CN109876187B

CN109876187B - 球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架及其制备方法

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Publication number: CN109876187B
Application number: CN201711273055.XA
Authority: CN
Inventors: 朱晨辉; 范代娣; 米钰; 马晓轩; 宋茜; 段志广; 傅容湛; 李伟娜
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN109876187A

Abstract

本发明涉及球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架及其制备方法，将胶原蛋白溶于球状蛋白溶液中，加入NaCl和谷氨酰胺转氨酶，最终制得组织工程关节软骨支架；其中，球状蛋白和NaCl为致孔剂，谷氨酰胺转氨酶为交联剂。本发明所制备的软骨支架具有高贯通性的三维多孔结构，生物相容性好，安全无毒，可降解，并具有合适的机械性能，是一种理想的人体关节软骨组织修复材料。

Description

球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架及其制备方法。

背景技术

关节软骨是一种少细胞、无血管、无淋巴的组织，故其再生和自我修复能力差，未达到软骨下骨的损伤几乎不能愈合，只能在伤口的附近产生短暂的软骨细胞复制并合成少量基质，最后逐渐引起关节表面退变，形成关节炎。目前治疗软骨损伤较为成熟方法有如下几种：一是自体软骨移植，其临床效果不错，但必须从健康部位切取软骨组织，造成了新的缺损，而且自体供区也非常有限；二是同种异体移植，能够克服自体组织移植的缺点，但免疫排斥反应长期存在，另外异体供体也十分有限，无法满足大量病人的需要；三是采用人工替代材料，但单纯人工材料不能与周围组织愈合成为一个整体，更不能参与正常新陈代谢活动；四是采用外科手术重建和医疗仪器，如关节腔冲洗，骨髓刺激等处理方式效果短暂，且无法防止病情地反复，甚至进一步恶化。组织工程技术的出现为关节软骨修复带来了一种更为理想的方法。

理想的组织工程支架应具有高贯通性的多孔结构，良好的生物相容性，可生物降解性以及可加工性。高贯通性的多孔结构和高孔隙率能为细胞的生长，粘附和增殖以及细胞外基质的分泌提供足够的空间。一些研究人员认为，软骨支架的孔隙率应该在90％以上，孔径应在200μm左右。生产多孔组织工程支架的常规技术包括溶液浇铸/粒子沥滤法、热致相分离/冷冻干燥法、气体发泡技术和静电纺丝技术。然而溶液浇铸/粒子沥滤法、热致相分离/冷冻干燥法和气体发泡技术制备的支架孔的相互连通性较差、孔分布不均匀且多为闭孔结构。另外，这些技术可能使用有毒的有机溶剂，这会对支架的生物相容性产生不利的影响。静电纺丝技术制备的的支架具有孔隙率高，连通性好，孔隙均匀等优点，但是制备速度较慢，并且还会采用有机溶剂。目前，快速成形技术作为一种先进的制造技术已被用来制备多孔支架，它主要包括立体光刻技术、熔融沉积技术和3D打印技术等。快速成形技术能够按照预设的形状和结构精确的制备组织工程支架，但在实际操作中，因为仪器的精度有限、且不同的技术只能选用相应的材料、在制作过程中还需要加入其他溶剂以及成本较高等问题而使得其在组织工程中的应用受到一定的限制。

为了克服以上制备方法的缺陷，从而制备出孔隙率均匀、孔径合适、力学性能优良的软骨支架，我们开发出了一种用球状蛋白作致孔剂、胶原蛋白作基本材料、谷氨酰胺酶作交联剂的新型组织工程多孔软骨支架。该支架，，孔隙率在90%以上，具有均匀且高度贯通的多孔结构和类海绵的特性，可以快速挤压和吸收水分。另外，胶原蛋白作为天然细胞外基质的主要成分具有很强的生物学活性，有利于细胞粘附，迁移和分化。该制备方法简单快捷、不使用任何有机溶剂、安全无毒、对环境友好。因此，该组织工程多孔支架在软骨修复领域具有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架及其制备方法，具有三维多孔结构、机械性能理想、生物相容性和生物可降解性良好，安全无毒。

本发明所采用的技术方案为：

球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

将胶原蛋白和球状蛋白溶于双蒸水中后，加入NaCl和谷氨酰胺转氨酶最终制得组织工程软骨支架；

其中，球状蛋白和NaCl为致孔剂，谷氨酰胺转氨酶为交联剂。

所述的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤（a）：将球状蛋白溶于双蒸水中得到质量分数为5% -15%的球状蛋白溶液；

步骤（b）：以最终5% - 15%的质量含量将胶原蛋白溶于步骤（a）的球状蛋白溶液中，得到蛋白混合溶液；

步骤（c）：将步骤（b）制备的蛋白混合溶液置于37℃条件下使其完全溶解，加入质量为蛋白混合溶液1% - 4% 的NaCl，搅拌使其完全溶解；

步骤（d）：将谷氨酰胺转氨酶加入步骤（c）制备的混合溶液中，谷氨酰胺转氨酶加量为20-80 U/g胶原蛋白，完全溶解后静止交联，得到胶原蛋白软骨支架；

步骤（e）:将步骤（d）中所得软骨支架在无热原水中洗涤除去交联剂和致孔剂，干燥灭菌得到组织工程软骨支架。

步骤（a）中，球状蛋白为大豆蛋白或牛血清白蛋白。

步骤（b）中，胶原蛋白为重组胶原蛋白、类人胶原蛋白或动物胶原蛋白。

步骤（d）中，静止交联4-24h，交联温度为4℃-25℃。

步骤（e）中，软骨支架在无热原水中的洗涤时间为72h，干燥方式为真空冷冻干燥，采用Co60照射灭菌。

所述的制备方法制得的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架。

组织工程软骨支架吸水率为 300-400%，孔隙率为 90% 以上，孔径为 100-300μm。

本发明具有以下优点：

本发明首次采用球状蛋白作为支架材料的致孔剂，制备工艺简单，所获得的软骨支架孔径均匀、贯通性好、孔隙率可达到90%以上，且机械性能基本接近人体关节软骨；本发明利用胶原蛋白、球状蛋白和谷氨酰胺转氨酶等纯天然材料制备的软骨支架具有良好、生物相容性和生物可降解性；本发明制得的组织工程软骨支架外观形态致密，各项性能参数适于人体软骨组织的修复；本发明提供的软骨支架有利于细胞的黏附及增殖，可促进软骨组织的形成，达到快速修复软骨损伤的目的。

附图说明

图1为组织工程软骨支架样品外观图。

图2为组织工程软骨支架真空冷冻干燥后的样品图。

图3为该支架材料在超纯水中的溶胀率。

图4为该支架材料的压缩应力和压缩应变的关系。

图5为该支架材料的扫描电镜图。

图6为该支架材料的CCK-8细胞毒性检验结果。

图7为该支架上培养7天的软骨细胞RCCS-1荧光染色图。

图8为该支架材料植入新西兰兔膝关节软骨缺损处12周修复图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，以胶原蛋白（如基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白）为原料，以微生物来源的谷氨酰胺转氨酶为交联剂，球状蛋白和NaCl为致孔剂，采取生物交联的方式制备组织工程软骨支架。步骤包括：将胶原蛋白溶于球状蛋白溶液中后，利用制孔剂NaCl和交联剂谷氨酰胺转氨酶最终制得组织工程软骨支架。

具体包括以下步骤：

步骤（a）中，球状蛋白为大豆蛋白、牛血清白蛋白或白蛋白。

步骤（b）中，胶原蛋白为重组胶原蛋白、类人胶原蛋白、动物胶原蛋白或丝素蛋白。

步骤（d）中，静止交联4-24h，交联温度为4℃-25℃。

制得的组织工程软骨支架吸水率为 300-400%，孔隙率为 90% 以上，孔径为 100-300 μm。

实施例1：

步骤（a）：称取大豆蛋白溶于5 mL双蒸水中得到质量分数为5%的大豆蛋白溶液；

步骤（b）：类人胶原蛋白溶于步骤（a）的大豆蛋白溶液中，使其浓度为15%；

步骤（c）：将步骤（b）制备的蛋白混合溶液置于37℃条件下使其完全溶解，加入浓度为4% NaCl，搅拌使其完全溶解；

步骤（d）：将含量为60 U/g胶原蛋白的谷氨酰胺转氨酶加入步骤（c）制备的混合溶液中，完全溶解后，在4℃静止交联24 h，得到类人胶原蛋白软骨支架；

步骤（e）:将步骤（d）中所得软骨支架在无热原水中洗涤72h除去交联剂和致孔剂，真空冷冻干燥，Co60照射灭菌得到组织工程软骨支架。

实施例2：

步骤（a）：称取牛血清白蛋白溶于5 mL双蒸水中得到质量分数为5%的牛血清白蛋白溶液；

步骤（b）：类人胶原蛋白溶于步骤（a）的牛血清白蛋白溶液中，使其浓度为15%；

步骤（c）：将步骤（b）制备的蛋白混合溶液置于37℃条件下使其完全溶解，加入浓度为1% NaCl，搅拌使其完全溶解；

步骤（d）：将含量为80 U/g胶原蛋白的谷氨酰胺转氨酶加入步骤（c）制备的混合溶液中，完全溶解后，在4℃静止交联24 h，得到类人胶原蛋白软骨支架；

实施例3：

步骤（a）：称取白蛋白溶于5 mL双蒸水中得到质量分数为10%的白蛋白溶液；

步骤（b）：类人胶原蛋白溶于步骤（a）的大豆蛋白溶液中，使其浓度为10%；

步骤（c）：将步骤（b）制备的蛋白混合溶液置于37℃条件下使其完全溶解，加入浓度为2.5% NaCl，搅拌使其完全溶解；

步骤（d）：将含量为50 U/g胶原蛋白的谷氨酰胺转氨酶加入步骤（c）制备的混合溶液中，完全溶解后，在14℃下静止交联14 h，得到类人胶原蛋白软骨支架；

实施例4：

步骤（a）：称取牛血清白蛋白溶于5 mL双蒸水中得到质量分数为15%的牛血清白蛋白溶液；

步骤（b）：类人胶原蛋白溶于步骤（a）的牛血清白蛋白溶液中，使其浓度为5%；

步骤（d）：将含量为20 U/g胶原蛋白的谷氨酰胺转氨酶加入步骤（c）制备的混合溶液中，完全溶解后，在25℃下静止交联4 h，得到类人胶原蛋白软骨支架。

本发明所采用的原料均为纯天然材料，生物相容性好、安全无毒、免疫原性低。类人胶原蛋白模拟人体细胞外基质环境的，具有很高的生物学活性，能够使细胞粘附，迁移和分化。本发明所制备的组织工程软骨支架具有高贯通性的三维多孔结构，有利于软骨细胞的增殖和粘附，可作为生物医用材料，所述组织工程软骨支架经过大鼠关节软骨细胞RCCS-1培养，可使得软骨细胞RCCS-1生长良好。

配合图3至图8所示，对上述本发明的实施例1中制备的类人胶原蛋白软骨支架的各项性能参数进行测定，检测的项目主要包括孔隙率、溶胀率、压缩力学性能、微观结构、细胞毒性、细胞粘附和新西兰兔膝关节软骨缺损修复。

1、本发明的组织工程软骨支架的孔隙率的检测。

用无水乙醇测定组织工程软骨支架的孔隙率，在10 ml的离心管内加满无水乙醇，称其质量为W₁，放入质量为W_s的软骨支架，真空泵抽滤离心管，使乙醇充满软骨支架的孔隙，接着再次加满乙醇，记质量为W₂，取出支架，称量余下的质量为W₃，（W₁-W₃）为组织工程软骨支架总质量，（W₂-W₃-W_s）为孔隙中乙醇的质量，比值即为孔隙率。

经测定本发明的组织工程软骨支架的孔隙率均为90%以上，这表明细胞生存环境的比表面积较大，为细胞的分布和生长提供了充足的空间。

2、本发明的组织工程软骨支架的溶胀率的检测。

在37℃的超纯水中测定组织工程软骨支架的溶胀率。称取冷冻干燥后的软骨支架，其质量记为M₀。将软骨支架浸入超纯水中并在设定时间点取出，用滤纸擦去软骨支架表面的水后，称重并记为M₁。（M₁-M₀）为支架吸水后的质量，M₀为支架的干重，比值即为溶胀率。

如图3所示，本发明的组织工程软骨支架的溶胀率为300-400%，并且该支架具有快速吸水的能力，在5min之内就能达到溶胀平衡。

3、本发明的组织工程软骨支架的压缩力学性能的检测。

本发明的组织工程软骨支架压缩力学性能检测方法：将本发明的组织工程软骨支架制成直径为15mm、高度为10mm的圆柱状，以10mm/min 的速度对组织工程软骨支架进行压缩。

如图4所示，本发明的组织工程软骨支架可以压缩至80%，其弹性模量大于2MPa，该软骨支架的机械性能完全符合人体的需求。

4、本发明的组织工程软骨支架的内部结构的检测。

该组织工程软骨支架表面喷金在电子显微镜下观察孔径，检测本发明的组织工程软骨支架的孔径为100-300μm。

如图5所示，本发明的组织工程软骨支架具有高度贯通的三维多孔结构，孔径大小适宜，有利于细胞的粘附、增长、迁移以及细胞外基质的沉积，同时有利于营养和氧气的进入以及代谢产物的排出。

4、本发明的组织工程软骨支架的细胞毒性的检测。

按照 GB/T16886.5-2003（《医疗器械生物学评价第 5 部分：体外细胞毒性试验》）中规定的试验方法进行试验。

如图6所示，本发明的组织工程软骨支架的细胞毒性为0级，并且软骨细胞RCCS-1在支架浸提液中显著增殖，培养七天后，细胞存活率大于110%，表明该材料对细胞生长有明显的促进作用。

5、本发明的组织工程软骨支架的细胞粘附的检测。

将灭菌的组织工程软骨支架浸泡在DMEM高糖培养基中。然后，将饱和的软骨支架置于24孔板中，将含有2×10⁴个软骨细胞（RCCS-1）的200μL细胞悬液滴在每个软骨支架上，培养2-3h待细胞贴壁后，向每个孔中加入1mL新鲜的DMEM高糖培养基，将细胞粘附的软骨支架在培养箱中培养1、3、5和7天，每天更换培养基。通过活死细胞染色法评估在软骨细胞在支架上的粘附情况，使用荧光显微镜观察活细胞/死细胞并成像。

如图7所示，本发明的组织工程软骨支架具有多孔结构，细胞良好粘附在支架的孔壁上，且细胞活力良好基本没有死细胞（红色）。从图中也可以看出细胞在支架上显著增殖，培养七天后，支架表面长满了软骨细胞，并且图像中远处的细胞模糊也说明了支架的三维立体结构，支架内部也有细胞的粘附。

6、本发明的组织工程软骨支架对新西兰兔膝关节软骨缺损的修复。

将新西兰大白兔全身麻醉，使用牙科打磨机在兔子的左腿的滑车槽中打磨出软骨缺损（直径4.0mm，深度4.0mm），然后将和缺损同样大小的软骨支架植入缺损中，将兔子随机分为2组：支架组，对照组（仅缺损）。手术后12周将兔子安乐死。

如图8所示，对照组的缺损未被填充，而支架组的缺损被均匀的软骨样组织填平，新生组织与周围正常软骨连接良好只留下一圈模糊的边界，表明该组织工程软骨支架对软骨缺损有良好的修复作用。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

将胶原蛋白和球状蛋白溶于双蒸水中后，加入NaCl和谷氨酰胺转氨酶最终制得组织工程软骨修复支架；

其中，球状蛋白和NaCl为致孔剂，谷氨酰胺转氨酶为交联剂；

包括以下步骤：

步骤（d）：将谷氨酰胺转氨酶加入步骤（c）制备的混合溶液中，谷氨酰胺转氨酶加量为20-80 U/g胶原蛋白，完全溶解后静止交联，得到胶原蛋白软骨修复支架；

步骤（e）:将步骤（d）中所得软骨支架在无热原水中洗涤除去交联剂和致孔剂，干燥灭菌得到组织工程软骨修复支架。

2.根据权利要求1所述的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

步骤（a）中，球状蛋白为大豆蛋白或牛血清白蛋白。

3.根据权利要求2所述的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

4.根据权利要求3所述的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

步骤（d）中，静止交联4-24h，交联温度为4℃-25℃。

5.根据权利要求4所述的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征在于：

步骤（e）中，软骨修复支架在无热原水中的洗涤时间为72h，干燥方式为真空冷冻干燥，采用Co60照射灭菌。

6.权利要求5所述的制备方法制得的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架。

7.根据权利要求6所述的球状蛋白作致孔剂的组织工程软骨修复支架，其特征在于：

组织工程软骨修复支架吸水率为 300-400%，孔隙率为 90% 以上，孔径为 100-300μm。