CN101961510A - 一种利用脂肪间充质细胞再生真皮组织的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的之一是提供一种方法和配方，将来源于自体脂肪组织的间充质干细胞经体外培养增殖后混合入支架材料中移植入病人体内，移植体内的脂肪间充质干细胞在局部微环境的作用下向真皮成纤维细胞分化，新生的真皮成纤维细胞能够进一步激活注射部位细胞胶原基质的分泌，从而对人体皮肤组织的缺损和衰老进行再生性的修复，本技术的适用范围包括：皮下填充面部除皱，皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤等。本发明中使用的种子细胞是从病人自身脂肪组织内分离纯化制得，因而避免了伦理争议和免疫排斥反应。可以采用仪器抽吸法进行脂肪组织的取材，操作简单，给病人带来的创伤和痛苦小。

Description

一种利用脂肪间充质细胞再生真皮组织的方法 

技术领域

本发明是一种利用人脂肪间充质细胞多向分化潜能，结合组织工程技术进行真皮再生的方法，适用于整形外科及整形美容，属于组织工程领域。 

背景技术

对抗衰老是全人类共同关注的话题。对人体肌肤起支撑作用的物质大部分存在于真皮层，由胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸构成的一个纤维网络对皮肤起着支撑作用，其含量的多少决定了皮肤的质地。这三种物质都是从真皮层中的成纤维细胞分泌而来：成纤维细胞不断分泌胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸来保持肌肤的光泽度和质感。25岁以后，成纤维细胞以每年1％到2％的速度减少，随之而来的就是胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸的数量均下降，体现出衰老的迹象。成纤维细胞的衰减是导致肌肤衰老的主要原因。成纤维细胞来源于组织周围的间充质细胞，在体内特定环境下间充质细胞具有分化为成纤维细胞的能力。 

当前的美容医学朝着简单、微创、安全的方向发展，面部老化的治疗也从过去的手术治疗向生物医学制剂注射治疗转化。最早通过FDA验证获得商业应用的软组织填充剂是可溶性的胶原蛋白。从那以后，液体硅胶作为注射填充剂被广泛使用，然而液体硅胶的并发症如移位变形等问题很难处理。当前使用最广泛的填充剂是透明质酸。胶原和透明质酸注射产品属于生物可降解材料，对于矫正软组织缺陷不能起到永久的效果。医学界一直在寻找一种填充剂能够维持更长时间，同时具有较低的并发症和副作用。 

本发明利用人脂肪间充质细胞的分化潜能，结合组织工程技术对人体损伤 或衰老的机体进行再生修复。本发明应用范围包括：皮下填充面部除皱，皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤。下面以美容除皱为例阐述本发明的优点。美容除皱术已经有近百年的历史，目前常用的几种方法简述如下： 

SMAS除皱：简单地说，就是人们常说的拉皮手术。即在皮下潜行分离，然后切除多余皮肤、拉紧缝合。但术后易造成无表情，面部僵硬的“面具脸”。 

肉毒素(Botox)：Botox是一种神经毒素，注入导致皱纹的肌肉内，作用于周围运动神径末梢、神经肌肉接点及突触处，抑制突触前膜释放神经递质，阻断乙酰胆碱的释放，从而使肌肉张力下降或瘫痪麻痹，皱纹也随之消失，从而达到治疗面部皱纹的效果。此方法操作简单，无肿胀瘀血，见效快，不发生过敏反应。但是这种方法是以破坏或减弱人体某些正常生理功能为代价而达到去皱目的，因此消费者须慎重。此方法时效短，需要长期反复注射才能维持效果。 

皮下填充：近年来在整形美容界，皮肤填充剂随着材料和注射技术的进步正以空前速度发展。整形美容消费市场对新型皮肤填充剂的需求正培育着新兴产业。胶原类和透明质酸类是该类注射剂的主要产品。这类填充术的主要特点是微创，手术简单，见效快。但是由于这类填充剂是生物可降解材料，故短期内皱纹会再现。其他填充剂如早期的爱贝芙和伊凡露已经逐渐被透明质酸类填充物所取代。 

运用细胞技术和组织工程技术进行整形美容手术，是现代美容业发展的一个方向。组织工程是20世纪80年代随着现代医学技术的发展，尤其是细胞生物学、分子生物学和生物材料科学的发展而提出来的医学新概念。组织工程的基本原理和方法是：将体外培养扩增的细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞/生物材料复合物植入机体组织、器 官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。组织工程有三个基本的要素：一是细胞；二是为细胞提供类似于细胞外基质生长环境的三维支架材料；三是其他成分如生长因子、细胞黏附因子、细胞养分等，为细胞的生长分化提供所需要的微观生理环境。下面从种子细胞、支架材料、微生理环境三个方面阐述本发明的先进性。 

组织工程中使用的种子细胞需满足以下几点要求：增殖能力强，能进行大规模扩增以产生足够数量的细胞；活力和功能良好；细胞纯度高；不发生免疫排斥反应；生物安全性好。在种子细胞取材方面要考虑几点原则：细胞来源广泛，来源充足；取材安全方便，供区创伤小；细胞培养技术简单易行，培养与扩增成本低。本发明中采用的脂肪来源的间充质细胞完全满足上述需求，被认为是一种非常理想的组织工程种子细胞。脂肪间充质细胞来源非常丰富，平均每300毫升脂肪组织可以获得2-6亿个这样的细胞。另外由于采用病人自身的成体干细胞，避免了伦理争议和免疫排斥反应。脂肪组织取材一般有两种方法，即仪器抽吸法和手术切取法。有实验表明这两种方法对脂肪干细胞的增殖能力和分化能力的影响没有显著差异。仪器吸脂法由于操作简单，创伤小，可作为临床获取组织工程种子细胞的首选方法。 

组织工程支架材料为种子细胞提供类似于细胞外基质的，适合细胞生长、分化等功能的三维生物学空间，克服了以往单一细胞移植中细胞不易存活、基质合成能力低下等缺点。支架在细胞的生长分化过程中逐渐被机体降解吸收，从而达到对病变或缺损组织的再生性修复。由于人体待修复的组织在形态、功能、结构等方面区别很大，对支架材料也有不同的要求。但是以下几点基本要求必须满足：生物相容性，无免疫原性；适当的降解速率，降解产物无毒无副 作用；适当的机械强度等。水凝胶作为支架材料用于人体软组织的修复具有巨大的优势。水凝胶是一种在水中溶胀并保持大量水分而又可降解或不降解的聚合物。某些水凝胶由于聚合物网络中的大量水分而赋予了整个材料流体的性质；充盈有大量水分的特性又与机体组织极其相似，使其成为一种理想的作为类似于细胞外基质的支架材料；细胞非常容易种植其中；且能为细胞提供真正的三维空间的生存环境；其水凝胶的特性易于营养成分的渗透移动，因此能有效地为细胞提供养分；柔软、湿润的表面以及组织的亲和力大大减少了材料对周围组织的刺激性，使得水凝胶聚合物具有良好的生物相容性。水凝胶特性又能使其利用简单的注射方法很容易地填充入不规则形状的损坏组织内，从而避免使用固体支架时必须动手术而给病人带来的机体损伤和痛苦。水凝胶由于上述各种优点使其作为支架材料在组织工程中的应用已经引起越来越广泛的兴趣。 

在支架材料和种子细胞的复合体中，适当的微观生理环境是构建具有生命活性的各种组织和器官至关重要的因素。组织内环境包括了不同的细胞因子、组织特异性细胞外基质以及细胞间相互作用等。其中各种营养成分(如氧)的供应是保证组织工程所构建的各种组织具有生命活性的必要条件。本发明中使用水凝胶支架材料不仅有益于机体内各种营养成分在其中的运动从而为细胞提供养分，而且其水凝胶特性也有益于方便地在其中加入细胞及细胞所需的各种成分。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种方法和配方，将来源于自体脂肪组织的间充质干细胞经体外培养增殖后混合入支架材料中移植入病人体内，移植体内的脂肪间充质干细胞在局部微环境的作用下向真皮成纤维细胞分化，新生的真皮成 纤维细胞能够进一步激活注射部位细胞胶原基质的分泌，从而对人体皮肤组织的缺损和衰老进行再生性的修复，本技术的适用范围包括：皮下填充面部除皱，皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤等。 

本发明中使用的种子细胞是从病人自身脂肪组织内分离纯化制得，因而避免了伦理争议和免疫排斥反应。可以采用仪器抽吸法进行脂肪组织的取材，操作简单，给病人带来的创伤和痛苦小。 

本发明中使用的种子细胞是脂肪组织内经分离、纯化、培养得到的间充质干细胞。这些细胞在一定的诱导条件或生理环境下能分化成为成纤维细胞。 

本发明中使用的支架材料是具有生物相容性和生物降解性能的高分子水凝胶。水凝胶内混合入脂肪间充质干细胞和其他成分之后，可以通过注射器注入病人体内，手术过程非常简单，不留疤痕，避免了使用固体支架材料时所必须的手术，从而避免了给病人带来的机体损伤和痛苦，患者容易接受。 

本发明中使用的水凝胶支架材料可以通过注射器方便地填充入真皮层和形状不规则的缺陷内，因此本发明在整形外科中的应用范围非常广泛。 

本发明中使用的水凝胶支架材料非常易于各种成分的加入及其在内部的移动。这些成分包括生长因子以及细胞增殖、分化、生长所必须的营养成分。 

附图说明

图1、脂肪间充质干细胞 

图2、脂肪间充质干细胞体外诱导分化成脂肪细胞(左)，骨细胞(右) 

图3、脂肪间充质干细胞分化为皮肤成纤维细胞(左)，角蛋白抗体阳性(右) 

图4、脂肪间充质干细胞分化为皮肤成纤维细胞(左)，角蛋白抗体阳性(右) 

图5、注射前耳后组织活检(左)，自体脂肪间充质干细胞注射后组织活检(右) 

实施例

实施例一：脂肪间充质干细胞的提取、培养及鉴定 

实施例二：脂肪间充质干细胞/水凝胶支架材料复合物的制备与检测 

实施例三：动物实验 

实施例四：自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹 

实施例五：自体脂肪间充质干细胞注射前后组织活检对比 

实施例一：脂肪间充质干细胞的提取、培养及鉴定 

1.脂肪间充质干细胞的提取与培养 

(1)将通过仪器吸脂法获得的30毫升脂肪组织内血管、结缔组织等多余成分剔除后用含有抗生素的可注射级0.8％的生理盐水冲洗2-3遍，得到淡黄色的脂肪颗粒组织； 

(2)向净化后的脂肪颗粒内加入2mg/ml的I型胶原酶溶液(美国Worthington公司)于37℃消化60-90min，完全培养基(DMEM+10％FBS，均为美国Gibco公司)终止消化； 

(3)150目筛网过滤人脂肪组织消化后的产物； 

(4)过滤后以1000转/分钟的转速离心10min，完全培养基重悬，苔盼蓝(中国国药集团)染色后计数； 

(5)在完全培养基中以1×10⁵/cm²的密度将人脂肪间充质干细胞接种在T25的塑料培养瓶(美国Corning公司)中，并置于37℃、5％的二氧化碳培养箱内培养； 

(6)细胞长至85％左右时进行细胞传代。传代时先移去血清培养基，然后每瓶加入2ml 0.25％胰酶(Sigma，美国)室温消化5分钟，显微镜下观察，待细 胞变圆后加入血清培养基终止消化，收集消化得到的细胞悬液以1500转/分的转速离心10min，完全培养基重悬后以1∶3的比例重新接种细胞，待细胞长满后得到第一代细胞。 

(7)细胞培养扩增按照步骤(6)的方法重复进行。 

得到的脂肪间充质干细胞在显微镜下观察如图一所示。 

2.人脂肪间充质干细胞的鉴定 

(1)人脂肪间充质干细胞生物学特性检测 

i.利用倒置显微镜观察各代人脂肪间充质干细胞的细胞生长形态特征及测定细胞生长周期，通过观察测定人脂肪间充质干细胞原代及传代细胞呈梭形贴壁生长，通过对P1、P2、P3代周期测定，各代均在传代第5-6天进入生长对数期，无明显差异性存在。 

ii.利用免疫荧光的方法对人脂肪间充质干细胞相对特异性标记进行检测。结果显示：人脂肪间充质干细胞抗原CD29、CD44、CD71、CD106呈阳性表达，抗原CD45、CD34呈阴性表达。 

(2)人脂肪间充质干细胞多向分化能力的检测：选取P1、P2、P3代人脂肪间充质干细胞在成脂肪诱导液(基本培养基+胰岛素+地塞米松+吲哚美辛)培养下，培养9天后油滴样的脂肪细胞出现，继续培养脂肪油滴逐渐增大，第20天油红染色鉴定脂肪细胞，结果阳性。成骨诱导分析选用成骨诱导液(基本培养基+地塞米松+抗坏血酸+β-甘油磷酸钠)培养，持续诱导培养22天后用茜素红染色鉴定成骨细胞，结果阳性。 

脂肪间充质干细胞体外诱导分化结果如图二所示。 

实施例二：脂肪间充质干细胞/水凝胶支架材料复合物的制备与检测 

1.脂肪间充质干细胞/胶原蛋白水凝胶支架材料复合物的制备 

按照实施例一所述方法进行脂肪间充质干细胞的提取分离、培养扩增，将获得的脂肪间充质干细胞混入注射级胶原蛋白水凝胶中配制成细胞浓度为5×10⁶/ml的细胞悬浮液。此悬浮液可用来进行皮下注射进行组织工程再生医疗应用。 

2.脂肪间充质干细胞/胶原蛋白水凝胶支架材料复合物的检测 

(1)细胞成活率检测：利用苔盼蓝排斥试验对收集得到的细胞进行细胞成活率及细胞数目进行测定，细胞存活率在95％以上； 

(2)细胞无菌、无病毒检测：参见《中国药典》2005版第三部附录XII A第73页和《组织工程医疗产品第12部分：细胞、组织、器官的加工指南》相关规定，对培养中的各代细胞进行无菌、无外源性病毒检测； 

(3)血清残留检测：参见《中国药典》2005版第三部附录XIII D项规定标准，对细胞收集处理后的细胞进行血清残留检测； 

(4)复合物免疫反应检测：在临床实验注射前，取100μl复合物对临床实验患者进行皮试，观察无免疫反应出现。 

实施例三：动物实验 

将实施例二中的细胞/水凝胶复合物经1ml注射器进行裸鼠皮下注射。注射前将裸鼠全麻，每个注射点的注射量控制在250ul左右，对照组采用等量生理盐水代替注射物。实验组与对照组每次各选用裸鼠(体重约20g，健康，雄性)5只，两组实验同等条件下重复三次。实验组和对照组裸鼠在注射实验30天后解 剖观察，采集注射部位的皮肤进行组织切片染色检查。结果表明：实验组裸鼠注射部位的真皮部位存在外源性人脂肪干细胞，且角蛋白抗体阳性。 

脂肪间充质干细胞体内分化为皮肤成纤维细胞结果如图三所示。 

实施例四：自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹 

在病人皱纹局部表面麻醉情况下，将实施例二中的细胞/水凝胶复合物沿颈纹注射入真皮层，边注射边退针。手术完成后按照标准的随访跟踪制度对临床效果进行监测。结果显示：在皱纹下方注射的复合物未引起免疫反应，复合物能够起到支持组织结构的作用，原有皱纹得到明显改善。 

自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹效果如图四所示。 

实施例五：自体脂肪间充质干细胞注射前后组织活检对比 

局部表面麻醉情况下，依实施例四的方法在病人耳后真皮层注射细胞/水凝胶复合物，同样边注射边退针。手术后一个月在病人耳后注射部位和未注射部位分别取长7毫米宽5毫米的皮肤组织，常规HE染色，结果显示注射部位真皮层明显增厚，有明显的纤维组织增生。 

自体脂肪间充质干细胞注射前后组织活检对比效果如图五所示。 

Claims (8)

1.一种利用脂肪间充质干细胞再生真皮组织的方法，其特征在于：种子细胞为脂肪间充质干细胞，取自病人自身的脂肪组织，经提取、纯化、体外培养扩增后，均匀植入水凝胶支架材料内形成复合物，再注射入病人真皮层。

2.如权利要求书1所述的再生真皮组织的方法，其应用范围有：皮下填充除皱，皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤。

3.如权利要求书1所述的种子细胞，其特征在于：种子细胞是从脂肪组织内分离出来的间充质干细胞，取自于病人自身脂肪组织。种子细胞经从脂肪组织中提取、纯化、体外培养扩增等一系列过程。

4.如权利要求书1所述的复合物，其特征在于：将一定数量的种子细胞(细胞浓度为10⁵～10⁸/ml)植入水凝胶支架材料内形成细胞均匀分散的细胞-水凝胶支架材料复合物。

5.如权利要求书4使用的水凝胶支架材料，其特征在于：水凝胶支架材料是具有生物相容性和生物降解性能的天然高分子或合成高分子材料。水凝胶支架材料是可以通过针头注射入病人体内的可流动的水凝胶。水凝胶成分为胶原蛋白、透明质酸或透明质酸盐、泊洛沙姆(poloxamer)、纤维素衍生物、海藻酸或海藻酸盐、壳聚糖及其衍生物、纤维蛋白原中的一种或几种的混合物。

6.如权利要求书5所述的可供使用的可注射水凝胶支架材料包括胶原蛋白水凝胶，其重量百分比浓度为0.1-10％；透明质酸或透明质酸盐，其浓度为0.1-5％；泊洛沙姆(poloxamer)，其浓度为15-30％；纤维素衍生物，其浓度为0.1-10％；海藻酸或海藻酸盐，其浓度为0.1-10％；壳聚糖及其衍生物以及以壳聚糖及其衍生物为基础的混合物，其中壳聚糖及其衍生物浓度为0.1-10％；纤维蛋白原以及以纤维蛋白原为基础的混合物，其中纤维蛋白原浓度为0.1-5％。

7.如权利要求书6，细胞-水凝胶支架材料内可以含有血管生长因子以及细胞必需的营养成分。

8.如权利要求书1，细胞-水凝胶支架材料复合物使用医用注射器注射入病人真皮层。

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