米纤维素皮肤再生材料；

步骤（1）中：

所述的搅拌的速度优选为500～1000r/min；

所述的明胶溶液优选为5～10wt%的明胶水溶液；

所述的戊二醛优选为15～25wt%的戊二醛水溶液；

所述的离心的条件优选为2000r/min离心10分钟；

所述的生长因子溶液为20～50μg/mL生长因子水溶液，优选为50μg/mL生长因子水溶液；

每毫克明胶微球优选加入100μl生长因子溶液；

所述的生长因子优选为表达血管内皮细胞生长因子（VEGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；

步骤（2）中：

所述的0.5～1wt%的胶原溶液优选采用以下方法进行配制：将胶原加入0.5～1wt%的乙酸溶液中，搅拌均匀，配制成0.5～1wt%的胶原溶液；

所述的0.1～1wt%的纳米微晶纤维素（cellulose nanocrystals,CNC）溶液优选采用以下方法进行配制：将纳米微晶纤维素加入0.5～1wt%的乙酸溶液中，搅拌均匀，配制成0.1～1wt%的纳米微晶纤维素溶液；

所述的0.5～1wt%的乙酸溶液优选为0.5～1wt%的乙酸水溶液；

所述的搅拌的速度优选为500～1000r/min；

所述的模具优选为聚四氟乙烯模具；

所述的步骤（3）中，优选将步骤（1）的负载生长因子的明胶微球按质量比0.5:100加到步骤（2）的胶原/纳米微晶纤维素支架上；

一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料，由上述制备方法得到；

所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料可应用于创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗；

本发明的发明机理：本发明采用再生医学的方法和技术，选择具有良好生物相容性和生物降解性能的胶原为基因载体材料，添加纳米微晶纤维素具有增强机械性能、溶胀性能及耐降解作用；通过改变相关反应条件，得到具有特定微结构的多孔支架。通过控制生长因子的种类和负载量，将可表达促血管化的生长因子负载在的明胶微球上；进一步将该微球与胶原/纳米微晶纤维素组织工程皮肤支架复合，利用生长因子对创面细胞进行原位转染，实现促血管生成因子的可控持续分泌，促进皮肤再生材料的血管化，最终获得具有良好再生修复效果的皮肤再生材料。实验表明该支架能够有效的促进细胞的迁移、增殖和分化，促进细胞浸入，具有良好的生物相容性。大鼠皮下埋植实验发现该材料能够快速血管化，超薄皮片移植后能较好成活；14天即能充分血管化，超薄皮片移植后能较好成活。另外，外源性的胶原/纳米微晶纤维素支架会随着时间的推移而逐渐降解，被机体吸收，最终得到的是与人体自身完全相似的组织。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明为创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了一种性能良好的皮肤替代物，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦。可以广泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面。本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，适用于产业化生产。与国外同类产品相比，本发明产品的成本较低。

（2）本发明采用纳米微晶纤维素与胶原基真皮活性支架复合，并利用戊二醛辅助交联，提高胶原基支架的生物稳定性。其中胶原/纳米微晶纤维素多孔支架可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化，原位诱导缺损真皮组织的再生；该支架同时充当临时表皮层的作用，有效控制了创面水分的挥发及组织细菌的侵入等，从而构建具有生物活性和抗菌功能的组织工程化复合支架。同时，胶原与纳米微晶纤维素都是具有良好生物相容性、低免疫原性和可降解性的高分子材料。

附图说明

图1是对比实施例的纳米微晶纤维素的原子力显微镜图。

图2是实施例1的明胶微球的扫描电镜图。

图3是对比实施例的胶原/纳米微晶纤维素三维复合支架宏观形貌图。

图4是实施例2的纯胶原支架表面形貌和5wt%CNC复合支架表面形貌的扫描电镜图；其中：a为纯胶原支架表面形貌的扫描电镜图，b为5wt%CNC复合支架表面形貌的扫描电镜图。

图5是实施例2的负载VEGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架和负载bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架的扫描电镜图；其中：a为负载VEGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架的扫描电镜图，b为负载bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架的扫描电镜图。

图6是对比实施例的不同质量百分比的CNC复合胶原多孔支架的溶胀性能曲线图；其中：a为纯胶原的溶胀性能曲线；b为1wt%CNC复合胶原多孔支架的溶胀性能曲线；c为3wt%CNC复合胶原多孔支架的溶胀性能曲线；d为5wt%CNC复合胶原多孔支架的溶胀性能曲线；e为7wt%CNC复合胶原多孔支架的溶胀性能曲线；f为10wt%CNC复合胶原多孔支架的溶胀性能曲线。

图7是对比实施例的不同质量百分比的CNC复合胶原多孔支架的热重分析（TG）曲线图；其中：a为纯胶原的热重分析曲线；b为1wt%CNC复合胶原多孔支架的热重分析曲线；c为3wt%CNC复合胶原多孔支架的热重分析曲线；d为5wt%CNC复合胶原多孔支架的热重分析曲线；e为7wt%CNC复合胶原多孔支架的热重分析曲线；f为10wt%CNC复合胶原多孔支架的热重分析曲线。

图8是实施例3的负载bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架的体外释放曲线图。

图9是对比实施例的负载bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架细胞毒性测试（MTT）图。

图10是实施例2的负载了VEGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下的大体观察图；其中：a为负载了VEGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下7天后的大体观察图，b为负载了VEGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下10天后的大体观察图，c为负载了VEGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下14天后的大体观察图。

图11是实施例3的负载了bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下的大体观察图；其中：a为负载了bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下7天后的大体观察图，b为负载了bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下10天后的大体观察图，c为负载了bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素复合支架埋置皮下14天后的大体观察图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）将0.7g山梨糖醇酐油酸酯（斯盘-80，Span80）加入200ml植物油中，60℃边机械搅拌（500r/min）边加入30ml10wt%的明胶溶液，机械搅拌2h后，边冰浴搅拌（500r/min）边加入0.5ml25wt%的戊二醛水溶液，冰浴搅拌2h后加入50ml丙酮A，静置，过滤，得到微球；将微球置于50ml丙酮B中室温固化12h后转移到50ml氨基乙酸中，2000r/min离心10分钟，取微球沉淀，分别用丙酮C和异丙酮交替洗涤6次后浸于去100ml离子水中，-60℃冷冻干燥，得到明胶微球；将5mg明胶微球混在500μl生长因子aFGF（50μg/ml）溶液中，混合均匀，得到负载生长因子aFGF的明胶微球溶液；SEM观察明胶微球的粒径和形貌结果如图2所示；

（2）将1wt%的纳米微晶纤维素溶液（将纳米微晶纤维素加入1wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成1wt%的纳米微晶纤维素溶液；）加入1wt%的胶原溶液（将胶原加入1wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成1wt%的胶原溶液；）中，制备成1wt%（CNC/胶原）混合溶液，500r/min搅拌2h，真空脱泡，得到胶原/纳米微晶纤维素混合溶液；然后把胶原/纳米微晶纤维素混合溶液注入聚四氟乙烯模具中，于-60℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架；将胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架浸泡于0.25wt%戊二醛水溶液中，4℃静置6h后用去离子水清洗6次，于-60℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素支架；

（3）取5μl步骤（1）的负载生长因子aFGF的明胶微球溶液滴加在10mg步骤（2）的胶原/纳米微晶纤维素支架上，室温放置2h，自然干燥，得到负载生长因子纳米微球的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料。

实施例2

（1）将0.625g山梨糖醇酐油酸酯加入100ml植物油中，50℃边机械搅拌（800r/min）边加入5ml8wt%的明胶溶液，机械搅拌2.5h后，边冰浴搅拌（800r/min）边加入1ml15wt%的戊二醛水溶液，冰浴搅拌2.5h后加入20ml丙酮A，静置，过滤，得到微球；将微球置于70ml丙酮B中室温固化16h后转移到70ml氨基乙酸中，2000r/min离心10分钟，取微球沉淀，分别用丙酮C和异丙酮交替洗涤6次后浸于去150ml离子水中，-40℃冷冻干燥，得到明胶微球；将5mg明胶微球混在500μl生长因子VEGF（50μg/ml）溶液中，混合均匀，得到负载生长因子VEGF的明胶微球溶液；

（2）将0.1wt%的纳米微晶纤维素溶液（将纳米微晶纤维素加入0.5wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成1wt%的纳米微晶纤维素溶液；）加入0.5wt%的胶原溶液（将胶原加入0.5wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成1wt%的胶原溶液；）中，制备成5wt%（CNC/胶原）混合溶液，800r/min搅拌2.5h，真空脱泡，得到胶原/纳米微晶纤维素混合溶液；然后把胶原/纳米微晶纤维素混合溶液注入聚四氟乙烯模具中，于-40℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架；将胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架浸泡于0.75wt%戊二醛水溶液中，15℃静置24h后用去离子水清洗6次，于-40℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素支架；胶原/纳米微晶纤维素支架的微观结构如图4所示，孔径为100～200μm；

（3）取5μl步骤（1）的负载生长因子VEGF的明胶微球溶液滴加在10mg步骤（2）的胶原/纳米微晶纤维素支架上，室温放置3h，自然干燥，得到负载生长因子纳米微球的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料，其SEM图如图5所示；

在负载生长因子纳米微球的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料上种植小鼠成纤维细胞（3T3），以20wt％胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升的链霉素的RPMI1640培养基培养3天后，放在2.5wt%的戊二醛水溶液中固定，梯度乙醇（依次为50wt%、70wt%、80wt%、90wt%和100wt%的乙醇）脱水、超临界干燥后SEM观察。3T3细胞可以在负载VEGF的支架上较好地粘附并保持其形态。在大鼠背上进行皮下实验，埋置负载VEGF的胶原/纳米微晶纤维素皮肤再生支架。图10是负载了VEGF的胶原/纳米微晶纤维素支架埋置皮下7、10、14天后的大体观察图。从图中可以看出7天的时候支架还有剩余，创面红润，10天的时候支架几乎全部降解，14天支架完全降解，肉芽组织颜色红润，表明血管较为丰富。

实施例3

（1）将0.15g山梨糖醇酐油酸酯加入150ml植物油中，40℃边机械搅拌（1000r/min）边加入20ml5wt%的明胶溶液，机械搅拌3h后，边冰浴搅拌（1000r/min）边加入0.8ml20wt%的戊二醛水溶液，冰浴搅拌3h后加入40ml丙酮A，静置，过滤，得到微球；将微球置于100ml丙酮B中室温固化24h后转移到100ml氨基乙酸中，2000r/min离心10分钟，取微球沉淀，分别用丙酮C和异丙酮交替洗涤6次后浸于去200ml离子水中，-20℃冷冻干燥，得到明胶微球；将5mg明胶微球混在500μl生长因子bFGF（50μg/ml）溶液中，混合均匀，得到负载生长因子aFGF的明胶微球溶液；

（2）将0.5wt%的纳米微晶纤维素溶液（将纳米微晶纤维素加入0.8wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成0.5wt%的纳米微晶纤维素溶液；）加入0.8wt%的胶原溶液（将胶原加入0.8wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成0.8wt%的胶原溶液；）中，制备成10wt%（CNC/胶原）混合溶液，1000r/min搅拌3h，真空脱泡，得到胶原/纳米微晶纤维素混合溶液；然后把胶原/纳米微晶纤维素混合溶液注入聚四氟乙烯模具中，于-5℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架；将胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架浸泡于1.00wt%戊二醛水溶液中，25℃静置12h后用去离子水清洗6次，于-5℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素支架；胶原/纳米微晶纤维素支架的孔径为100～200μm；

（3）取5μl步骤（1）的负载生长因子bFGF的明胶微球溶液滴加在10mg步骤（2）的胶原/纳米微晶纤维素支架上，室温放置5h，自然干燥，得到负载生长因子纳米微球的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料；

将负载生长因子纳米微球的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料浸入5mL含牛血清白蛋白（1mg/mL）的PBS溶液中，于37℃培养箱孵化0.5、1、1.5、2……一直持续到第14天，每天收集等量的PBS溶液（20μl），标记后置于-20℃保存。采用酶联吸附免疫法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法测定PBS溶液中释放的bFGF浓度，并绘制bFGF体外释放曲线（图8）。在大鼠背部埋置该上述支架，图11是负载了bFGF明胶微球的胶原/纳米微晶纤维素支架植入皮下7、14、21天后的大体观察图。从图中可以看出7天的时候支架还有剩余，创面显红色，14天的时候支架几乎全部降解，21天支架完全降解，皮下组织成长正常。

对比实施例

（1）将纳米微晶纤维素（图1）加入1wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成1wt%的纳米微晶纤维素溶液；将胶原加入1wt%的乙酸水溶液中，搅拌均匀，配制成1wt%的胶原溶液；

将1wt%的纳米微晶纤维素溶液滴入到1wt%的胶原溶液中，500r/min机械搅拌2h，分别制备CNC含量为0wt%、1wt%、3wt%、5wt%、7wt%和10wt%的CNC/胶原混合溶液，然后将CNC/胶原混合溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，4℃静置过夜，然后在-60℃冷冻干燥，成型后得1wt%、3wt%、5wt%、7wt%和10wt%三维多孔复合支架；将上述支架分别浸在0.25wt%的戊二醛水溶液中固定，4℃静置24h后取出支架，并用三蒸水反复洗涤6次，再次在-60℃冷冻干燥，得到一系列三维多孔复合支架（图3），通过溶胀性能测试（GB/T14797.3-2008）（图6）及热重分析（JB/T6856-1993）（图7），选出性能较好多孔支架。将负载生长因子的明胶微球溶液按重量比为0.5:100逐滴加到胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架上，室温自然干燥后观察其微观形貌如图5所示，孔径为100～200μm。将消过毒的支架放在24孔板中，每孔加入5×10⁴成纤维细胞（3T3），加入培养基培养1、3、5、7天后进行MTT测试（GB/T14233.2-2005），发现细胞成长良好，生长因子的加入有利于细胞的生长（图9），表明该材料具有良好的细胞相容性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将山梨糖醇酐油酸酯加入植物油中，于40～60℃边机械搅拌边加入明胶溶液，机械搅拌2～3h后，边冰浴搅拌边加入戊二醛，冰浴搅拌2～3h后加入丙酮A，静置，过滤，得到微球；将微球置于丙酮B中，室温固化12～24h后转移到氨基乙酸中，离心，取微球沉淀，分别用丙酮C和异丙酮交替洗涤3～6次后浸泡于去离子水中，-20～-60℃冷冻干燥，得到明胶微球；将明胶微球加入生长因子溶液中，混合均匀，得到负载生长因子的明胶微球溶液；每毫升植物油中含有1.00～6.25mg山梨糖醇酐油酸酯，每毫克明胶微球加入10～100μl生长因子溶液；植物油、明胶溶液、戊二醛、丙酮A、丙酮B、氨基乙酸与去离子水的体积比为100～200：5～30：0.5～1：20～50：50～100：50～100：100～200；

(2)将0.1～1.0wt％的纳米微晶纤维素溶液加入0.5～1.0wt％的胶原溶液中，纳米微晶纤维素与胶原的质量百分比为1～10％，机械搅拌2～3h，真空脱泡，得到胶原/纳米微晶纤维素混合溶液；将胶原/纳米微晶纤维素混合溶液注入模具中，于-5～-60℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架；将胶原/纳米微晶纤维素三维多孔支架浸泡于0.25～1.00wt％的戊二醛水溶液中，4～25℃反应6～24h后用去离子水清洗3～6次，于-5～-60℃冷冻干燥，得到胶原/纳米微晶纤维素支架；

(3)将步骤(1)的负载生长因子的明胶微球按质量比0.5:100～5:100加到步骤(2)的胶原/纳米微晶纤维素支架上，室温放置2～5h，自然干燥，得到胶原/纳米纤维素皮肤再生材料。

2.根据权利要求1所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的生长因子溶液为20～50μg/mL生长因子水溶液。

3.根据权利要求1所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的生长因子为表达血管内皮细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子或碱性成纤维细胞生长因子。

4.根据权利要求1所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的明胶溶液为5～10wt％的明胶水溶液；所述的戊二醛为15～25wt％的戊二醛水溶液。

5.根据权利要求1所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的搅拌的速度为500～1000r/min；所述的离心的条件为2000r/min离心10分钟。

6.根据权利要求1所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的0.5～1wt％的胶原溶液采用以下方法进行配制：将胶原加入0.5～1wt％的乙酸溶液中，搅拌均匀，配制成0.5～1wt％的胶原溶液。

7.根据权利要求1所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的0.1～1wt％的纳米微晶纤维素溶液采用以下方法进行配制：将纳米微晶纤维素加入0.5～1wt％的乙酸溶液中，搅拌均匀，配制成0.1～1wt％的纳米微晶纤维素溶液。

8.根据权利要求6或7所述的胶原/纳米纤维素皮肤再生材料的制备方法，其特征在于：所述的0.5～1wt％的乙酸溶液为0.5～1wt％的乙酸水溶液；所述的搅拌的速度为500～1000r/min。

9.一种胶原/纳米纤维素皮肤再生材料，由权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。