CN109072185A - 增强型多能细胞和微血管组织以及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有增强的生物活性的组合物和在治疗疾病或与疾病病况相关的组织损伤和疼痛中的使用方法。

Description

增强型多能细胞和微血管组织以及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年3月2日提交的美国申请第62/302,669号的优先权；其以全文引用的方式并入。

背景技术

干细胞领域已持续数十年快速发展。ED托马斯(ED Thomas)是在1950年代从骨髓移植造血干细胞的移植患者。弗里登施泰因(Friedenstein)首先发现骨髓中也存在间充质干细胞(MSC)。他在公布于西方文献中之前研究所述主题多年(弗里登施泰因AJ等人,正常和经照射小鼠造血器官中的成纤维细胞前体(Fibroblast precursors in normal andirradiated mouse hematopoietic organs.)《实验血液学(Exp Hematol.)》1976年9月；4(5):267-74)。卡普兰(Caplan)显示可以通过选择性吸附至塑料上和选择性条件下的后续培养从骨髓和骨膜获得相对纯的间充质干细胞群体(AI卡普兰等人,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells.)《矫形研究杂志(J Orthop Res.)》1991年9月；9(5):641-50)。在1990年代期间，许多不同小组显示干细胞或祖细胞可以类似方式从例如皮肤、肠、毛囊、肌肉、肝、大脑、胎盘和牙齿的多种组织分离。袁-迪哈尔沃森(Yuan-Di Halvorsen)首先显示脂肪组织含有可以培养并且分化为多个表型的细胞(WO/2001/062901)。所述文献的大部分关注识别和表征干细胞以及控制其分化为各种细胞类型。

不管许多公司30年的工作，还没有能够通过食品和药物管理局(Food and DrugAdministration；FDA)要求的使用MSC的商业产品。已存在使用干细胞的商业产品，但其未经培养。自从1980年代以来已出售使用新鲜骨髓的产品(例如和Cellect^TM)。DR彼得森(DR Peterson)首先显示来自脂肪和其它微血管组织的新鲜细胞可以用于再生骨科组织(美国专利第6,200,606号)。其它人随后显示这些细胞可以用于治疗心脏、瘘、伤口、肾、慢性局部缺血、软骨缺损和许多其它病况。历史上，这些细胞始终用于自体或同基因环境下。

奥西里斯治疗剂公司(Osiris Therapeutics,Inc.)在20年以前显示培养MSC改变其免疫原性。培养过程诱导细胞改变其表面标记物。当这些细胞植入至另一动物中时，其通常不立即被排斥，并且实际上似乎调节宿主的免疫系统以防止排斥反应。不管MSC防止排斥反应的能力，MSC在宿主体内快速消除。通常在植入后三天发现小于1％的注射细胞。不管极大量的工作，仍没有细胞为何死亡或其如何产生有益结果的证明或甚至共识。

因此，所属领域中需要增强多能细胞制备物的活性和使用此类增强的细胞制备物的方法。

发明内容

近来的发展已产生使用干细胞、多能细胞和经分离微血管组织的新方法。研究和临床使用已显示这些细胞和组织可以被干燥且甚至最终灭菌，但仍保留治疗价值。此外，制剂可以在同种异体或甚至异种个体中使用。组合物的一些额外优点包括：(1)减少的免疫反应和减小的排斥反应的可能性；(2)消炎活性；(3)血管形成活性；(4)无菌性；(5)以易于立即使用的形式持续延长时段室温储存的便利性。制造和使用经处理或冷冻保存的微血管组织的方法描述于美国专利第9,044,430号、美国专利公开案2015/0231183和美国专利公开案2016/0015859中，其公开内容全文并入本文中。

本发明提供包含具有增强的生物活性的多能细胞的组合物，以及其制备方法和在治疗或预防多种不同疾病和病况中的用途。

本发明的实施例包含经分离多能细胞、经处理微血管组织、获自或衍生自所述细胞或组织的细胞膜，其中细胞、组织或膜具有血管形成或消炎活性。本发明的实施例包含已暴露于处理的组合物，所述处理通常降低细胞或蛋白质的效能，但出人意料地增强细胞或组织的生物活性。处理包括(但不限于)暴露于辐射、储存于室温下、低氧、暴露于电磁场、超声搅拌、流体剪切力、pH冲击、渗透性冲击、热冲击、长期冷藏和暴露于活性氧类。在特定实施例中，组合物经干燥或冻干。在相关具体实例中，组合物，包括灭菌、干燥或冻干组合物保持可测量生物活性。在某些实施例中，组合物包含赋形剂。

在若干实施例中，本文公开的组合物进一步包含可植入支架或基质，其可以是例如骨源性植入物、支架、多孔可吸收聚合物、水凝胶、包含组织产物的油灰，或缝合线。在特定实施例中，细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入支架或基质的骨骼、肌腱或皮肤接触面上。

在某些实施例中，组合物被调配成用于静脉内施予。但是，其它施用途径可以用于其它实施例中，包括直接施予(施予至组织表面或通过直接注射)、动脉内施用、全身施用等。

在若干实施例中，细胞或组织获自哺乳动物供体，任选地人类。在某些实施例中，细胞包含干细胞或祖细胞。

本发明提供制备包含经处理微血管组织的组合物的方法，其中所述组合物具有增强的生物活性，所述方法包含：解离获自供体哺乳动物的微血管组织样品以产生包含解离的微血管组织的组合物；从包含解离的微血管组织的组合物去除一种或多种组织组分；任选地在灭菌之前或之后干燥或冻干组合物；和在任选的干燥或冻干之前或之后进行处理，其中组合物在处理之后具有增加的效能。在特定实施例中，细胞或组合物未经培养。在特定实施例中，处理步骤包含暴露于辐射、热、渗透性冲击、pH偏移、超声搅拌、过滤、密度梯度分离、低氧、活性氧类和/或电磁场。在某些实施例中，解离或去除包含超声搅拌、过滤或使用密度梯度。在特定实施例中，微血管组织为脂肪源性组织，且所述超声搅拌、过滤或使用密度梯度会从组合物去除脂肪细胞。

在另一相关实施例中，本发明提供治疗哺乳动物的损伤或疾病和/或促进伤口愈合的方法，其包含向哺乳动物提供本发明的组合物或根据本发明的方法制备的组合物。在一些实施例中，局部施用组合物。在特定实施例中，组合物以手术方式植入至哺乳动物中。在某些实施例中，在所述哺乳动物的损伤或疾病部位内或附近植入或注射组合物。在相关实施例中，组合物经静脉内提供至哺乳动物。

在某些实施例中，待治疗的疾病或病况为组织或器官疾病。组织可以是任何组织，如(但不限于)上皮、结缔、肌肉、脂肪或神经。器官可以是任何器官，如(但不限于)消化、呼吸、分泌、内分泌、循环、感觉、生殖和神经器官。这些包括(但不限于)胃、肝、小肠、大肠、直肠、肛门、肺、鼻子、支气管、肾、膀胱、尿道、脑下垂体、肾上腺、甲状腺、胰脏、副甲状腺、前列腺、心脏、血管、脾、皮肤、舌头、眼睛、耳朵、子宫、睾丸、阴茎、卵巢、乳腺、大脑和脊髓。在某些实施例中，疾病或病况为脱发、滑囊炎、腭裂、骨髓炎或外周神经病变。在其它实施例中，疾病或病况为关节活动过度/埃勒斯-当洛斯综合症(Ehlers-Danlos syndrome)、复杂区域疼痛综合症(CRPS)、肌筋膜疼痛综合症、病态牙种植体、培荣尼尔氏病(Peyronie'sdisease)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、自身免疫性肝炎、间质性膀胱炎或苔癣硬化症。

在某些实施例中，损伤存在于软组织中。在特定实施例中，损伤存在于肌腱、韧带、皮肤、骨骼、软骨、椎间盘或微血管组织中。在特定实施例中，损伤或疾病为缺血性损伤、再灌注损伤、微血管损伤或发炎。在某些实施例中，疾病为肌腱病。在某些实施例中，疾病为关节炎，如骨关节炎或类风湿性关节炎。在其它实施例中，疾病为足底筋膜炎。在其它实施例中，疾病为颞下颌关节病症。在其它实施例中，方法包含施予组合物以治疗或预防疤痕。

附图说明

图1显示如通过HUVEC迁移所测量的辐射对经处理微血管组织的生物活性的影响。

图2显示照射对细胞计数的影响。

图3显示如通过HUVEC迁移所测量的储存时间对经处理微血管组织的生物活性的影响。

图4显示如通过HUVEC迁移所测量的储存温度对经处理微血管组织的生物活性的影响。

图5为局灶性线性皮质内髌腱撕裂的治疗前矢状位。

图6为相同髌腱撕裂的注射后28天矢状位。

图7为足底表面上的大面积糖尿病足部溃疡的图像。

图8为在用mVASC治疗之后一周的相同溃疡。

图9显示在细胞增殖检定中相比于以酶方式处理的微血管的微血管组织的膜的活性。

具体实施方式

除非另外指明，否则本公开的实践涉及通常用于分子生物学、医学、手术、哺乳动物生理学、蛋白质纯化、蛋白质工程、细胞生物学和组织工程领域的常规技术，其在所属领域的技术内。此类技术为所属领域的技术人员已知，并且描述于许多标准文本和参考著作中。在本文的上文和下文中提到的所有专利、专利申请、文章和出版物特此明确地以引入的方式并入本文中。

除非本文中另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。包括本文所包括的术语的多种科学词典为所属领域技术人员众所周知和可获得的。虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但只描述了一些优选方法和材料。因此，整体上参考本说明书更充分地描述紧接在下文定义的术语。应理解，本公开不限于描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以取决于所属领域的技术人员使用其的情境而变化。

定义

如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数术语“一(a/an)”和“所述”包括复数参考。

数值范围包含界定所述范围的数字。希望在整个本说明书中给出的每个最大数值限制都包含每个下部数值限制，如同这些下部数值限制在此明确地写出。在整个本说明书中给出的每个最小数值限制将包含每个较高数值限制，如同这些较高数值限制在此明确地写出。在整个本说明书中给出的每个数值范围将包含落在这些较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这些较窄数值范围在此全部明确地写出。

本文提供的标题不限制可以通过整体上参考本说明书而具有的本发明的各个方面或实施例。

如本文所用的术语“发明(invention)”或“本发明(present invention)”为非限制性术语并且不打算指代特定发明的任何单一实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求书中所述的所有可能实施例。

“约”意指量、含量、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考量、含量、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。在结合术语“约”使用数值的情况下论述的任何实施例中，确切地涵盖可以省去术语约。

除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。为了本发明的目的，下文定义以下术语。

在整个本说明书中提到“一个实施例”或“一实施例”意味着结合所述实施例描述的具体特性、结构或特征包括在本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书在不同位置中出现短语“在一个实施例中”或“在一实施例中”未必都是指同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，具体特性、结构或特征可以任何合适方式组合。

如本文所用，术语“功能”和“功能性”等是指生物、酶或治疗功能。

“增加的”或“增强的”量通常是“统计显著”量，并且可以包括本文所述的量或含量的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括两者之间且大于1的所有整数和小数点，例如2.1、2.2、2.3、2.4等)的增加。

“减少的”或“减小的”或“较小”量通常是“统计显著”量，并且可以包括本文所述的量或含量的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括两者之间且大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少。

如本文所用的术语“多能细胞”是指维持分化成两种或更多种不同特定细胞类型的能力的培养或未培养细胞。细胞可以是活的培养细胞或永生化细胞。或者，细胞可以是原代细胞。在另一方面中，细胞可以被灭菌或保存。多能细胞包括干细胞和祖细胞。多能细胞的实例包括(但不限于)间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、神经干细胞、内皮祖细胞、脂肪源性干细胞、造血干细胞、胎盘干细胞和脐带干细胞。应理解，在根据本文所描述的方法进行灭菌或保存之后，多能细胞可能失去其生长或分化的能力。

术语“微血管组织”是指由从身体中的几乎任何组织或器官分离的小动脉、毛细管、小静脉以及相关细胞和细胞外基质组分组成的组织。

如本文所用的术语“经处理微血管组织”是指从其滋养的邻近组织分离且接着使用例如冻干或喷雾干燥技术干燥的微血管组织。本文提供的经处理微血管组织是包括产生自微血管组织(例如脂肪、肌腱或肌肉组织)的解离(例如通过酶消化)的干细胞和/或祖细胞的混合物的经最低限度处理的未培养微血管组织。经处理微血管组织可以包括额外分子(例如整体或片段化细胞外基质分子、生长因子或细胞表面分子)。

经处理微血管组织和多能细胞组合物具有多种生物特性，包括消炎活性、血管形成活性、促有丝分裂活性以及软组织和硬组织愈合(例如修复或再生)活性。

术语“获自”是指例如细胞或组织的样品衍生自例如特定来源，如所需生物体或所需生物体内的特定组织。多能细胞和微血管组织的流行来源包括脂肪组织、骨髓、血液、骨骼、肌肉、羊膜、胎盘、皮肤、肠和肺。

如本文所用，例如关于微血管组织或多能细胞的术语“经分离”意指从其天然环境去除。举例来说，如果微血管组织与其天然环境中的共存物质中的一些或全部分离，那么其经分离。分离程度应相比于天然组织增加微血管元素的浓度至少50％。同样，经分离多能细胞应相比于其在天然组织中的浓度增浓至少两倍。

如果细胞是<50％的细胞排除锥虫蓝但至少1％的原始细胞仍在相差光学显微镜下以细胞形式可见的组合物的一部分，那么可以认为其不能存活。

术语“生物活性”是指组合物对活物施加有益作用的能力。如本文所用，术语“增强的生物活性”是指减少的免疫反应、消炎活性、血管形成活性、伤口愈合、疾病相关疼痛缓解或其组合。生物活性可以通过细胞迁移或增殖检定、某些细胞蛋白质的表达、报告的疼痛减轻、医学成像、增加的毛细管数目和/或改进的伤口愈合来测量。

如本文所用，术语“消炎”是指减轻发炎或肿胀的物质特性。

如本文所用，术语“血管形成”是指物质促进血管生成(从预先存在的血管形成新血管的生理过程)或血小管生成(重新形成血管的过程)的特性。它是生长和发育以及伤口愈合中的正常且至关重要的过程。

“药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”包括(但不限于)已由或将由美国食品和药物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准为对于用于人类或家畜可接受的任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、香味增强剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等张剂、溶剂或乳化剂。

“药物组合物”是指本发明组合物和所属领域中公认用于向哺乳动物，例如人类递送治疗剂的介质的调配物。这类介质包括其对应的任何药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

如本文所用，除非上下文另外表明，否则“药物治疗(medical treatment)”和类似的词(例如“治疗(treated)”、“治疗(treating)”等)指示用于获得有益的或所希望的结果、包括临床结果的方法。治疗可以任选地涉及减少或改善损伤、疾病或病况的症状，或延缓损伤、疾病或病况的进展。在一些实施例中，施用本文所述的组合物可以治疗这类症状中的一种或多种。

如本文所用，除非上下文另外表明，否则“预防(prevention)”和类似的词(例如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等)指示用于预防、抑制损伤、疾病或病况的发作或复发或降低发作或复发的可能性的方法。它还指预防、抑制损伤、疾病或病况的一种或多种症状的发作或复发或降低发作或复发的可能性，或任选地延缓损伤、疾病或病况的起始或复发或延缓损伤、疾病或病况的一种或多种症状的出现或复发的方法。如本文所用，“预防”和类似的词还包括减少损伤、疾病或病况的强度、效应、症状和/或负担。

如本文所用，组合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以影响所需生物效应，如有益的临床效果的量。

术语“自体转移(autologous transfer/transplantation)”等是指组织供体也是产生自所述组织的组合物的受体的处理。

术语“同种异体移植(allogeneic transfer/allogeneic transplantation)”等是指其中组织供体与产生自所述组织的组合物的受体是相同物种，但不是相同个体的处理。

术语“异种移植(xenogeneic transfer/xenogeneic transplantation)”等是指其中组织供体与产生自所述组织的组合物的受体是不同物种的处理。

如本文所用，术语“工艺处理”或“暴露于处理”是指将预期对细胞或蛋白质有害的条件，如辐射、热冲击、长期储存于室温或更高温度下、长期冷藏、超声搅拌、流体剪切力、暴露于低氧、活性氧类、电磁场和其组合。

如本文所用，术语“最小阈值”或“最小阈值剂量”是指一次施予的数量。本文中，其可指暴露于特定处理的给定数量。举例来说，最小阈值可指如以千戈瑞单位所测量的辐射的给定数量。应理解，术语将具有基于特定处理之适当单位。举例来说，取决于处理暴露，温度、时间、pH、力的单位，或其组合。

如本文所用，术语“千戈瑞”是国际单位制(International System of Units)中的电离辐射剂量的导出单位。戈瑞或“Gy”被定义为每一千克物质吸收一焦耳辐射能量。其用作吸收剂量、比能和比释动能(每单位质量释放的动能的首字母缩写)的量度。

如本文所用，术语“最大限度”为导致损失约90或约99％之细胞之完整性，使得细胞不再可以观测为细胞和相差光学显微镜计数的剂量或暴露。完整性是指细胞完整性。

如本文所用，“软组织”一般是指发现于整个身体中的骨外结构且包括(但不限于)软骨组织、半月板组织、韧带组织、肌腱组织、椎间盘组织、牙周组织、皮肤组织、血管组织、肌肉组织、筋膜组织、骨膜组织、眼组织、心包组织、肺组织、滑膜组织、神经组织、脑组织、肾组织、骨髓、泌尿生殖组织、肠组织、肝组织、胰脏组织、脾组织、脂肪组织和其组合。软组织损伤包括对例如肌肉、韧带、肌腱、皮肤、纤维组织、脂肪、滑膜、神经、血管和筋膜的任何软组织的损害或损伤，其可能出现于整个身体中。

多能细胞

在若干实施例中，本文所提供的多能细胞组合物包含可以包括产生自微血管组织(例如脂肪、骨髓或肌肉组织)的解离(例如通过酶消化)的干细胞和/或祖细胞的混合物经最低限度处理的未培养细胞或未培养微血管组织(或其组分)。经处理多能细胞组合物可以包括额外分子(例如整体或片段化细胞外基质分子或生长因子)。另外，经处理多能细胞组合物可以包含多能细胞的片段或膜。多能细胞可以经纯化或培养。其可以是部分分化细胞、原代细胞或细胞系。

本发明的实施例包含已暴露于导致增强的生物活性的处理的经分离多能细胞。在一些实施例中，经分离多能细胞已暴露于减弱或消除细胞增殖或分化的能力的处理。处理包括(但不限于)暴露于辐射、储存于室温或更高温度下、热冲击、低氧、暴露于电磁场、超声搅拌、流体剪切力、pH冲击、渗透性冲击、长期冷藏和暴露于活性氧类。处理通常减弱细胞活力或蛋白质效能，但出人意料地增强细胞制备物的生物活性。处理通常杀死细胞，但可以增强其以加速速率释放微泡、生长因子等的能力或可能仅破坏抑制元件。增强的生物活性包括促进血管形成、伤口愈合、细胞增殖、细胞迁移和减轻发炎或其组合的能力。

本发明涉及制造具有增强的生物活性的多能细胞的方法，其包含分离多能细胞和将细胞暴露于导致增强的生物活性的处理，如辐射、热或剪切力。

本发明的方法可以用于制备包含单独或与一种或多种额外细胞类型和/或其它组分组合的多能细胞的组合物。

在特定实施例中，额外细胞类型为基质上皮或血源性细胞，包括(但不限于)成纤维细胞、包括滤泡外根鞘细胞的角化细胞、内皮细胞、周细胞、红血球、单核细胞、包括浆细胞的淋巴细胞、中性粒细胞、凝血细胞、肥大细胞、脂肪细胞、肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、神经和神经胶质细胞、骨细胞和成骨细胞。

在特定实施例中，额外组织组分为细胞外基质的组分。细胞外基质包含不同的成分，如蛋白质、糖蛋白、蛋白多糖、复合碳水化合物和其它分子。细胞外基质可以包含多种不同蛋白质中的任一种，包括各种胶原蛋白、弹性蛋白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白、玻璃连结蛋白、凝血栓蛋白、腱生蛋白(tenascin/cytoactin)、巢蛋白(entactin/nidogen)、骨粘连蛋白(SPARC)、锚定蛋白CII、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨钙蛋白、骨唾液蛋白、骨桥蛋白、表面粘连蛋白(epinectin)、透明质蛋白、淀粉样P组分、肌原纤维蛋白、分区蛋白、s-层粘连蛋白、粗纤维调节蛋白、epilligrin、缰蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原和HSP。

在相关实施例中，额外组织组分包含生长因子、血管形成剂、消炎剂、细胞因子或分化剂。举例来说，生长因子或血管形成剂可以选自碱性成纤维细胞生长因子、其它成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白质、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、颗粒球巨噬细胞群落刺激因子、血小板源性生长因子、转化生长因子β1和/或β3以及血管内皮细胞生长因子。可以使用的其它生长因子和生长因子类别或家族包括所属领域中已知的那些中的任一种。

微血管组织

本文所述的经处理微血管组织可以通过解离微血管组织产生。在一些实施例中，微血管组织使用一种或多种酶以酶方式消化。合适的酶包括促进组织解离的那些，如胶原蛋白酶和中性蛋白酶，如嗜热菌蛋白酶或BP蛋白酶。可以调节酶消化过程以增加或减少组织解离。举例来说，如果期望更完全解离，那么可以包括超过一种酶或可以增加消化时间。尽管不必维持细胞活力，但在一些实施例中，一般期望细胞膜保持总体上完整以保护含有连接和信号传导分子的膜，即使在酶消化期间出现一些细胞溶解。因此，根据本发明的一个实施例，使用例如脂肪酶的酶可能不适用于此类过程。在此类情境下，可以利用胶原蛋白酶或中性蛋白酶。

或者，微血管组织可以在不使用酶的情况下解离。更确切些，微血管组织可以使用物理或化学方法，包括使用螯合剂、超声搅拌或机械细胞解离来解离。机械细胞解离可以包括平缓移液、手动刮削、尼龙网、机械破碎等。

供体微血管组织采购和后续处理可以包括预防微生物(例如细菌、真菌或病毒)污染的步骤。举例来说，可以在处理之前针对微生物(例如HIV、HPV、EBV、TB等)的预定列表筛选供体。筛选可以使用已知技术进行，如使用聚合酶链反应检测微生物核酸的存在，或通过ELISA检测与特定微生物相关的分子的存在。根据本发明的一些实施例，可以排除使用受微生物污染的微血管组织。另外，微血管组织可以使用无菌或灭菌技术产生，或经最终灭菌。

在组织解离后，可以进一步处理微血管组织以去除非所需细胞或分子，如红血球、脂质或脂肪细胞。额外处理将取决于微血管组织的来源和其既定用途。举例来说，如果微血管组织来源为脂肪组织，那么解离的微血管组织可以在相对较低的力下离心以将脂质、脂肪细胞和一些前脂肪细胞与微血管组织的其余部分分离。在其它实施例中，已知的肌细胞分离方案，如使用密度梯度离心可以用于在酶消化后进一步处理肌组织以去除肌细胞和富集微血管相关细胞和组织。

一旦制备微血管组织，其便可以使用例如冻干或喷雾干燥技术进行干燥而保存，以产生经处理微血管组织。当保存微血管组织时，可以使用任何适当赋形剂，包括糖(例如海藻糖、甘露醇、蔗糖)、多元醇(例如聚乙二醇)、醛、蛋白质(例如白蛋白)、氨基酸(例如甘氨酸)、表面活性剂(例如Tween 20)、DMSO和/或高锰酸盐。

冷冻干燥通常包含四个步骤：预处理、冷冻、一次干燥和二次干燥。预处理可以包括浓度调节或添加一种或多种赋形剂。在预处理后，冷冻微血管组织。冷冻步骤通常以小心控制的方式(例如以介于约-0.5℃/min至约-50℃/min之间的冷却速率)进行以保留细胞结构，但不必保留细胞活力。在一些实施例中，微血管组织以约-10℃/min的冷却速率冷冻。可以基于使用的特定微血管组织和赋形剂调节冷却速率。微血管组织可以使用任何适当方法冷冻，包括使用机械制冷和/或将含有微血管组织的容器暴露于干冰或液氮直至其达到适合于冻干的温度。

另外，由于活力并非用于组织修复的经处理微血管组织的适合性所需，因此不必调节保存方法和储存以维持活力。在处理之前，提供的微血管组织中的活细胞的百分比可以高达100％。在处理之后，其可以小于50％，例如小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。在一些实施例中，在处理或低温保存之后，提供的经处理微血管组织不含可测量的活细胞。

在本发明的一些实施例中，如实例1中所述地制备微血管组织。

生产处理方法

组织灭菌通常对蛋白质和细胞造成极大损害。蛋白质通常经变性，DNA经裂解和/或交联，且细胞被杀死。

为了将损害降至最低，极小心地处理此类产物以减小生物负荷。其可以接着用低至14-15kGy的辐射暴露灭菌。出人意料地，本文所述的多能细胞组合物具有改进的效能，如根据暴露于约1kGy至约40kGy辐射时的生物活性所测量。在一些实施例中，多能细胞组合物暴露于小于1kGy，例如0.65kGy。在其它实施例中，多能细胞组合物暴露于2kGy。在其它实施例中，多能细胞组合物暴露于约14kGy。效能可以在辐射暴露加倍时增加并且在暴露几乎增至三倍时进一步增加(如实例2中所示)。辐射可以通过暴露于电子束(“electron-beam/E-beam”)至红外的一系列波长来实现，如以下实例中所示。

可以在多种情形下看出生物活性随着通常降低细胞或蛋白质的效能的处理而增强的出人意料的现象。本发明组合物在持续延长时段储存或暴露于高温时显示增强的生物活性。将组合物暴露于低氧条件、活性氧类、电磁场、超声搅拌、流体剪切力、非生理pH或紧张性也导致改进的效能。组合物可以包含多能细胞、经处理微血管组织或其组合。多能细胞包括(但不限于)来自初生组织或细胞系的纯化的经培养细胞、未培养细胞和部分分化细胞。多能细胞可以经灭菌和干燥。

储存条件的实例包括在室温下长期储存。长期可以是约6个月、小于1年、约1年、约2年或大于3年。室温是约25℃。储存条件可以是在例如0℃、-20℃或-80℃的低温下，活在高达46℃的高温下储存。

低氧条件的实例包括例如低于3％氧。低氧条件可以通过CO₂恒温箱产生。或者，低氧条件可以在“三气”恒温箱中产生。但是，仅供应两种气体-二氧化碳(照常)和氮气以降低氧含量。一般来说，氧气可以降至低于1％。

暴露于活性氧类(其为含氧的化学反应性分子)的实例包括过氧化物、超氧化物、羟基、过氧乙酸和单态氧。

电磁场暴露的实例包括微波能量。

声波处理是出于各种目的，向样品中的搅拌粒子施加声能的行为。通常使用超声频率(>20kHz)，使得方法也被称为超声波处理。在生物应用中，声波处理可能足以破坏生物材料或使其失活。举例来说，声波处理通常用于破坏细胞膜和释放细胞内含物。此过程称作声致穿孔。声波处理也用于DNA的片段分子，其中经受短暂时段的声波处理的DNA剪切为较小片段。

剪应力被定义为与材料截面共面的应力的分量。剪应力产生于平行于截面的力矢量分量。另一方面，正应力产生于垂直于应力起作用的材料截面的力矢量分量。剪应力是血管稳态、调节维管重构、心脏发育和动脉粥样化形成的基本决定因素。流体剪切力可以通过暴露于层流或扰流而在实验室环境中仿效。剪切产物的便利方法包括剧烈混合或强制穿过小孔。

非生理pH的实例包括小于7.0或高于7.8的pH。这包括约0至约7.0和约7.8至约14的范围。这包括那些限度内的范围，例如约0至约1、约0至约2、约0至约3、约0至约4、约0至约5、约0至约6、约0至约7、约7.8至约8、约7.8至约9、约7.8至约10、约7.8至约11、约7.8至约12、约7.8至约13和约7.8至约14。

生物活性

在特定实施例中，本发明的组合物具有一种或多种生物活性。举例来说，在某些实施例中，组合物具有消炎、血管形成活性或其组合。组合物可以引发内皮细胞的迁移或增殖。在某些相关实施例中，组合物促进血管形成或组织愈合。在若干实施例中实现这些效应的组合。

在某些实施例中，本发明的组合物具有消炎活性。在特定实施例中，相比于受损或病变组织经类似处理但不暴露于或与本发明组合物接触时，暴露于或与本发明组合物接触的受损或病变组织(例如经历发炎性反应的受损或病变组织)展现减轻的发炎。在某些实施例中，相比于受损或病变组织不暴露于或与本发明组合物接触时的发炎量，暴露于或与本发明组合物接触的组织中的发炎量减小至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。发炎可以通过所属领域中可用的方法测量，包括例如当以组织学方式观测时，在受影响组织中观测到的淋巴细胞的数目。

在特定实施例中，本发明组合物具有可以疼痛形式或目视测量的消炎活性。以目视形式，所述消炎活性可以通过发红和/或肿胀测量。

在某些实施例中，本发明组合物具有血管形成活性。在特定实施例中，相比于受损或病变组织经类似处理但不暴露于或与本发明组合物接触时，暴露于或与本发明组合物接触的受损或病变组织(例如经历发炎性反应的受损或病变组织)展现增加的血管生成。在某些实施例中，相比于受损或病变组织不暴露于或与本发明组合物接触时的血管生成量，暴露于或与本发明组合物接触的组织中的血管生成量增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、或至少约500％。血管生成可以通过所属领域中可用的方法，包括例如后肢局部缺血模型来测量。

在特定实施例中，本发明组合物具有可以在体内或体外检定中测量的血管形成活性。在某些实施例中，相比于在不存在本发明组合物的情况下或在存在对照组合物的情况下在相同检定中测量的活性量，在存在本发明组合物的情况下在体外血管生成检定中测量的活性量大至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、或至少约500％。在特定实施例中，体内检定为基质胶检定。在特定实施例中，体外检定为本文所述的内皮细胞迁移检定。

在某些实施例中，本发明组合物促进受损或病变组织的愈合，即其具有组织愈合活性。如本文所用，组合物的“组织愈合活性”为相比于经类似处理但不暴露于组合物的类似组织，组合物促进暴露于组合物的受损或病变组织(例如硬组织或软组织)改进愈合(例如修复或再生)的能力。使用任何适当方法测量改进的愈合，如完全愈合的时间、产生的新组织的量、所得愈合组织的强度或所得愈合组织的功能性。

灭菌或病毒灭活的同种异体和异种多能细胞和经处理微血管组织组合物先前尚未用于促进例如韧带和肌腱的软组织的修复，这是因为通过自体干细胞制造新软组织的困难、同种异体和异种干细胞将被排斥的观念和灭菌或病毒灭活的细胞将具有减少的活力并且因此具有减少的生物或治疗活性的先前看法。但是，本文所述的方法和组合物未必依赖于自体干细胞或细胞活力。更确切些，提供的方法用于产生组合物，所述组合物含有干细胞或祖细胞，或此类细胞甚至与其它的与此类细胞相关的细胞类型和分子(例如细胞因子、生长因子、趋化性分子等)的混合物，所述细胞类型和分子已暴露于后加工处理以增强生物活性。此类处理包括(但不限于)照射、室温储存、低温、低氧条件、活性氧类、电磁场、超声搅拌、流体剪切力、非生理pH或紧张性。在一些实施例中，在干燥或灭菌之前进行加工处理。在其它实施例中，组合物含有活细胞和不能存活的细胞的混合物。在某些实施例中，组合物含有经分化或工程改造的治疗细胞，所述治疗细胞已暴露于所公开的方法中的一种或多种以增强生物活性。

在特定实施例中，存在于本发明组合物中的细胞的小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约3％、或小于约1％为活细胞。在若干实施例中，基本上所有的细胞为不能存活的细胞。如本文所用，术语“活的”应被给予其一般含义且也应指代能够在适当条件下，例如预期相同细胞或细胞类型将会增殖的条件下，例如在未如本文所述地处理的情况下培养时增殖的细胞。在其它实施例中，存在于所述组合物中的细胞的小于约2％或小于约1％为活细胞。在特定实施例中，存在于组合物中的细胞中没有或基本上没有活细胞。

因此，术语“不能存活的”意指不能够在适当条件下，例如预期相同细胞或细胞类型将会增殖的条件下，例如在未如本文所述地处理的情况下培养时增殖的细胞。实例2至5显示本发明的某些方面的经处理微血管组织的生物活性的示例。测试的生产后加工处理包括照射(实例2)、在室温下的储存时间(实例3)、储存温度(实例4)和低氧(实例5)。

使用方法

在某些实施例中，本发明组合物用于治疗疾病病况。

可以根据本发明的方法治疗或预防的组织损伤、疾病和病况包括(但不限于)血管、皮肤或肌肉骨胳组织的损伤。肌肉骨胳病况包括例如关节炎、肌腱病、韧带撕裂、骨折、骨髓炎、腭裂、肌筋膜疼痛综合症、关节活动过度/埃勒斯-当洛斯综合症、复杂区域疼痛综合症(CRPS)和病态牙种植体。软组织病况包括例如皮肤病况(例如苔癣硬化症、疤痕修复、如在培荣尼尔氏病中的疤痕组织或治疗创伤、严重烧伤、皮肤溃疡[例如褥疮(压力)溃疡、静脉溃疡和糖尿病性溃疡]、手术伤口，如与皮肤癌切除相关的那些)和湿疹；血管病况(例如血管疾病，如周边动脉疾病和静脉疾病；血管损伤；血管发育不当；无血管性坏死)；影响声带或牙周组织的病况；美容病况(例如涉及包括膨胀剂的修复、填充或美化，脂肪移植，毛发生长，乳房再造和磨皮手术之后的愈合的那些)；肌肉损伤；肌肉疾病(例如先天性肌病；重症肌无力；发炎性、神经性和肌原性肌肉疾病；以及肌营养不良，如杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、贝克尔肌营养不良(Becker muscular dystrophy)、强直性肌营养不良、肢带型肌营养不良、颜面肩胛肱骨型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端肌营养不良和埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss musculardystrophy))；如外周神经病变的病况；以及器官和/或筋膜(例如膀胱、肠、骨盆底)的病况，如间质性膀胱炎。相当常见的软组织损伤的一个实例是骨盆底损伤。这是可能在分娩期间或由其并发症而出现的潜在严重医学病况，这可能导致膀胱阴道瘘的损伤，如膀胱膨出(其为膀胱的突出)。类似医学病况包括脱肛(直肠突出)、肠疝(肠至直肠子宫陷凹或膀胱阴道陷凹的突起)和肠膀胱疝(膀胱和肠均突出的双疝)。

在某些实施例中，本发明组合物用于治疗或预防软组织损伤。

可以受益于提供的增强型组合物的软组织愈合活性的软组织损伤包括(但不限于)例如肌腱和/或韧带撕裂的损伤和产生于缺血性事件的损伤。常见软组织损伤可能由扭伤、拉伤、导致挫伤的损伤或特定软组织的过度使用产生。软组织损伤包括开放和封闭软组织损伤。

在各种实施例中，本发明组合物用于治疗或预防各种疾病，包括(但不限于)与非所需发炎或免疫反应相关之疾病。此类疾病之实例包括类风湿性关节炎、骨关节炎、滑囊炎以及自身免疫疾病和病症，如克罗恩氏病和自身免疫性肝炎。另外，本发明组合物可以用于减轻发炎，例如在损伤部位处，和/或减轻免疫反应，例如通过损伤诱发的免疫反应。类似地，本发明组合物可以用于防止或降低移植排斥反应的可能性或严重度。

在特定实施例中，本发明组合物用于促进或刺激血管生成或血管再形成，例如在损伤或组织损伤部位处。在特定实施例中，损伤与组织的局部缺血、低氧或再灌注损伤相关或导致组织的局部缺血、低氧或再灌注损伤。可以根据本发明治疗或预防的与局部缺血、低氧或再灌注损伤相关或导致其的损伤或疾病的实例包括中风、心肌梗塞、急性肾损伤和失血。可以用本发明组合物治疗以促进或刺激血管生成或血管再形成的损伤或组织损伤的其它实例包括移植或断肢再植。

本发明组合物可以用于治疗或缓解与医学病况相关的疼痛。此类医学病况的实例包括足底筋膜炎、关节炎、肌腱病、背痛、跛行、肌筋膜疼痛综合症和颞下颌关节疼痛。

本发明组合物还可以用于治疗或预防周围神经损伤、勃起功能障碍、多发性硬化症和辐射烧伤。另外，其可以用于诱导血细胞生成和/或伤口愈合。其还可以用于治疗糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变和黄斑变性。

在特定实施例中，本发明组合物例如在被调配成用于静脉内施予时可以用于治疗或预防急性心肌梗塞、充血性心脏衰竭、中风、周边血管疾病、肺动脉高压、肺气肿或慢性阻塞性肺病。呼吸道问题也可以用适合于吸入的本发明的研磨形式治疗。

本发明组合物可以单独或与一种或多种其它治疗剂或程序组合使用以治疗或预防损伤或疾病。举例来说，在某些实施例中，为了向受损组织富集供血和/或促进组织再生，本发明组合物可以与富血小板血浆组合使用。当与一种或多种其它其它治疗剂或程序组合使用时，本发明组合物可以在用其它治疗剂或程序治疗之前、与其同时或在与其重叠的时段期间，或在其之后提供或使用。

另外提供使用经处理微血管组织的方法。经处理微血管组织可以直接施用于需要修复的组织，或可以施用于需要修复的此类组织周围的组织。在一些实施例中，干燥的经处理微血管组织在合适的载剂(例如水或生理盐水)中复水且直接施用于需要修复的组织。经验显示含有例如麻卡因(Marcaine)的麻醉剂的溶液对于一些患者来说是优选的。对于局部使用，经处理微血管组织可以冻干饼状物形式、以粉末形式、混合至皮肤病乳膏中、以干膜形式或以溶液形式施用。在一些实施例中，复水的经处理微血管组织在施用于组织之前施用于支架，如胶原蛋白基质、纤维蛋白凝块或生物相容性织物。在其它实施例中，经处理微血管组织用于涂布材料，如柔性生物相容性支架(例如编织或非编织物薄片或线)、生物相容性微珠或粒子或可植入医疗装置。喷雾干燥的经处理微血管组织尤其适合于涂布包含微珠或粒子的材料而无需在涂布之前复水，因为涂布可以在喷雾干燥过程中进行。

经处理微血管组织可以在植入至患者中之前与任何合适的装置或材料组合。经处理微血管组织可以与以下各者组合：骨科植入物；多孔、柔性可植入支架；手术植入物；纯水；生理盐水；麻醉溶液；多孔涂布植入物；聚合物溶液；如DMSO、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和醇类的溶剂；水凝胶；透明质酸或其它粘多糖或蛋白多糖；胶原蛋白；纤维蛋白；凝血酶；血凝块；血小板；富血小板血浆；脱矿质骨基质；自体细胞；和/或骨或骨成分。

经处理或冷冻保存微血管组织可以单独包装，例如在小瓶中，或与其它产品组合，如列为适合于与经处理或冷冻保存微血管组织组合的那些。当与另一材料一起包装时，经处理或冷冻保存微血管组织可以分开包装，或与另一材料预混合或结合。在一些实施例中，经处理微血管组织包装为生物相容性材料上的涂层。

先前已在动物中显示不能存活的多能细胞改进肌腱愈合(美国专利第9,044,430号)。临床使用本发明的增强型组合物已显示多种肌腱病的快速治愈和出人意料的疼痛缓解(实例7)。也在足底筋膜炎中观测到疼痛缓解(实例9)，足底筋膜炎为不具有明确病源学且除了足部的长期卸荷外无其它有效治疗的足部慢性疼痛病况。在关节炎中，注射本发明的经处理微血管组织在软骨不明显愈合的情况下提供深远、持久的疼痛缓解，其如通过MRI或X射线所成像(实例6)。

临床使用已在治疗慢性伤口(实例8)、疤痕、肌腱病和骨关节炎中显示出人意料的益处。除了这类患者中注意到的治愈以外，疼痛也显著减轻。也在治疗颞下颌关节疼痛的患者中观测到此疼痛减轻(实例10)。

本发明的一些实施例包含不具有活细胞，但在多种临床使用中显示益处的组合物。当用例如高压室、胶体敷料、组织移植和卸荷的常规疗法治疗时未愈合的慢性伤口在施用本发明的增强型、经处理微血管组织之后少至一周愈合。本发明的经处理微血管组织的冻干饼状物可以直接施用于伤口，变成粉末且经较大伤口的表面扩散，或与水或其它适当流体水合且在伤口中和伤口周围皮下注射。伤口接着通常由传统敷料覆盖。

本发明的方法可以通过以一个、两个或更多个剂量施予组合物来实践。举例来说，在某些实施例中，组合物以单一剂量、多个剂量或一段时间内的重复剂量施予。

实例

实例1：制备经处理微血管组织

脂肪组织获自器官供体。皮下脂肪取自腹部、大腿和臀部。将五(5)至十(10)磅的脂肪收集至适当培养基，如ZTM^TM运输培养基(INCELL)中。

收集组织且起初通过用PBS洗涤且接着在37℃下悬浮于CIzyme HA(Vitacyte)加上含中性蛋白酶的ZSolM^TM(INCELL)中40分钟而在死亡一天内处理。

在消化之后，在例如PBS的适当缓冲液中冲洗样品。在此实验中，使用ZSolF^TM且样品接着离心，倾析，且接着再在ZSolF^TM中洗涤两次。细胞以每毫升1.5×10⁶个细胞再悬浮于含M3D^TM的EZ-CPZ^TM(INCELL)(1:1混合物)低温保护剂溶液中且在1mL等分试样中冻干。

实例2：照射的影响

如实例1中所述制备的组合物通过辐射暴露灭菌且接着在迁移检定中使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)测试生物活性。HUVEC是培养直至对数生长期的第一传代细胞且接着经CM-DiI(茵维特罗根(Invitrogen))荧光标记。用单独(阴性对照)、补充有上皮细胞生长因子(EGF阳性对照)或用各种类型和剂量的辐射处理的微血管组织的复水组合物的细胞培养基(M3DTM和EZ-CPZTMINCELL的50:50混合物)制备Transwell板(赛默飞世尔(ThermoFisher))。将标记的HUVEC细胞置于Transwell板的上部室中且在细胞培养恒温箱中在37℃下培养48小时。分离上部和下部室的PET膜具有3μm孔隙。在48小时之后，去除上部室且测量下部室中的荧光强度。

实验结果图示于图1中。生物活性随着增加辐射剂量而增加，无关于波长，且甚至超过阳性对照。经处理组合物的等分试样用DAPI染色(细胞核染色)且在血细胞计上用荧光显微镜计数。细胞计数(图2)指示照射对经处理组合物中的细胞数目不具有显著影响。

实例3：储存时间的影响

如实例1中所述地制备且接着用27kGy的伽马照射灭菌的组合物储存在室温下且接着在各个时间通过HUVEC迁移检定进行分析。如图3中所示，储存两年的样品出人意料地显示相比于更早时间点增加的生物活性。

实例4：储存温度的影响

如同实例1制备且用25kGy的伽马辐射灭菌的组合物暴露于高温以模拟可能的装运情境。基线样品保持于室温下。出乎意料地，过热样品显示最高生物活性，如图4中所示。

在独立但相关的实验中，未经照射的样品在室温或更低温度下储存六个月。如表1中所示，生物活性在较低储存温度下降低。

表1：储存6个月的非照射样品的生物活性

储存温度	相对迁移
		室温	40％
4℃	55％
		-20℃	35％
-80℃	5％

实例5：氧的影响

在实例1中的处理期间，细胞组合物经受低氧含量。某些细胞蛋白质的表达将增强或抑制，因此，这影响组合物的功能性。低氧与诱导血管内皮生长因子(VEGF)的表达相关，VEGF是促进血管生成和血管形成的重要因子。因此，暴露于低氧可以用作可以增强施予组合物中的VEGF表达的方法。

实例6：治疗关节炎

57岁男性农民罹患由骨关节炎所致的慢性疼痛，他将所述慢性疼痛在10点疼痛量表上评定为8-9。疼痛限制他的工作和娱乐活动。一小瓶如实例2中制备的经处理微血管组织用3ml水水合且将溶液注射至受影响的膝盖中。在五周随访问诊时，疼痛已消退至0。受试者陈述疼痛在注射一周内消失并且他已重新开始农场的所有活动且已在数年内第一次骑自行车。

受试者在注射之前已获取磁共振图像并且在4个月后再次获取。放射科医生对于图像的报告概述如下：

治疗前：相关发现包括1)积液：少量至中等的髌上积液；2)皮下软组织：在髂胫带内侧且延伸到腘脂肪垫的中度皮下脂肪水肿和流体；3)外侧副韧带：近端肌腱病和/或部分撕裂；4)髌股关节：I级CP；5)内侧关节隔室：涉及股骨的远端外侧髁和胫骨外侧平台两者的关节表面的超过70％的近全厚度软骨损失、残余软骨的小局灶性溃疡和极小相邻反应性(硬化)骨骼变化和软骨下囊肿；6)骨髓：后内侧外侧髁中的中型骨髓挫伤和髌骨的骨髓挫伤；和7)皮层：无骨折。

治疗后四个月：相关发现包括1)积液：少量消退；2)皮下软组织：皮下脂肪水肿显著消退，具有极小残余量；3)外侧副韧带：急性肌腱病消退；4)髌股关节：I级CP，无变化；5)内侧关节隔室：无变化；6)骨髓：骨髓挫伤无变化；和7)皮层：无骨折。

实例7：治疗肌腱病

患者是最近在过去3-4个月在右髌骨的下部区具有严重和渐进性疼痛的40岁男性运动员，所述疼痛由进行无负重下蹲引起。他不能够忍受通过触诊在下髌骨上的任何压力。在0至10的疼痛量表上，10是最严重的疼痛，他陈述当进行无负重下蹲时疼痛为约8-9且当在这个区域施加任何压力时疼痛为约9。他评论说所述疼痛可能由进行极深下蹲且接着在其膝盖略微过度弯曲的情况下急冲至站立位置而引起。他在行走或休息时未经历许多(如果存在的话)疼痛。图5为显示肌腱撕裂的膝盖的治疗前MRI。

将一(1)小瓶如实例2中制备的经处理微血管组织注射至髌骨韧带中，且将一(1)小瓶的如实例2中制备的经处理微血管组织注射至臀小肌中。

在注射之后五周，患者的髌下区在强力触诊的情况下不具有疼痛。他也能够在无任何疼痛的情况下进行无负重深蹲。

在注射之后六周，他开始以小于其最大体重的约70％的重量进行下蹲而无任何疼痛。图6为显示受影响肌腱的愈合的治疗后MRI。

实例8：治疗慢性伤口

患有糖尿病和肾衰竭的48岁男性持续一年由伤口诊所治疗大面积糖尿病足部溃疡。伤口在暴露5cm×3.5cm×0.4cm伤口的一些区域中清创至肌腱(如图7中所示)且一小瓶如实例2中制备的经处理微血管组织通过压碎冻干饼状物且跨越伤口表面喷洒而用Adaptic敷料局部施用。

一周后，受试者返回进行随访且显示如图8中所示的溃疡的广泛愈合。伤口在随后几周内继续完全闭合。

实例9：治疗足底筋膜炎

受试者为47岁女性。她的左脚出于跗管松解和内侧足底筋膜松解而在之前做过手术。手术后十五(15)周，患者抱怨严重疼痛(将疼痛评定为10当中的8)。标准疗法对她来说已失效，所述标准疗法包括：可的松注射、腓肠肌后徙术以及内侧足底筋膜松解和门诊理疗。

治疗：在用必妥碘给治疗区域做准备之后，通过足底途径使用25g针向左脚后跟注射1cc如实例2中制备的经处理微血管组织(伴以WFI)，经处理微血管组织向下注射至跟骨结节的液位且接着返回至约5mm。患者很好地耐受注射。也将患者置于CAM靴中。

经处理微血管组织治疗之后的一(1)周随访：患者陈述自从向左脚后跟注射，她的脚后跟不再疼痛且足底筋膜起源处的疼痛程度为10当中的0。

实例10：治疗颞下颌关节(TMJ)疼痛

四十五(45)岁女性在左髁突和右髁突两者中具有持续颌部疼痛。她将疼痛同样评定为10当中的8-9。使用25g针在关节间隙内的右髁突下方、上方和侧向注射1cc如实例2中制备的经处理微血管组织(用无Epinepherine的0.25％麻卡因复水)。接着使用倍他米松(Celestone/betamethasone)与右侧恰好相同地治疗对侧(左髁突)。

在治疗后一(1)周，患者将右侧(经处理微血管组织治疗侧)评定为0的疼痛评分。患者说右侧在注射之后的当天无痛。她的左侧根据10的疼痛量表为4-5。

在左髁突中注射类固醇之后六周，患者的疼痛程度为10当中的6-7。用经处理微血管组织治疗左髁突。

实例11：在不使用酶的情况下从脂肪组织制备微血管组织

将从人类尸体供体收集的二十克皮下脂肪添加至两个50ml离心管中的每一个中。将5ml汉克氏(Hank's)碱性盐溶液添加至离心管A，混合，且接着将所述管置于37C超声波水浴中且用超声波能量搅拌35分钟。将大型磁力搅拌棒投入离心管B中，管被加盖，且剧烈振荡所述管5分钟以使得搅拌棒端到端地弹跳，压碎脂肪组织且溶解脂肪细胞。所述管用汉克氏BSS填充至50ml且接着在300g下离心7分钟。倒出油和缓冲液且将其余的组织离心块倒入皮氏培养皿中，在皮氏培养皿的底部形成稀浆料。接着将皮氏培养皿冷冻和冻干，制造微血管组织的薄柔性膜。膜使用2.7kGy伽马辐射进行灭菌。

使用细胞增殖检定分析微血管组织的膜的活性且相比于如上文所述的以酶方式制备的微血管组织。使用基底细胞培养基将膜和饼状物复水且接着连续稀释至含有人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的基础培养基中。两天后，细胞用荧光染料标记且如图9中所示地通过孔中的荧光强度测定相对数目。两种膜均显示与以酶方式消化的微血管组织一样好或更好的活性。

实例12：治疗秃发(脱发)

二十九(29)岁男性已持续超过2年展现脱发迹象。经处理微血管组织在4cc的无菌水中复水用于注射。通过30g针多次注射0.1-0.2cc等分试样，起始于2"直径治疗区域的中心，接着向外辐射。

在治疗后两(2)个月，由于随访问诊而见到患者。治疗医生注意到注射部位处的汗毛生长。

实例13：治疗滑囊炎

59岁女性抱怨她的左髋疼痛已持续5年，使得甚至在服用NSAIDS的情况下睡眠、园艺、散步或跑步不适。身体检查和X射线显示髋关节中的中度关节炎，但大部分的疼痛与发炎的滑囊相关且沿缝匠肌(Sartorius muscle)辐射。微血管组织用4ml麻卡因复水，其在超声引导下沿疼痛路径在发炎的滑囊中和发炎的滑囊下的12个部位注射。患者在随后两天报告减轻的疼痛，在第3天有一次疼痛性阵痛，在第13天有另一次疼痛性阵痛(过度使用)，且在此之后无阵痛。五个月后，她报告说她甚至不再考虑她的髋。

Claims (24)

1.一种包含多能细胞的组合物，其中所述细胞已经受一个或多个加工处理，所述加工处理导致增强的生物活性。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述处理选自由以下组成的群组：照射、储存、低氧、活性氧类、电磁场、超声搅拌、流体剪切力、非生理pH、非生理紧张性、热、冷和其组合。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述处理为具有约0.65kGy的最小阈值剂量的照射。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述最小阈值剂量为2kGy。

5.根据权利要求3或4所述的组合物，其中所述照射是通过暴露于红外至电子束的波长范围来实现。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞通过以最大剂量限度照射来处理且其中所述最大剂量为导致99％的细胞损失完整性的剂量。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中生物活性测量为选自由以下组成的群组的一个或多个参数：细胞增殖、细胞迁移、消炎、血管形成、组织愈合和疼痛缓解。

8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述处理为储存且选自由以下组成的群组：在46℃下约一天、在室温下约两年和在-20℃下两年以上。

9.根据权利要求1所述的组合物，另外其中所述细胞具有减弱的增殖能力。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的组合物，其中所述细胞已经干燥和灭菌。

11.根据权利要求1到9中任一项所述的组合物，其中所述细胞为活的经培养细胞。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中经受一个或多个加工处理的所述多能细胞相比于等效剂量的活的未处理多能细胞具有更大生物活性。

13.一种包含经处理微血管组织的组合物，其中所述组织已经受一个或多个加工处理，所述加工处理导致增强的生物活性。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述处理选自由以下组成的群组：照射、储存、低氧、活性氧类、电磁场、超声搅拌、流体剪切力、非生理pH、非生理紧张性、热、冷和其组合。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述处理为具有约0.65kGy的最小阈值剂量的照射。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述处理为在46℃下储存约一天、在室温下储存约两年或在-20℃下储存两年以上。

17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述处理为暴露于热。

18.一种治疗或预防哺乳动物的损伤或疾病的方法，其包含施予包含不能存活的多能细胞或经处理微血管组织的组合物，其中所述组合物已经受一个或多个增强生物活性的处理。

19.一种缓解与医学病况相关的组织疼痛的方法，其包含施予包含不能存活的多能细胞或经处理微血管组织的组合物，其中所述组合物已经受一个或多个增强生物活性的处理。

20.一种用于伤口愈合的方法，其包含施予包含不能存活的多能细胞或经处理微血管组织的组合物，其中所述组合物已经受一个或多个增强生物活性的处理。

21.一种预防或治疗个体的疤痕的方法，其包含施予包含不能存活的多能细胞或经处理微血管组织的组合物，其中所述组合物已经受一个或多个增强生物活性的处理。

22.根据权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述一个或多个处理选自由以下组成的群组：辐射、热、长期储存、低氧、剪切、pH冲击、渗透性冲击、超声波、电磁场和活性氧类暴露。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述医学病况选自由以下组成的群组：关节炎、足底筋膜炎、滑囊炎、颞下颌关节疼痛、骨关节炎、脱发、脂肪移植、腭裂、骨髓炎、外周神经病变、慢性伤口、骨折和肌腱或韧带病症。

24.根据权利要求18到23中任一项所述的方法，其中所述组合物为局部用粉末、局部用饼状物、局部用乳膏、干膜或注射液。