CN114832156B - 一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶 - Google Patents
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- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
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Abstract
本申请公开了一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶。该凝胶的制备方法包括分别配制左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液；取左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液，充分混合，加入醋酸溶液，以形成初步凝胶；将初步凝胶进行冷冻处理，得到最终的凝胶。该凝胶具有优良的力学性能，并且通过凝胶‑软骨细胞复合实验证明其对软骨细胞的生长和代谢具有促进作用，并且还通过动物实验证实了其对小鼠不具有明显免疫毒性作用，具有广泛地应用于医美整形领域的前景。
Description
技术领域
本申请涉及左旋聚乳酸技术领域，尤其涉及一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶。
背景技术
聚乳酸有多个同分异构体，包括左旋聚乳酸(PLLA)、右旋聚乳酸(PDLA)、外消旋聚乳酸(PDLLA)、非旋光性聚乳酸(Meso-PLA)等几种不同的旋光性聚合物，其性能也有差异，其中，左旋聚乳酸(PLLA)是半结晶性的聚合物，结晶度可达到40％以上，熔点Tm约为1701800C，力学强度最大，最高弯曲强度可达350Mpa，超过人体骨骼的弯曲强度。因而，左旋聚乳酸在在软骨、骨、肌腿、皮肤、周围神经、韧带、肝、管状结构等组织工程化研究方面应用极为广泛，例如利用PLLA制备的可降解支架，临床实验表明PLLA材料的力学性能良好；PLLA的网状物中填充自体的骨髓颗粒和海绵状骨，在狗的体内促进了骨的长成；软骨细胞种植在PLLA基体内植入鼠体内，长成了软骨组织。
然而，单一的左旋聚合物结晶度较高，聚乳酸材料疏水，其呈酸性的降解产物容易产生无菌性炎症反应，对细胞的也会产生产生不利影响，限制了聚乳酸在临床研究方面的广泛使用。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在对现有的左旋聚乳酸进行改性，以在对机体的炎症反应、免疫毒性并能够促进机体相关细胞的正常生长和代谢方法等至少之一方面取得一定的改进作用。
第一方面，本申请实施例公开了一种改性左旋聚乳酸凝胶的制备方法，包括以下步骤：
分别配制左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液；
取左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液，充分混合，加入醋酸溶液，以形成初步凝胶；
将所述初步凝胶进行冷冻处理，得到最终的凝胶。
在本申请实施例中，左旋聚乳酸溶液中的溶剂选自四氢呋喃、六氟异丙醇和二甲基亚砜中的一种，聚谷氨酸溶液中的溶剂选自四氢呋喃、三氟乙酸和二甲基亚砜中的一种，维生素P溶液中的溶剂为水。
在本申请实施例中，左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液按照体积比为6:4:1进行混合，于45℃下均匀搅拌直至充分溶解。
在本申请实施例中，加入的醋酸溶液浓度为0.02M，加入体积量与维生素P溶液的加入量相同。
在本申请实施例中，醋酸溶液的加入速率为0.2mL/min。
在本申请实施例中，左旋聚乳酸溶液中左旋聚乳酸的质量浓度为2.5～7wt％，聚谷氨酸溶液中聚谷氨酸的质量浓度为2.0～6.0wt％。
在本申请实施例中，冷冻处理包括：
将上述制备得到的初步凝胶置于-20℃下冷冻12h，经冷冻干燥后，置于蒸馏水中洗涤至中性，再经冷冻干燥得到最终的凝胶。
第二方面，本申请实施例公开了所述的制备方法得到的改性左旋聚乳酸凝胶。
第三方面，本申请实施例公开了一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸，包括所述的改性左旋聚乳酸凝胶。
第四方面，本申请实施例公开了所述的改性左旋聚乳酸凝胶在制备医用的整形制品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请公开了一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸，其通过性能分析具有优良的力学性能，并且通过凝胶-软骨细胞复合实验证明其对软骨细胞的生长和代谢具有促进作用，并且还通过动物实验证实了其对小鼠不具有明显免疫毒性作用，具有广泛地应用于医美整形领域的前景。
附图说明
图1为本申请实施例1提供的改性左旋聚乳酸凝胶的微观图。
图2为本申请对比例1提供的改性左旋聚乳酸凝胶的微观图。
图3为本申请对比例2提供的改性左旋聚乳酸凝胶的微观图。
图4为本申请对比例3提供的改性左旋聚乳酸凝胶的微观图。
图5为本申请实施例1提供的改性左旋聚乳酸凝胶-细胞复合物的激光共聚焦微观图。
图6为本申请对比例1提供的改性左旋聚乳酸凝胶-细胞复合物的激光共聚焦微观图。
图7为本申请实施例1提供的改性左旋聚乳酸凝胶-细胞复合物纵断面的HE染色图。
图8为本申请对比例1提供的改性左旋聚乳酸凝胶-细胞复合物纵断面的HE染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
为本申请的目的，本申请发明人提供了一种改性左旋聚乳酸凝胶的制备方法，包括以下步骤：分别配制左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液；取左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液，充分混合，加入醋酸溶液，以形成初步凝胶；将所述初步凝胶进行冷冻处理，得到最终的凝胶。
由此得到的改性左旋聚乳酸凝胶，具有优良的力学性能，并且通过凝胶-软骨细胞复合实验证明其对软骨细胞的生长和代谢具有促进作用，并且还通过动物实验证实了其对小鼠不具有明显免疫毒性作用，具有广泛地应用于医美整形领域的前景。
在上述的制备过程中，左旋聚乳酸溶液中的溶剂选自四氢呋喃、六氟异丙醇和二甲基亚砜中的一种，聚谷氨酸溶液中的溶剂选自四氢呋喃、三氟乙酸和二甲基亚砜中的一种，维生素P溶液中的溶剂为水。
在上述的制备过程中，左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液按照体积比为6:4:1进行混合，于45℃下均匀搅拌直至充分溶解。
在上述的制备过程中，加入的醋酸溶液浓度为0.02M，加入体积量与维生素P溶液的加入量相同。
在上述的制备过程中，醋酸溶液的加入速率为0.2mL/min。
在上述的制备过程中，左旋聚乳酸溶液中左旋聚乳酸的质量浓度为2.5～7wt％，聚谷氨酸溶液中聚谷氨酸的质量浓度为2.0～6.0wt％。
在本申请实施例中，冷冻处理包括：将上述制备得到的初步凝胶置于-20℃下冷冻12h，经冷冻干燥后，置于蒸馏水中洗涤至中性，再经冷冻干燥得到最终的凝胶。
下方将结合更加具体的实施例对该左旋聚乳酸凝胶进行详细说明，所涉及的试剂和设备，若无特别说明，均可从商业涂胶获知。
改性左旋聚乳酸凝胶的制备
在本申请实施例中，提供了一种共混左旋聚乳酸(简称为PLLA)的方法。
在一个具体的实施例1中：
配制5.0wt％的左旋聚乳酸(PLLA)溶液，溶剂为四氢呋喃(THF)；配制4.3wt％的聚谷氨酸(简称为γPGA)溶液，溶剂THF；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；
取上述的PLLA溶液、γPGA溶液和VP溶液，按照体积比为6:4:1进行混合，PLLA溶液450ml，γPGA溶液360ml，VP溶液90ml，于45℃下均匀搅拌直至充分溶解，同时加入0.02M的醋酸溶液9ml，迅速混匀后立即停止，室温静置以形成初步凝胶。其中，加入醋酸溶液时应该缓慢滴加，不能过快滴入。本实施例1中，加入醋酸溶液的速率为0.2mL/min。
将上述制备得到的初步凝胶置于-20℃下冷冻12h，再利用冷冻干燥机冻干材料。将冻干后的材料置于蒸馏水中洗涤至中性，而后利用冷冻干燥机再次冻干。
实施例2的制备过程为：
配制5.0wt％的PLLA溶液，溶剂为六氟异丙醇(HFIP)；配制5.0wt％的γPGA溶液，溶剂为三氟乙酸(TFA)；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
实施例3的制备过程为：
配制5.0wt％的PLLA溶液，溶剂为二甲基亚砜(DMSO)；配制5.0wt％的γPGA溶液，溶剂为DMSO；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
实施例4的制备过程为：
配制5.0wt％的PLLA溶液，溶剂为二甲基亚砜(DMSO)；配制5.0wt％的γPGA溶液，溶剂为TFA；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
实施例5的制备过程为：
配制5.0wt％的PLLA溶液，溶剂为THF；配制5.0wt％的γPGA溶液，溶剂为TFA；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
实施例6的制备过程为：
配制2.5wt％的PLLA溶液，溶剂为THF；配制2.0wt％的γPGA溶液，溶剂为TFA；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
实施例7的制备过程为：
配制2.5wt％的PLLA溶液，溶剂为THF；配制2.0wt％的γPGA溶液，溶剂为THF；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
实施例8的制备过程为：
配制7.0wt％的PLLA溶液，溶剂为THF；配制6.0wt％的γPGA溶液，溶剂为TFA；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；其他步骤与实施例1相同。
对比例1的制备过程为：
仅仅配制5.0wt％的左旋聚乳酸(PLLA)溶液，溶剂为四氢呋喃(THF)，充分溶解后，进行冷冻干燥，得到凝胶。
对比例2的制备过程为：
仅仅配制5.0wt％的左旋聚乳酸(PLLA)溶液，溶剂为四氢呋喃(THF)，配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；
将二者按照6:1的体积比混匀后，PLLA溶液450ml，VP溶液90ml，加入0.02M的醋酸溶液9ml，于45℃下均匀搅拌直至充分溶解，同时加入0.02M的醋酸溶液9ml，加入醋酸溶液的速率为0.2mL/min，迅速混匀后立即停止，室温静置以形成初步凝胶。冷冻干燥，得到最终凝胶。
对比例3的制备过程为：
配制7.5wt％的左旋聚乳酸(PLLA)溶液，溶剂为四氢呋喃(THF)；配制6.5wt％的γPGA溶液，溶剂THF；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；后续步骤与实施例1相同。
对比例4的制备过程为：
配制2.0wt％的左旋聚乳酸(PLLA)溶液，溶剂为四氢呋喃(THF)；配制1.5wt％的γPGA溶液，溶剂THF；配制0.5wt％的维生素P(简称为VP)溶液，溶剂为去离子水；后续步骤与实施例1相同。
对比例5的制备过程为：仅在成凝胶过程中未加入醋酸溶液，其他步骤和条件均与实施例1相同。
改性左旋聚乳酸凝胶的性能分析
1、分析方法
1.1、形貌分析
为观察上述各实施例和对比例形成的改性左旋聚乳酸凝胶微观形态，将各凝胶在液氮环境中切割成合适大小的块，再用导电胶将其粘在电镜台上，采用扫描电子显微镜(SEM)对每块凝胶的横截面进行观察，电压为15.0kV。所有电子显微镜样品均进行喷金处理，以增强材料的导电性能。
1.2、机械性能分析
压缩模量：按国家标准UB/T 1041-2008进行压缩模量测试。用电子试验机(QJ211-压缩模量测试仪，上海倾技仪器仪表科技有限公司)测定各实施例和对比例制备得到的改性左旋聚乳酸凝胶的压缩性能，单轴压缩，压缩速率为1mm/min，测试温度为25℃。由应力与形变量的关系曲线得出样品相应的应力应变曲线图，再作曲线拟合，求得直线的斜率，即为样品的压缩模量，多次测量求平均值。
拉伸强度和断裂伸长率：依据国家标准UB/T1040.3-2006进行拉伸强度测试。取各实施例和对比例形成的改性左旋聚乳酸凝胶，分别剪切成0.5mm厚度的条状样品，测定每个样品的厚度和宽度，将其两端固定在强力仪(天津弗洛拉自动化科技有限公司)上。以0.25mm/min的拉伸速度激进行拉伸操作，直至样品断裂，测定出不同样品的拉伸强度(σ)和断裂伸长率(η)。
1.3、吸水率
取干燥的各实施例和对比例形成的改性左旋聚乳酸凝胶，切取成样品块，记录其初始治疗，将其浸泡于装有30mL PBS溶液的离心管中，于37℃烘箱中溶胀24h，对溶胀后的材料进行称重，利用公式(2)对材料的溶胀率进行计算。
吸水率＝(W-W0)/W0×100％，式中，W表示材料在PBS中溶胀24h后的质量，mg；W0表示材料处于干态时的质量，mg。
1.4、体外细胞毒性实验
取干燥的各实施例和对比例形成的改性左旋聚乳酸凝胶，置于平皿中，在超净台内紫外照射灭菌过夜，将凝胶块(约5mL)转移至50mL离心管中，加入15mL备用的DMEM培养基(Gibco，赛默飞)并在细胞培养箱中充分溶胀24h。取上清液，再用0.22μm滤膜过滤除菌，所得滤液即为制备好的浸提液，做好标签，4℃下保存待用。灭菌PBS为实验对照，培养细胞后进行MTT检测。利用MTT法检测细胞活性，所得实验组吸光值与空白组吸光值百分比(RGR值)，该值反映了细胞存活率，参照国家标准GB/T16886.5-2003细胞毒性分级，当RGR值>75％时，细胞毒性等级为一级，待测样品对细胞的毒性认为符合要求，可进行相关的应用。
1.5、凝胶接种细胞
将凝胶剪成我们所需要的大小和形状，放入超净工作台中用紫外线分别消毒正反面各30min，再将其放入医用酒精中消毒30min，取出凝胶，使用PBS溶液清洗3次，每次5min。然后将凝胶放入对应大小的细胞培养板中，加入细胞培养液(DMEM/F12细胞培养液，含15％FBS、100units/mL青霉素和100mg/mL链霉素，Gibco，赛默飞)浸没凝胶，放入37℃细胞培养箱中过夜，次日上午吸走细胞培养液，并用无菌吸水纸吸尽凝胶上的液体，再次放入37℃细胞培养箱中微干燥l h。
取第二代软骨细胞(普诺赛)制备成合适密度的细胞悬液，细胞浓度不低于5×105个/mL)，接种在孔板中的凝胶上，放入细胞培养箱中孵育2h，然后加入DMEM/F12细胞培养液至完全没过细胞-凝胶复合物表面，继续放入细胞培养箱中培养，每隔2-3天换液。
1.6、细胞-凝胶复合物的观察
分别在培养1天和7天时，取出部分细胞-凝胶复合物作为观察样品。将样品用PBS溶液清洗后，混入至2.5wt％的戊二醛溶液中，于4℃环境中处理24h后，再用1wt％的饿酸4℃下处理30min，再经PBS溶液清洗，依次用梯度酒精脱水(30％,50％,70％,80％,90％,95％,100％,100％)，真空干燥箱37℃下干燥过夜，喷金，扫描电镜观察，包括对凝胶在接种细胞前的微观观察。
同时，分别在培养1天和7天时，取出部分细胞-凝胶复合物，用PBS溶液清洗后，4％的多聚甲醛室温下固定20min，去掉固定液，加入5μg/mL的DAPI溶液，室温下避光染色2min，分别采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察凝胶表面的细胞。
培养14天后，取部分细胞-凝胶复合物，依次进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精及伊红染色、脱水、透明、封片，从纵断面方向观察细胞-凝胶复合物。
1.7、生物化学定量分析
软骨细胞-凝胶实验：
取50μL密度为5×106/mL的软骨细胞悬液，接种至含有上述各实施例和对比例制备的凝胶的24孔培养板中凝胶中(每组设置5个重复)。本实验采用组织培养板表面作为阳性对照组，组织培养板表面(Tissue culture plate surface,TCPS)经过处理后使其具备合适的亲水性能，从而更有利于细胞的粘附增殖，通常情况下作为阳性对照组。各细胞组分别培养21天后，取出部分细胞-凝胶复合物，PBS溶液清洗，将复合物剪成碎片，加入lml的木瓜蛋白酶消化液(l0μg/ml，含木瓜蛋白酶0.5g、半肤氨酸0.039g、磷酸氢二钠1.79g，EDTA0.093g、加PBS补至50m1)，放入恒温摇床中65℃下消化16h，吹打均匀，离心取上清，作用待测样品。
细胞糖胺多糖(GAG)的定量检测：使用二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法来检测不同各组细胞实验的培养细胞中GAG含量。取待测样品，每孔25mL，再向每孔中加入125mL DMMB溶液(含26.25mg/mL DMMB、2.5g/mL甲酸钠、1.25v/v％无水乙醇的水溶液，pH值＝3.5)，使用酶标仪在595nm处测量其吸光度值。采用6-硫酸软骨素作为标准品绘制标准曲线。
胶原的定量检测：通过检测样品中羟脯氨酸的含量来检测其总胶原的含量。取50μL待测样品加入至清洁的冻存管中，按1:1体积比加入1M盐酸溶液50μL，盖紧管盖，在120℃下水解30min后取出冻存管，向其中加入50μL氯胺-T溶液(含14.1mg/mL氯胺-T、26v/v％异丙醇的pH＝6.5的冰醋酸-柠檬酸盐缓冲液)，混匀，室温反应15min，再加入2,2-二羟甲基丁酸(简称为p-DMBA)溶液(将0.7g p-DMBA溶于3.5m1正丙醇中，再加入1.5m1高氯酸混匀配制可得)50mL，37℃下反应30min，在550nm处使用酶标仪测量其吸光度值。以4-羟基脯氨酸为标准品绘制标准曲线。
骨钙素(BGP)的定量检测：使用BGP酶联免疫分析试剂盒(上海心语生物科技有限公司)检测待测样品中BGP的含量。
脱氧吡啶啉酶(D-Pyd)的含量检测：D-Pyd酶联免疫分析试剂盒(赛默飞)检测待测样品中D-Pyd的含量。
1.8、RT-PCR检测软骨细胞相关基因表达
采用PLLA和空白的TCPS作为对照组。取50mL上述各自细胞悬浮液，采用trizol法提取RNA，并将RNA逆转录为cDNA，以管家基因GAPDH为内参基因，采用Real-TimePCR检测I型胶原(COL1A2)、骨钙素(BGP)、炎症因子(COX-2)、基质分解代谢基因(MMP-3)、抗分解代谢基因(TIMP-1)、sox-9、促合成代谢基因(aggrecan)的相对表达水平。
具体实验步骤如下：
1)提取总RNA
取上述样品液，采用Invitrogen Ambionrna提取试剂盒(赛默飞)，按照其说明书进行总RNA提取。
2)逆转录体系:
第一体系：总体积为5μL：RNA lμg、引物lμL、DEPC水补齐至5μL，总体积5μL；将第一体系在70℃下水浴5min，再冰浴5min；
第二体系：总体积为15μL：5×buffer 4μL、MgCl2 2.4μL、dNTP lμL、逆转录酶lμl、DEPC水6.6μL
再分别将15μL的第二体系和冰浴后的5μL第一体系混合，进行逆转录。
逆转录条件：25℃5min，42℃60min，70℃15min；将得到的20μL逆转录产物中加入80μL DEPC水稀释，然后测量cDNA浓度。
3)RT-PCR体系
总体积25μL：引物3μL(上下游引物各1.5μL)，cDNA 3μL，SYBR试剂12.5μL，水6.5μL。
Real-Time PCR条件：95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火10s,72℃延伸20s,45个循环后，72℃完全延伸5min，降至室温25℃。从Real-Time PCR仪上获得扩增曲线和溶解曲线，读取各样品的Ct值，采用2-ΔΔCt方法来分析各基因表达的相对倍数(以TCPS对照组为1)。
引物依次为：GAPDH-F:atggtgaaggtcggagtgaa，如SEQ ID NO.1所示；GAPDH-R:cgtgggtggaatcatactgg，如SEQ ID NO.2所示；
COL1A2-F:ggcaacagcaggttcactta，如SEQ ID NO.3所示；COL1A2-R:ggcaaacgagatggcttatt，如SEQ ID NO.4所示；
BGP-F:cggaattctacctggatcctgggctgg，如SEQ ID NO.5所示；BGP-R:atttgcggccgcgtggtggtggtggtggtgc，如SEQ ID NO.6所示；
COX-2-F:cacgcaggtggagatgatctac，如SEQ ID NO.7所示；COX-2-R:caggcaccagaccaaagactt，如SEQ ID NO.8所示；
MMP-3-F:agccaatggaaatgaaaactcttc，如SEQ ID NO.9所示；MMP-3-R:ccagtggataggctgagcaaa，如SEQ ID NO.10所示；
TIMP-1-F:agcagagcctgcacctgtgt，如SEQ ID NO.11所示；TIMP-1-R:ccacaaacttggccctgatg，如SEQ ID NO.12所示；
AGGRECAN-F:aggtctcgctgcccaacta，如SEQ ID NO.13所示；AGGRECAN-R:gtagcctcgctgtcctcaag，如SEQ ID NO.14所示；
SOX-9-F:gggaagctctggagactgct，如SEQ ID NO.15所示；SOX-9-R:tgtagtccgggtggtctttc，如SEQ ID NO.16所示。
1.9、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较。
2、结果
表1机械性能
| 实施方式 | 压缩模量(MPa) | 拉伸强度(MPa) | 断裂伸长率(％) |
| 实施例1 | 3.24±0.21b | 0.38±0.12ab | 57.35±0.62a |
| 实施例2 | 3.53±0.18b | 0.41±0.08a | 58.72±0.35a |
| 实施例3 | 3.72±0.09ab | 0.37±0.11ab | 57.96±0.48a |
| 实施例4 | 3.83±0.14ab | 0.42±0.05a | 59.28±0.36a |
| 实施例5 | 4.13±0.07a | 0.42±0.08a | 60.17±0.23a |
| 实施例6 | 3.98±0.04ab | 0.43±0.11a | 58.43±0.74a |
| 实施例7 | 3.92±0.13ab | 0.41±0.07a | 53.26±0.47b |
| 实施例8 | 3.78±0.24ab | 0.36±0.05ab | 54.17±0.29b |
| 对比例1 | 1.65±0.15c | 0.17±0.04d | 13.84±0.37c |
| 对比例2 | 1.71±0.12c | 0.13±0.02d | 12.28±0.24c |
| 对比例3 | 1.69±0.23c | 0.18±0.05d | 13.37±0.32c |
| 对比例4 | 1.84±0.22c | 0.23±0.07c | 12.46±0.33c |
| 对比例5 | 1.78±0.20c | 0.38±0.12ab | 12.61±0.35c |
表1列出了上述实施例1-8和对比例1-5制备的改性左旋聚乳酸凝胶的机械性能。实施例1-8的压缩模量显著高于对比例1-5，其拉伸强度和断裂伸长率亦分别显著高于对比例1-5。由此表明，本申请实施例制备的改性左旋聚乳酸凝胶具有更佳的机械性能。而这得益于实施例1-8在制备的改性左旋聚乳酸凝胶中添加γPGA，并且合理控制了PLLA和γPGA，以及在成胶过程中使用了醋酸缓慢成胶。
图1-4示出了实施例1、对比例1-3制备的左旋聚乳酸凝胶的微观结构，应条件下所制备的多孔凝胶的孔结构清楚可见，而其中实施例1的凝胶内部孔道较大，孔径大小较均匀，孔壁较薄，孔数量较多，而对比例1-3的凝胶结构复杂，孔道较小。
表2
表2列出了上述各实施例和对比例制备的改性左旋聚乳酸凝胶的吸水率和RGR值。这些凝胶RGR值均大于75％，符合国家标准GB/T16886.5-2003细胞毒性的要求，具有应用于医用填充物的前景。另外，实施例1-8制备的改性左旋聚乳酸凝胶具有更高的吸水率，表面其内部具有更过的空间间隙，这通过对其细胞-凝胶复合物的微观结构的观察也可得知。这对于其作为填充物或植入体时提供更过空间容纳被植入细胞体以及组织液作为其生长及与机体进行充分融合的基础。图5、6示出了实施例1和对比例1对应的改性左旋聚乳酸凝胶与软骨细胞培养21天后的激光共聚焦显微图，图中两点为软骨细胞，可见图5中的软骨细胞生存较大，粘附更多，生存情况由于图6中的软骨细胞。
图7、8分别示出了实施例1和对比例1的凝胶-细胞的纵断面微观图。图7中的细胞有部分深入至凝胶深处，而图8中的细胞主要停留在凝胶表面，由此可见，实施例1制备的左旋改性聚乳酸凝胶更利于软骨细胞的粘附和深入凝胶内部，以获得其与凝胶的融合和生长。
表3
| 实施方式 | 胶原(μg/L) | GAG(μg/L) | BGP(ng/L) | D-Pyd(ng/L) |
| 实施例1 | 24.67±3.14b | 59.48±2.32b | 72.45±4.68a | 68.56±3.45a |
| 实施例2 | 23.48±2.75b | 62.12±1.84a | 72.36±2.47a | 71.18±2.78a |
| 实施例3 | 24.35±2.29b | 60.23±1.68b | 73.61±1.59a | 69.12±1.62a |
| 实施例4 | 25.14±3.68a | 61.82±2.45ab | 72.72±2.43a | 72.23±1.24a |
| 实施例5 | 24.53±2.65b | 64.25±1.63a | 72.33±2.16a | 67.35±2.01a |
| 实施例6 | 26.12±1.85a | 62.17±1.85a | 72.68±2.01a | 69.34±1.82a |
| 实施例7 | 25.42±2.10a | 61.25±2.16ab | 71.08±2.01a | 67.12±2.04a |
| 实施例8 | 25.24±2.61a | 61.11±1.34ab | 71.36±1.52a | 68.13±1.68a |
| 对比例1 | 13.65±2.02c | 46.27±1.02c | 33.62±2.17c | 54.12±1.72b |
| 对比例2 | 12.51±1.73d | 44.35±2.17d | 32.47±1.36c | 53.02±1.46b |
| 对比例3 | 12.29±1.61d | 44.24±2.06d | 34.68±2.39c | 55.21±1.77b |
| 对比例4 | 12.37±2.01d | 44.37±1.84d | 35.68±6.17c | 56.07±2.02b |
| 对比例5 | 13.16±1.72c | 42.75±1.63e | 38.15±2.64b | 55.03±1.86b |
表3列出了各实施例1-8和对比例1-5制备的改性左旋聚乳酸凝胶进行细胞-凝胶复合物的培养实验后，得到软骨细胞悬液中胶原、GAG、BGP和D-Pyd的含量。由表3可知，软骨细胞在各实施例1-8和对比例制备的左旋聚乳酸凝胶上均分泌了胶原蛋白，并且在培养21天后，实施例1-8对应的组别得到的软骨细胞悬液中胶原含量显著高于对比例1-5，其GAG、BGP和D-Pyd的含量亦显著高于对比例1-5。胶原含量增加，表明该软骨细胞具有分化趋势，其在该左旋聚乳酸凝胶上具有正常分化功能。GAG的分泌表明该软骨细胞具有良好的粘附性能，使得其能够与该左旋聚乳酸凝胶充分粘附和融合。
骨钙素(BGP)是由成骨细胞产生和分泌的，是骨转换在吸收和形成偶联时的有效标记，其含量是反映骨代谢状态。由表3结果可知，实施例1-8对应的凝胶-软骨细胞实验后的细胞悬液BGP含量显著高于对比例，表明其凝胶上的软骨细胞具有更大的成骨趋势，其生长和分化活性更高。
D-Pyd是胶原连接键的衍生物，是骨和软骨胶原的特异指标，反映骨基质的吸收程度，广泛存在于骨组织的COL1中。上述表3结果表明，实施例1-8制备的左旋聚乳酸凝胶更加有利于软骨细胞在其上生长和分化，使得其分泌更多的D-Pyd。
表4相对表达倍数(1)
| 实施方式 | COL1A2 | BGP | COX-2 | MMP-3 |
| 实施例1 | 2.02±0.36b | 1.12±0.05b | 0.48±0.06bc | 1.68±0.14b |
| 实施例2 | 2.16±0.32b | 1.23±0.07b | 0.45±0.04c | 1.72±0.06ab |
| 实施例3 | 2.63±0.12ab | 1.36±0.11a | 0.55±0.07b | 1.82±0.17a |
| 实施例4 | 2.79±0.24a | 1.26±0.07b | 0.49±0.03bc | 1.77±0.11ab |
| 实施例5 | 2.84±0.17a | 1.32±0.14ab | 0.53±0.07b | 1.92±0.23a |
| 实施例6 | 3.08±0.23a | 1.45±0.08a | 0.48±0.06bc | 1.89±0.16a |
| 实施例7 | 2.91±0.14a | 1.42±0.03a | 0.52±0.04b | 1.87±0.17a |
| 实施例8 | 2.86±0.22a | 1.36±0.02a | 0.46±0.08c | 1.79±0.13ab |
| 对比例1 | 2.01±0.24b | 0.62±0.12c | 0.96±0.12a | 0.82±0.06c |
| 对比例2 | 2.06±0.31b | 0.58±0.07c | 0.98±0.06a | 0.75±0.13cd |
| 对比例3 | 2.07±0.19b | 0.54±0.09c | 1.05±0.07a | 0.71±0.11cd |
| 对比例4 | 2.05±0.23b | 0.58±0.13c | 0.94±0.04a | 0.64±0.26d |
| 对比例5 | 2.08±0.21b | 0.61±0.08c | 0.97±0.02a | 0.73±0.08cd |
表5相对表达倍数(2)
| 实施方式 | TIMP-1 | sox-9 | aggrecan |
| 实施例1 | 2.12±0.14a | 1.92±0.53b | 1.68±0.14a |
| 实施例2 | 2.07±0.08b | 1.97±0.26b | 1.72±0.06a |
| 实施例3 | 2.11±0.12a | 2.13±0.17ab | 1.67±0.08a |
| 实施例4 | 2.09±0.07b | 2.09±0.24ab | 1.58±0.11b |
| 实施例5 | 2.06±0.05b | 2.24±0.21a | 1.61±0.08a |
| 实施例6 | 2.24±0.17a | 2.35±0.16a | 1.67±0.15a |
| 实施例7 | 2.13±0.08a | 2.23±0.24a | 1.64±0.09a |
| 实施例8 | 2.03±0.15b | 2.18±0.13ab | 1.57±0.02b |
| 对比例1 | 0.75±0.32c | 0.67±0.32c | 0.82±0.02c |
| 对比例2 | 0.71±0.18c | 0.70±0.23c | 0.79±0.06c |
| 对比例3 | 0.68±0.06c | 0.65±0.17c | 0.83±0.04c |
| 对比例4 | 0.73±0.13c | 0.64±0.13c | 0.85±0.01c |
| 对比例5 | 0.67±0.09c | 0.62±0.06c | 0.87±0.03c |
表4和表5列出了上述凝胶-软骨细胞复合实验后的细胞悬液中相关基因的表达情况，其中各组数据为使用GAPDH标准化之后的相对倍数。
其中，实施例1-8对应的检测I型胶原基因(COL1A2)、骨钙素基因(BGP)、基质分解代谢基因(MMP-3)、抗分解代谢基因(TIMP-1)、sox-9和促合成代谢基因(aggrecan)的表达水平显著高于对比例1-5，而炎症因子基因的表达水平显著低于对比例1-5。I型胶原、骨钙素基因的表达情况与上述表3的结果相吻合，表明本申请提供的改性左旋聚乳酸凝胶对软骨细胞的生长和分化具有促进作用。
其中，炎症因子基因(COX-2)的表达下调，而sox-9表达得到了促进，这表明生长子上述实施例制备的改性左旋聚乳酸凝胶上的软骨细胞并未出现异常炎症发生，细胞生正常。
MMP-3是最重要的基质金属蛋白酶之一，具有强大的分解基质的功能，主要通过改善骨质细胞中蛋白多糖、胶原和弹性蛋白等生物大分子的结构、功能及含量，从而在椎间盘退变过程中起重要作用。TIMP-1是MMP-3的特异性抑制因子，可特异性地与MMP-3催化中心的锌离子结合，从而封闭其催化活性，使有活性的MMP-3失活，或僻角L于活性的MMP-3激活。实施例1-8对应的软骨细胞中MMP-3和TIMP-1的表达水平均显著高于对比例1-5，表明其对应的软骨细胞在制备的改性左旋聚乳酸凝胶上代谢活性被激发，并且产生基质合成与分解代谢失衡。其促合成代谢基因(aggrecan)的表达水平高于对比例1-5亦能延伸实施例1-8对应的软骨细胞的合成代谢得到促进。
动物实验
1、材料与方法
1.1、实验动物
SPF级6～8周的雌性Balb/c小鼠(江苏艾菱菲)，体重为20±2g，在恒温22℃、相对湿度65％～70％、光照周期12h:12h，自由进食标准颗粒型动物饲料，饮自来水，适应饲养1周后开始实验。
1.2、实验分组：
将上述小鼠随机分成5组，10只l组，进行凝胶植入实验，所用凝胶为上述各实施例和对比例制备的凝胶。具体为：
阴性对照组：除不植入凝胶外，其他操作与凝胶植入组相同；
凝胶植入组：植入剂量为住0.6mL/只，植入时在小鼠背部右下1/4处皮下往射生理盐水稀释10倍的0.2肠利多卡因约0.1mL/只；然后用髂骨穿刺针在小鼠背部右下约1/4处穿刺，在髂骨穿刺针上接预先装入凝胶的1mL注射器按所需剂量将凝胶推注入小鼠皮下。
阳性对照组：按照上述同样方法皮下注射0.6mL/只BSA与弗氏完全佐剂1:1混匀的乳液，14天后同样方法加强免疫一次，第一次免疫24天后用不含弗氏完全佐剂2mg/mL的BSA溶液注射0.1mL/只再免疫一次。
材料植入后当天对小鼠称重，此后每周观察称重，材料植入2个月后对小鼠进行处理，处理步骤如下：
1.3、血清学检测
眼眶采集小鼠外周血20μL，用2mL 0.65％的生物盐水稀释后，在血球分析仪上检测，进行血清学检测。血清学检测涉及对RBC、HGB、PLT、WBC、LYM和NEUT的检测。
1.4、体液免疫功能检测
血清样本制备：将各组小鼠材料植入2个月后摘除眼球，收集血液至1.5mL，室温静置至血清析出，3000rpm离心10min，待用；采用IgG和IgM ELISA试剂盒(Abcam中国)进行血清检测，具体参照其试剂盒说明书进行。
1.5、NK细胞活性检测
脾淋巴细胞悬液的制备：各组小鼠拉颈处死，于超净台用无菌眼科剪剪开小鼠腹腔，用无菌镊子剥离并取出小鼠脾脏，放入无菌平皿中。在平皿中倒入少虽1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司)，用一次性注射器的活塞研磨脾脏，反复移行使脾细胞分离；再用1640培养液冲洗，收集冲洗液并转移至无菌离心管中；2000rpm离心5min，弃上清，用红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)重悬沉淀，并反应1min，加入1640培养液10mL终止反应；2000rpm离心5min，弃上清，加入1640培养液重悬，即可得到脾淋巴细胞悬液。
脾细胞悬液样本离心去除培养基，用Lysing Solution重悬细胞后，3000rpm离心5min，离心后弃上清，用Cell Staining Buffer(BioLegend公司)调节脾淋巴细胞浓度至1×106个/mL。按照流式抗体说明书推荐使用里向流式管中加入相应标记杭体与脾细胞悬液充分混合均匀：空白对照加入与检测抗体同体积的PBS；同型对照管CD3 FITC/IgG1 PE/IgG2a APC混合；检测管CD3 FITC/CD69 PE/CD49b APC，抗体按照上述设置的混合项，配制成10uL的抗体混合体系加入流式管中与脾淋巴细胞混合，室温避光反应30min后，各管分别加入2mL Cell Staining Buffer重悬细胞，3000rpm离心5min，弃除上清，各管继续加入0.5mL Cell Staining Buffer，重悬细胞，在流式细胞以上上机检测。
1.6、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较。
2、结果
表6血清学检测结果(1)
表7血清学检测结果(2)
由表6、7可知，凝胶植入组中的实施例1-8的小鼠在实验2个月后，血清学参数并未相对于阴性对照组有显著差异，而凝胶植入组中的对比例1-5对应的小鼠有些血清学参数发生了显著差异。具体的，对比例1-5对应小鼠的RBC相对于阴性对照组升高，HGBC相对于阴性对照组降低，PLT相对于阴性对照组降低，WBC相对于阴性对照组升高，LYM相对于阴性对照组升高，NEUT相对于阴性对照组升高，这表明对比例1-5制备的凝胶在小鼠体内引起了其炎症反应。
表8体液免疫功能检测结果
表8可知，凝胶植入组中的小鼠在实验2个月后，血清总IgG和IgM相对于阴性对照组均无明显变化。
表9NK细胞和NK-T细胞以及其活化群数
表9列出了各组小鼠脾淋巴中NK和NK-T细胞数及其活化的百分比。凝胶植入组对应的小鼠脾淋巴中NK细胞数与阴性对照组无显著差异。但是，凝胶植入组中实施例1-8对应的小鼠脾淋巴中活化的NK、NK-T细胞及活化的NK-T细胞数均显著高于阴性对照组，亦显著高于对比例1-5对应的数值。
NK及NK-T细胞的活化受多种信号的影响，其活化可表现出多种生物学功能。NK细胞除能杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞、真菌和胞内寄生菌等，还具有免疫调节功能，对巨噬细胞和CTL有调节作用，在固有免疫网络中占重要作用。NK-T细胞具有免疫调节和细胞毒作用，其活化后可分泌多种细胞因子和趋化因子调节免疫功能。由上述结论可知，硅橡实施例1-8对应的小鼠脾淋巴活化NK细胞和活化NK-T细胞数都高于阴性对照组，上述的凝胶植入组小鼠的某些免疫功能处于活化状态。
由上述动物实验的结果表明，小鼠在植入各实施例和对比例制备的凝胶后，其血项并未出现明显异常，也未出现体液免疫的反应，而仅仅小鼠脾淋巴中NK和NK-T细胞数的活化得到促进，可见小鼠的一些免疫功能得到激活，可能与其植入异物有关，但总体均未对小鼠产生明显的免疫毒性。本申请制备的改性左旋聚乳酸凝胶具有发展成为整形的医用填充物的应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 宁波格鲁康生物科技有限公司
<120> 一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggtgaagg tcggagtgaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgtgggtgga atcatactgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggcaacagca ggttcactta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggcaaacgag atggcttatt 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cggaattcta cctggatcct gggctgg 27
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atttgcggcc gcgtggtggt ggtggtggtg c 31
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cacgcaggtg gagatgatct ac 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
caggcaccag accaaagact t 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
agccaatgga aatgaaaact cttc 24
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<211> 21
<212> DNA
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ccagtggata ggctgagcaa a 21
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agcagagcct gcacctgtgt 20
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<400> 12
ccacaaactt ggccctgatg 20
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aggtctcgct gcccaacta 19
<210> 14
<211> 20
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<400> 14
gtagcctcgc tgtcctcaag 20
<210> 15
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<212> DNA
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<400> 15
gggaagctct ggagactgct 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tgtagtccgg gtggtctttc 20
Claims (7)
1.一种改性左旋聚乳酸凝胶的制备方法，包括以下步骤：
分别配制左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液；
取左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液，充分混合，加入醋酸溶液，以形成初步凝胶；
将所述初步凝胶进行冷冻处理，得到最终的凝胶；
其中，左旋聚乳酸溶液、聚谷氨酸溶液和维生素P溶液按照体积比为6:4:1进行混合，于45℃下均匀搅拌直至充分溶解；
其中，加入的醋酸溶液浓度为0.02M，加入体积量与维生素P溶液的加入量相同；
其中，左旋聚乳酸溶液中左旋聚乳酸的质量浓度为2.5~7wt%，聚谷氨酸溶液中聚谷氨酸的质量浓度为2.0~6.0wt%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，左旋聚乳酸溶液中的溶剂选自四氢呋喃、六氟异丙醇和二甲基亚砜中的一种，聚谷氨酸溶液中的溶剂选自四氢呋喃、三氟乙酸和二甲基亚砜中的一种，维生素P溶液中的溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，醋酸溶液的加入速率为0.2mL/min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，冷冻处理包括：
将上述制备得到的初步凝胶置于-20℃下冷冻12h，经冷冻干燥后，置于蒸馏水中洗涤至中性，再经冷冻干燥得到最终的凝胶。
5.权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的改性左旋聚乳酸凝胶。
6.一种新型医美整形填充物，包括权利要求5所述的改性左旋聚乳酸凝胶。
7.权利要求5所述的改性左旋聚乳酸凝胶在制备医用的整形制品中的应用。
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-
2022
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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