JP6755893B2 - 組織傷害および疾患を処置および予防するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本願は、2012年9月19日に出願された米国仮出願第61/703,203号の利益を主張する。この出願の開示は、本明細書中に明示的に参考として援用される。
分野
本発明のいくつかの実施形態は、滅菌されており、かつ/またはあらゆるウイルスを不活化する処置がなされている多能性細胞および/または微小血管組織を含む新規組成物、ならびに、それらの調製および関節炎などの組織傷害および疾患の処置または予防における同種異系または異種の使用のための方法を対象とする。
筋肉、腱、靭帯、および関節包などの軟部組織の傷害はかなり頻繁に生じる。そのような傷害により、一般には、疼痛、炎症および内部組織ストレスを特徴とする組織の機能障害が生じ、最終的に機能的な能力障害が生じる。例えば、腱の捻挫は自然に治癒するが、腱の完全断裂は多くの場合、外科的に処置しなければ能力障害に至る。外科的修復を行ってさえも、アキレス腱の約15%および2つの回旋腱板の40%の修復は、その後機能しなくなる。さらに、修復された腱が傷害前の強度および機能レベルに戻ることはめったにない。
組織修復を補助するための種々の異なる治療方法が開発されてきた。これらとしては、組織の内部成長のための足場をもたらすための物理的構造、例えば、よりよい縫合糸、骨アンカー、およびパッチまたはインプラントなどが挙げられる。さらに、種々の増殖因子が、組織の成長および創傷部位への遊走を改善するため、ならびに血管新生を促進するために使用されてきた。例えば、前臨床モデルにおける、BMP−2、BMP−12、PDGF−BB、およびbFGFなどの増殖因子を使用した腱の治癒の改善に関する報告がなされている。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
処理された微小血管組織を含む組成物であって、
前記処理された微小血管組織が、単離された多能性細胞、または多能性細胞もしくは前記微小血管組織から得たもしくはそれに由来する細胞膜を含み、
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有し、
前記組成物が滅菌されており、かつ/または前記組成物内のウイルスが不活化されている、
組成物。
(項目2)
前記細胞または組織が培養されていない、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記組成物中に存在する前記細胞の50%以下が生存可能である、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記組成物中に存在する前記細胞の10%以下が生存可能である、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記組成物中に存在する前記細胞の実質的に全てが生存不可能である、項目1に記載の組成物。
(項目6)
前記細胞の少なくとも1%がトリパンブルーを排除する、項目11に記載の組成物。
(項目7)
乾燥、凍結乾燥または凍結保存されている、項目1から6までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
室温付近で少なくとも1カ月保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する、項目7に記載の組成物。
(項目9)
賦形剤を含む、項目1から8までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目10)
植え込み型足場またはマトリックスをさらに含む、項目1から9までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目11)
前記植え込み型足場またはマトリックスが、骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸である、項目10に記載の組成物。
(項目12)
細胞、組織または細胞膜が、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱、または皮膚接面に存在する、項目10または項目11に記載の組成物。
(項目13)
静脈内投与用に製剤化されている、項目1から12までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目14)
前記細胞または組織が、哺乳動物ドナー、場合によってヒトから得たものである、項目1から13までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目15)
前記ドナーが、前記細胞または組織を得た時点で健康な哺乳動物であった、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞を含む、項目1から15までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目17)
放射線照射に曝露することによって滅菌されている、項目1から16までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目18)
単離された多能性細胞を含み、血管新生活性または抗炎症活性を有する組成物を調製する方法であって、
a.ドナー哺乳動物から得た組織試料を解離させて、その中の複数の多能性細胞を放出させるステップと、
b.複数の前記放出された多能性細胞を1つまたは複数の他の組織成分から分離して、単離された多能性細胞を含む組成物を作製するステップと、
c.場合により、(b)または(d)に従って作製された前記組成物を乾燥、凍結乾燥、または凍結保存するステップと、
d.(b)もしくは(c)から生じた前記組成物を滅菌し、かつ/または(b)もしくは(c)から生じた組成物中に存在するウイルスを不活化するステップと
を含み、(d)から生じた前記組成物が測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する方法。
(項目19)
前記細胞または組織を培養しない、項目18に記載の方法。
(項目20)
(c)の前に、前記放出された細胞または組成物を濾過するステップをさらに含む、項目18または項目19に記載の方法。
(項目21)
前記(a)の解離が、前記組織試料を1つまたは複数のプロテアーゼと接触させることを含む、項目18から20までのいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記1つまたは複数のプロテアーゼが、コラゲナーゼを含まない、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記1つまたは複数のプロテアーゼが、
1型コラゲナーゼ、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか;または
MMP2、MMP14、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか
を含む、またはそれからなる、項目21または項目22に記載の方法。
(項目24)
前記(a)の解離または(b)の分離が、超音波撹拌、遠心分離、濾過、または密度勾配の使用を含む、項目18から23までのいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記組織が、脂肪由来組織、骨髄、骨、筋肉組織、臍帯組織、または羊水組織であり、前記超音波撹拌、濾過、遠心分離、または密度勾配の使用により、前記放出された多能性細胞が脂肪細胞またはもう1つの他の細胞もしくは組織成分から分離され、場合により、前記組織が脂肪由来組織であり、前記放出された多能性細胞が脂肪細胞から分離される、項目24に記載の方法。
(項目26)
処理された微小血管組織を含み、血管新生活性または抗炎症活性を有する組成物を調製する方法であって、
a.ドナー哺乳動物から得た微小血管組織試料を解離させて、解離した微小血管組織を含む組成物を作製するステップと、
b.(a)に従って作製された前記組成物から1つまたは複数の組織成分を除去するステップと、
c.場合により、(b)または(d)の後に前記組成物を乾燥、凍結乾燥、または凍結保存するステップと、
d.(b)もしくは(c)の後に前記組成物を滅菌し、かつ/または(b)もしくは(c)の後に前記組成物中に存在するウイルスを不活化するステップと
を含み、
(c)または(d)から生じた前記組成物が測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する方法。
(項目27)
前記細胞または組織を培養しない、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記組成物を濾過するステップをさらに含む、項目26または項目27に記載の方法。(項目29)
前記(a)の解離が、前記組織試料を1つまたは複数のプロテアーゼと接触させることを含む、項目26から28までのいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記1つまたは複数のプロテアーゼが、コラゲナーゼを含まない、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記1つまたは複数のプロテアーゼが、
1型コラゲナーゼ、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか;または
MMP2、MMP14、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか
を含む、またはそれからなる、項目29または項目30に記載の方法。
(項目32)
前記(a)の解離または(b)の除去が、超音波撹拌、遠心分離、濾過、または密度勾配の使用を含む、項目26から31までのいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記微小血管組織が脂肪由来組織であり、前記超音波撹拌、遠心分離、濾過または密度勾配の使用により、脂肪細胞が(a)に従って作製された前記組成物から除去される、項目32に記載の方法。
(項目34)
滅菌の乾燥した組成物を含む、水分不透過性の容器であって、前記組成物が、単離された多能性細胞、または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織から得たもしくはそれに由来する細胞膜を含み、前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有し、前記組成物が滅菌されており、かつ/または前記組成物内のウイルスが不活化されており、前記組成物が室温付近で少なくとも1カ月保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持している容器。
(項目35)
前記細胞または組織が培養されていない、項目34に記載の水分不透過性の容器。
(項目36)
前記組成物中に存在する前記細胞の50%以下が生存可能である、項目34または項目35に記載の水分不透過性の容器。
(項目37)
前記組成物中に存在する前記細胞の10%以下が生存可能である、項目36に記載の水分不透過性の容器。
(項目38)
前記組成物中に存在する前記細胞の実質的に全てが生存不可能である、項目337に記載の水分不透過性の容器。
(項目39)
前記細胞の少なくとも1%がトリパンブルーを排除する、項目34から37までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目40)
前記組成物が賦形剤を含む、項目34から38までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目41)
前記組成物が、植え込み型足場またはマトリックスをさらに含む、項目34から40までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目42)
前記植え込み型足場またはマトリックスが骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸である、項目41に記載の水分不透過性の容器。
(項目43)
細胞、組織または細胞膜が、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱または皮膚接面に存在する、項目41または項目42に記載の水分不透過性の容器。
(項目44)
前記組成物が静脈内投与用に製剤化されている、項目34から43までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目45)
前記細胞または組織が、哺乳動物ドナー、場合によってヒトから得たものである、項目34から44までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目46)
前記ドナーが、前記細胞または組織を得た時点で健康な哺乳動物であった、項目45に記載の水分不透過性の容器。
(項目47)
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞を含む、項目34から45までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目48)
気密シールを含むバイアルである、項目34から47までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目49)
滅菌の内部を含む密封包装内に存在する、項目34から48までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
(項目50)
哺乳動物において傷害もしくは疾患を処置もしくは予防する、または組織再生を促進する方法であって、前記哺乳動物に、項目1から16までのいずれか一項に記載の組成物または項目18から33までのいずれか一項に記載の方法によって調製された組成物を提供することを含む方法。
(項目51)
前記組成物を前記哺乳動物に外科的に植え込む、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記組成物を、前記哺乳動物における傷害または疾患の部位内またはその近くに植え込む、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記組成物が前記哺乳動物の静脈内に提供される、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記傷害が軟部組織の傷害である、項目50から53までのいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記傷害が腱、靭帯、皮膚、骨、軟骨、椎間板、または微小血管組織に存在する、項目50から53までのいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記傷害または疾患が、虚血傷害、再灌流傷害、微小血管傷害、または炎症である、項目50から53までのいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記疾患が関節炎である、項目56に記載の方法。
(項目58)
多能性細胞、および1つまたは複数の血管壁細胞外マトリックス成分を含む組成物。
(項目59)
多能性細胞を含む滅菌された組成物。
(項目60)
多能性細胞の2種以上の成分を含む滅菌された組成物。
(項目61)
多能性細胞の10種以上の成分を含む、項目59に記載の滅菌された組成物。
(項目62)
多能性細胞由来の細胞膜およびタンパク質を含む組成物。
(項目63)
生存細胞を全く含まない、項目62に記載の組成物。
(項目64)
インタクトな細胞を全く含まない、項目62に記載の組成物。
(項目65)
トリパンブルーを排除するが増殖はしない多能性細胞を含む組成物。
(項目66)
トリパンブルーを排除するが増殖はしない滅菌された多能性細胞を含む組成物。
(項目67)
前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも50%または少なくとも90%が、トリパンブルーを排除するが増殖はしない、項目65または項目66に記載の組成物。
(項目68)
前記多能性細胞が前記対象に対して自己細胞ではない、対象における傷害または疾患の処置または予防において使用するための項目58から67までのいずれか一項に記載の組成物。
(項目69)
対象の腱の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
(項目70)
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目69に記載の使用。(項目71)
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目69から70までのいずれか一項に記載の使用。
(項目72)
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目70から71までのいずれか一項に記載の使用。
(項目73)
対象の靭帯の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
(項目74)
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目73に記載の使用。(項目75)
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目73から74までのいずれか一項に記載の使用。
(項目76)
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目74から75までのいずれか一項に記載の使用。
(項目77)
対象の皮膚の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
(項目78)
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目77に記載の使用。(項目79)
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目77から78までのいずれか一項に記載の使用。
(項目80)
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目78から79までのいずれか一項に記載の使用。
(項目81)
対象の骨の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
(項目82)
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目81に記載の使用。(項目83)
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目81から82までのいずれか一項に記載の使用。
(項目84)
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目82から83までのいずれか一項に記載の使用。
(項目85)
対象の軟骨の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
(項目86)
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目85に記載の使用。(項目87)
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目85から86までのいずれか一項に記載の使用。
(項目88)
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目86から87までのいずれか一項に記載の使用。
(項目89)
対象の椎間板の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
(項目90)
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目89に記載の使用。
(項目91)
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目89から90までのいずれか一項に記載の使用。
(項目92)
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目90から91までのいずれか一項に記載の使用。
本発明は、微小血管組織を処理して単離された多能性細胞または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織で構成される細胞膜を含む組成物を作製するための新規の方法の開発に一部基づく。種々の実施形態では、細胞または組織はこれらの手順の間に培養しない。組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有することが有利である。いくつかの実施形態では、手順の間に組成物を滅菌し、かつ/または前記組成物内のウイルスを不活化するが、それでも組成物は予想外の治療的有効性を示す。
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語を下で定義する。
本発明の複数の態様は、血管の組織、例えば、微小血管の組織を処理して多能性細胞またはその断片を含む組成物を作製する新規の方法に関する。特定の実施形態では、組成物は、1つまたは複数の追加的な組織成分をさらに含む。したがって、「処理された微小血管組織の組成物」という用語は、インタクトな多能性細胞を含んでもよく含まなくてもよい本発明の組成物を指す。特定の実施形態では、本発明の微小血管組織組成物は、インタクトな多能性細胞を全く含まない、または多能性生細胞を全く含まない、または生細胞を全く含まない。ある特定の実施形態では、本発明の微小血管組織組成物は、多能性細胞の断片または細胞膜を含む。本発明の「多能性細胞を含む組成物」または「多能性細胞組成物」は、多能性生細胞および/または多能性死細胞を含んでよい。
本発明の方法により、独特の多能性細胞組成物および微小血管組織組成物が作製される。本発明で提供される多能性細胞組成物および微小血管組織組成物は、いくつかの実施形態では、微小血管組織(例えば、脂肪組織、腱組織、または筋肉組織)の解離(例えば、酵素的消化による)により生じた幹細胞および/または前駆細胞の混合物を含み得る、最小限の処理がなされた培養されていない細胞または培養されていない微小血管組織(またはその成分)を含む。処理された多能性細胞の組成物および処理された微小血管組織の組成物は、追加的な分子(例えば、細胞外マトリックス分子または増殖因子の全体または断片化されたもの)を含んでよい。さらに、処理された多能性細胞の組成物および処理された微小血管組織の組成物は、実施形態に応じて、多能性細胞の断片または膜を含んでよい。さらに、処理された微小血管組織は、インタクトな多能性細胞を含んでも含まなくてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物をインプラント、マトリックスまたは足場と組み合わせる。マトリックスとしては、生体適合性の足場、格子、自己組織化構造などを挙げることができる。そのようなマトリックスは細胞に基づく療法、外科的修復、組織工学、および創傷治癒の技術分野で公知である。マトリックスは、本発明の組成物を用いて前処置する(例えば、本発明の組成物を播種する、接種する、それと接触させる)ことができる。本発明のいくつかの態様では、組成物中に存在する細胞および/または組織成分はマトリックスに接着している。一部の実施形態では、細胞は、マトリックスの間隙内に含有される、またはそれに架橋している。特定の実施形態では、細胞および/または他の組織成分はマトリックスと密接に付随しており、治療的に使用する場合、それにより対象の細胞の内部成長および/または血管新生が誘導または支持される。
本発明は、本発明の組成物、例えば、医薬組成物を含むキットをさらに含む。組成物は、単独で、例えばバイアル中に、または、処理もしくは凍結保存された微小血管組織との組合せに適したものなどの他の製品と組み合わせて包装することができる。別の材料と一緒に包装する場合、処理または凍結保存された微小血管組織は、他の材料と別々に包装することもでき、他の材料と予備混合することまたはそれに付随させることもできる。一部の実施形態では、処理された微小血管組織を生体適合性材料へのコーティングとして、またはインプラント、マトリックスもしくは足場に付随させて包装する。
本発明の組成物、ならびに前記組成物を含むインプラント、マトリックス、および/または足場は、それを必要とする対象における傷害または疾患を処置または予防するために使用することができる。種々の実施形態では、組成物を、それを必要とする組織またはそれを必要とする組織の近く、例えば、それを必要とする組織の周囲の組織に直接提供するまたは適用することができる。それを必要とする対象としては、本発明の組成物を用いた処置が有効であり得る傷害もしくは疾患を有する対象、または傷害もしくは疾患のリスクがある対象が挙げられる。特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、またはウマなどである。ある特定の実施形態では、対象は、治癒能力が低下している、例えば、糖尿病の対象および化学療法を受けている対象などである。
微小血管組織の調製および特徴付け
この研究では、微小血管組織を異なるプロセスによって調製し、次いで、アッセイする。簡単に述べると、少なくとも5〜10lbの皮下脂肪を臓器ドナーから得、以下の通り処理する:組織を細かく切る;それを酵素により解離させる;希釈し(クエンチなし)、回転させ、デカントし、次いで、細胞ペレットを洗浄する;凍結乾燥緩衝液中に再懸濁させる;そして、凍結乾燥する。処理に使用する基本条件は以下の通りである:脂肪組織を組織ドナーから外科的に回収する。はさみを用いて組織を細かく切り、0.2U/mlのCIzyme AS(Vitacyte、Indianapolis、IN)を伴うPBSに、37℃で60分穏やかに撹拌しながら懸濁させ、次いで、3回洗浄し、M3D中に1ml当たり細胞200万個で再懸濁させる。細胞懸濁液を凍結乾燥する直前まで室温で保持し、凍結乾燥する直前に、細胞をEZ−CPZ(商標)凍結保存培地(Incell
Corp.、San Antonio、TX)を用いて50:50に希釈し、バイアルに入れ、冷却するために凍結乾燥器トレーにローディングする。試料を、プロセスの間とプロセスの最後の両方でアッセイする。
材料を注文し、調整し、設定し、試験する。
脂肪組織を臓器ドナーから得る。皮下脂肪を腹部、大腿および臀部から取得する。5〜10ポンドの脂肪を収集し、ZTM(商標)transport medium(Incell Corp.、San Antonio、TX)に入れる。
この研究において使用する様々な種類のアッセイ(M1〜M5)(表2)を以下に簡単に要約する。
観察に基づく読み取りおよびデータを解析のためにエクセルまたはプリズムに移行する。比較分析のために、各TPSおよび各細胞型についての試料反復の平均+SD値を表にし、かつ/またはプロットする。
ラットにおけるアキレス腱傷害の処置
この研究により、本発明の微小血管組織調製物を使用して、アキレス腱傷害を修復することができることが実証される。
コラーゲンでコーティングしたバイオ繊維足場
処理された微小血管組織調製物AおよびBを滅菌WFIで再構成し、足場に吸収させる。処理された微小血管組織の組成物Aは滅菌せず、処理された微小血管組織の組成物BはEビームで滅菌する。
マウスにおける虚血の処置
この研究により、虚血肢のマウスモデルにおける本発明の処理された微小血管組織の組成物の効果が実証される。虚血肢のマウスモデルを以前に記載されている通り創出し(Jang Jら、Circulation 1999年;Huang Nら、JOVE 2009年)、それを使用して、後肢虚血の誘導後の血管新生の促進における細胞調製物の効果を評価する。
血流を0日目、3日目、7日目、11日目および14日目にLaser Doppler Imagingによって評価する。
SCIDマウスにおける血管形成
これらの研究では、本発明の微小血管組織調製物のin vivoにおいて血管構造を形成する能力を実証するためにマトリゲルプラグアッセイを利用する。マトリゲルプラグアッセイは、in vivoにおける真の血管形成の決定的なアッセイである。このアッセイは、マトリゲルを用いて治療用細胞を腹部領域の皮下に植え込むことを伴う。2週間の過程中、マトリゲル中の細胞は新生血管を形成するのに好都合な環境にあり、そのいくつかが宿主血管と吻合し得る。
ラットにおける関節リウマチの処置
この研究では、ラットにおける7日間で確立されたII型コラーゲン関節炎に付随する炎症、軟骨破壊および骨吸収の阻害における本発明の微小血管組織調製物の有効性が実証される。
動物の数:44
種/系統または品種:Lewisラット
ベンダー:Charles River
到着時の年齢/体重:125〜150g
性別:雌
研究開始時の年齢範囲:最初の免疫時に少なくとも125グラム。
馴化:BBPに到着した後4〜8日間、馴化させる。
収容:ケージ当たり動物3〜5匹
試験物(処理された微小血管組織の組成物の調製物)および適切なビヒクル。トリアムシノロンおよび希釈用の滅菌生理食塩水(BBP)、ウシII型コラーゲン(Elastin Products)、フロイント不完全アジュバント(Difco)。
ラットをイソフルランで麻酔し、フロイント不完全アジュバント注射液ID/SC中ウシII型コラーゲン300μlを、背中の末端部に拡散させて、部位当たり100μlを0日目、および再度6日目に与える。
馴化させた動物をイソフルランで麻酔し、コラーゲン注射する(D0)。6日目に、その動物を2回目のコラーゲン注射のために再度麻酔する。コラーゲンは、0.01Nの酢酸中4mg/ml溶液を用意することによって調製する。等体積のコラーゲンとフロイント不完全アジュバントを、手で混合することにより、この材料のビーズの形態が水に入れた際に保持されるまで乳化させる。各動物に対して毎回300μlの混合物を背中の3箇所の皮下部位にわたって拡散させる(部位当たり100μl)。
名称(ベンダー):II型コラーゲン(Elastin Products)
意味:ウシII型コラーゲン
特性:可溶性、新生仔ウシ関節由来
保管条件:2〜8℃
純度:>99.6%
名称(ベンダー):フロイント不完全アジュバント(Difco)
意味:不完全アジュバント
保管条件:2〜8℃
試験物ビヒクル:注射日に調製した幹細胞調製物、トリアムシノロン(Vetalog、Ft.Dodge)。
生存相の実行
関節炎の重症度による各群へのランダム化を関節炎1日目(研究10日目)に行う。ランダム化後に処置(両側性IA、40μl/関節)を開始する(1日目)。体重および足首のカリパス測定値/スコアを毎日取得する。
関節炎7日目に全採血によって動物を屠殺する。
固定液中に1〜2日、次いで脱灰器内に4〜5日置いた後、足首関節を縦方向に半分に切断し、膝を前頭面で半分に切断し、処理し、包埋し、切片作製し、トルイジンブルーで染色する。
コラーゲン関節炎の足首および膝に、以下の基準に従って炎症、パンヌス形成および骨吸収に関して0〜5のスコアをつける:
膝および/または足首の炎症
0=正常
0.5=最小の限局性炎症
1=滑膜/関節周囲の組織への炎症細胞の最小の浸潤
2=軽度の浸潤
3=中程度の浮腫が伴う中程度の浸潤
4=顕著な浮腫が伴う顕著な浸潤
5=重度の浮腫が伴う重度の浸潤
0=正常
0.5=軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、辺縁帯およびほんのわずかな関節のみが影響を受けている。
1=軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、辺縁帯が主に影響を受けている。
2=軽度の浸潤(辺縁帯において脛骨または足根骨の<1/4)
3=中程度の浸潤(辺縁帯において脛骨の1/4〜1/3またはわずかな足根骨が影響を受けている)
4=顕著な浸潤(辺縁帯において脛骨または足根骨の1/2〜3/4が影響を受けている)
5=重度の浸潤(辺縁帯において脛骨または足根骨の>3/4が影響を受けている、構造全体の重度の歪み)
0=正常
0.5=軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、辺縁帯およびほんのわずかな関節のみが影響を受けている。
1=軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ1〜10%が影響を受けている。
2=軽度の浸潤(脛骨または大腿骨の表面または軟骨下領域の1/4に至るまでにわたって進展している)、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ11〜25%が影響を受けている
3=中程度の浸潤(脛骨または大腿骨の表面または軟骨下領域の>1/4であるが<1/2にわたって進展している)、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ26〜50%が影響を受けている
4=顕著な浸潤(脛骨または大腿の表面の1/2〜3/4にわたって進展している)、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ51〜75%が影響を受けている
5=重度の浸潤、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ76〜100%が影響を受けている
0=正常
0.5=T blue染色の最小の減少、辺縁帯のみが影響を受けており、ほんのわずかな関節が影響を受けている
1=トルイジンブルー染色の最小〜軽度の減少、明白な軟骨細胞の減少またはコラーゲンの破壊は伴わない
2=トルイジンブルー染色の軽度の減少、限局性の軽度(表在性)の軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊が伴う
3=トルイジンブルー染色の中程度の減少、多巣性の中程度(中央の帯域までの深さ)の軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊が伴う、よりわずかな足根骨が1/2〜3/4の深さに影響を受けており、極めて少ない領域の全層の減少が伴う
4=トルイジンブルー染色の顕著な減少、多巣性の顕著な(深部の帯域までの深さの)軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊が伴う、1または2のわずかな足根骨表面が軟骨の全層の減少を有する
5=トルイジンブルー染色の重度の広範性の減少、多巣性の重度の(石灰化線までの深さの)軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊、2を超える軟骨表面が影響を受けている
0=正常
0.5=T blue染色の最小の減少、辺縁帯のみが影響を受けている
1=トルイジンブルー染色の最小〜軽度の減少、明白な軟骨細胞の減少またはコラーゲンの破壊は伴わない
2=トルイジンブルー染色の軽度の減少、限局性の軽度(表在性)の軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊が伴う、軟骨の50%の深さが影響を受けているいくつかの小さな領域があり得る
3=トルイジンブルー染色の中程度の減少、多巣性〜広範性の中程度(中央の帯域までの深さ)の軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊を伴う、1つの表面の全幅の1/4未満および全ての表面の全幅の25%以下が全層の減少の影響を受けている1〜2の小さな領域があり得る
4=トルイジンブルー染色の顕著な減少、多巣性〜広範性の顕著な(深部の帯域までの深さの)軟骨細胞の減少および/もしくはコラーゲンの破壊、または1つの表面がほぼ完全に減少しており、他の表面は部分的に減少しており、総合した全ての表面の幅の50%未満が完全に全体的に減少している
5=トルイジンブルー染色の重度の広範性の減少、大腿骨および/または脛骨の両方に多巣性の重度の(石灰化線までの深さの)軟骨細胞の減少および/またはコラーゲンの破壊、総合した全ての表面の幅の50%超が完全に全体的に減少している
0=正常
0.5=最小の吸収、辺縁帯のみが影響を受けており、ほんのわずかな関節が影響を受けている
1=小さな領域の吸収、低い拡大率では容易に明らかにならない、極めて少ない破骨細胞
2=軽度=より多くの領域の吸収、低い拡大率では容易に明らかにならない、より多くの破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の<1/4が吸収されている
3=中程度=髄質骨梁骨および皮質骨の明白な吸収、皮質における全層欠損は伴わない、いくつかの髄質骨梁の減少、低い拡大率で明らかな病変、より多くの破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の1/4〜1/3が影響を受けている
4=顕著=皮質骨における全層欠損、多くの場合、残りの皮質表面のプロファイルの歪みが伴う、髄骨の顕著な減少、多数の破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の1/2〜3/4が影響を受けている
5=重度=皮質骨における全層欠損、多くの場合、残りの皮質表面のプロファイルの歪みが伴う、髄骨の顕著な減少、多数の破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の>3/4が影響を受けている、構造全体の重度の歪み
0=正常
0.5=最小の吸収、辺縁帯のみが影響を受けている
1=最小=小さな領域の吸収、低い拡大率では容易に明らかにならない、軟骨下骨の全関節幅のおよそ1〜10%が影響を受けている
2=軽度=より多くの領域の吸収、軟骨下骨の明確な減少、軟骨下骨の全関節幅のおよそ11〜25%が影響を受けている
3=中程度=軟骨下骨の明白な吸収、軟骨下骨の全関節幅のおよそ26〜50%が影響を受けている
4=顕著=軟骨下骨の明白な吸収、軟骨下骨の全関節幅のおよそ51〜75%が影響を受けている
5=重度=破壊に起因する全関節の歪み、軟骨下骨の全関節幅のおよそ76〜100%が影響を受けている
0=正常
1=かすかな、多巣性の異染色性染色、関節周囲の組織の過剰な増大なし
2=濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の過剰な増大なし
3=濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の軽度の増大
4=濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の中程度の増大
5=濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の重度の増大
臨床データ
スチューデントのt検定またはマン・ホイットニーのU検定(ノンパラメトリック)を使用してデータを解析する。該当する場合には、一元配置分散分析(一元配置ANOVA)またはクラスカル・ワリス検定(ノンパラメトリック)を適切な多重比較事後検定と一緒に使用して、群全てにわたってデータをさらに解析する。示されていなければ、統計解析は未加工の(変換していない)データのみに対して実施する。統計的検定により、データの正常性および分散の均一性に関するある特定の仮定がなされ、検定によりこれらの仮定に侵害が生じた場合にはさらなる解析が必要になり得る。全ての検定についての有意性をp≦0.05に設定する。
%阻害=A−B/A×100
A=疾患対照の平均−正常の平均
B=処置の平均−正常の平均
ヤギにおける骨の間隙、軟骨欠損および半月板病変の処置
この研究では、骨の間隙、軟骨欠損および半月板病変の処置における本発明の微小血管組織調製物の効果が実証される。この研究では、各動物について、右後膝関節を手術し、3つの異なる別々の外科的欠損を創出する。試験した各右大腿骨には、大腿骨外側上顆領域に直径8mm、深さ20mmまでの骨欠損を1つ生じさせ、滑車溝に4×7mmの長方形、深さ2mmまでの軟骨欠損を1つ創出し、内側半月の白色−白色域(white−white zone)に長さ7mm、幅1〜2mmまでの全層半月板欠損を1つ創出する。動物3匹の処置群の各欠損は微小血管組織調製物で処置し、一方、対照群の欠損には足場のみを充填する。8週間の時点でヤギを評価して、種々の欠損部位における修復された組織を評価し、特徴付ける。処置された欠損は全体の外観および組織学的外観が対照と比較して優れることが予想される。
処理されたラット微小血管組織を使用した細胞遊走アッセイ
処理された微小血管組織の組成物の細胞遊走に対する効果を実証するために、ヒト内皮細胞の遊走(処理された微小血管組織の組成物による化学誘引)および脂肪由来の間質血管画分(SVF)細胞による標識した処理された微小血管組織の組成物の微小胞(MV)取り込みのアッセイを展開し、組成物の生物活性の尺度として使用した。
処理された微小血管組織の組成物の内皮細胞に対する化学誘引能力をアッセイするために、組成物の試料をトランスウェルプレートの下のチャンバーに入れ、オレンジ−赤色蛍光親油性色素(CM−DiI)で標識した内皮細胞の遊走を12〜48時間、経時的にモニターした。アッセイは、既知組成の凍結保存培地EZ−CPZ(商標)(Incell
Corp.、San Antonio、TX)を100%で、およびベースライン対照としてEZ−CPZ(商標)とM3D(商標)(Incell Corp.、San Antonio、TX)培地の50/50混合物も含んだ。
M3D(商標)は、INCELLにより製造された既知組成培養培地である。いくつかのアッセイでは、M3D(商標)に抗生物質(1×PSF:Pen/Strep/Fungizone抗生物質/抗真菌薬;Invitrogen、Grand Island NY)を補充した。M3D:10培地(INCELL)は10%ウシ胎児血清(FBS)および1×PSFを補充したM3D(商標)であった。EZ−CPZ(商標)(Incell Corp.、San Antonio、TX)は、既知組成の細胞凍結保存培地である。EZ−CPZ(商標)およびEZ−CPZ(商標):M3D(商標)(1:1;v/v)を参照対照培地として使用した。
2つの処理された微小血管組織の組成物、すなわち、BMAおよびBMBを調製し、試験した。BMA試料はラットSVF細胞であり、BMBはラット骨髄単核細胞であり、それぞれ1ml当たり細胞106個で凍結乾燥したものであった。ラットSVF細胞は、はさみを用いて精巣上体の脂肪パッドを直径1mmよりも大きな小片がなくなるまで細かく切り、次いで洗浄し、PBS中1U/mlのCIzyme AS(Vitacyte、Indianapolis、IN)中、37℃で60分穏やかに撹拌しながらインキュベートすることによって調製した。細胞を2回洗浄し、凍結乾燥緩衝液中に1ml当たり106個で再懸濁した。ラット骨髄細胞は、大腿骨および脛骨にACDA/PBS溶液を流し、20gaの針を通して吸引および排出を繰り返すことによって解離させることによって得た。次いで、骨髄細胞をフィコール勾配で分離し、PBS+1%FBSで2回洗浄し、緩衝液に再懸濁した。表14に示されている通り、凍結乾燥した後、BMA試料では検出限界を下回る(10,000を下回る)細胞数が示されたが、BMB試料では60万〜100万の細胞数および10〜50%の生存能力(トリパンブルー)が示された。
凍結乾燥した材料を1×PSFを伴うUFDI水1ml中に再構成した。この全試料のうち、300μlを3つのウェルのそれぞれの下部に入れ、200μlのM3Dを用いて最終的な体積を500μlにした。上部のチャンバーを試料ウェルにセットし、CM−DiIで標識したHUVEC p2細胞をそれぞれに同数入れた。プレートを37℃でインキュベートし、12時間、24時間および48時間の時点でウェルを画像化した。視野内の細胞を計数することによって画像を調査して結果を決定した。
凍結乾燥した材料の残りの100μlをCM−DiIと一緒にインキュベートして、存在する細胞膜を標識した。材料を、M3D+1×PSFを用いて遠心分離によって3回洗浄した。吸収アッセイのために48ウェルプレートに播種したSVF細胞を50%集密まで成長させ、CM−DiIで標識した凍結乾燥した材料50μlを上に層状に重ねた。24時間の時点でウェルの半分をすすぎ、液体封入剤でコーティングし、乾燥させた;あとの半分は、すすぎ、固定し、3日後に封入した。画像を調査して結果を決定した。
標識した内皮細胞のトランスウェル遊走
ウェルの全てについて、12時間の時点で下のチャンバーには最小数の細胞が存在した。図2および図3〜7の最初の段を参照すると、時間が進行するにつれ、細胞が下のチャンバーに遊走し始めた。試料の一部ははるかに急速に下のチャンバーに引き寄せられた。図2に見られる通り、BMA試料ではBMBよりも細胞が誘引される傾向があった。BMA緩衝液2試験群では、試験試料の中で24時間の時点では細胞数が最低であったが、48時間の時点では細胞数が最高であった。全体的に、BMA試料は緩衝液2を伴うBMB試料よりも良好な働きをし、緩衝液1よりも高い遊走速度を誘導する傾向が示された(しかし統計的には有意でない)。
このアッセイを実施して、処理された微小血管組織の組成物のMVがSVF(間質血管画分)細胞内に輸送されるかどうかを決定した。各バイアル中の処理された微小血管組織の組成物材料の残りの100μlを、細胞自体が死んでいるとしても細胞膜に組み入れられるCM−DiIを用いて標識付けることによってアッセイを実施した。SVF細胞を、M3D:10培地を伴う48ウェルプレートにプレーティングし、接着させ、およそ50%集密になるまで成長させた。標識した材料50μlをウェルに加え、6時間インキュベートした。ウェルをM3D(商標)で3回すすぎ、湿性封入剤を用いて固定した。図8および図9に見られる通り、画像により、色素がSVF細胞に移行しているので、細胞のいくつかが実際に材料を取り込んだことが示された。
このアッセイにおいて、放射線照射を伴うまたは伴わないBMA凍結乾燥材料およびBMB凍結乾燥材料は内皮細胞に対する化学誘引物質として作用した。材料に放射線照射した場合には細胞移動の軽度の減少が認められた。緩衝液1と緩衝液2の間の差異は無視できるものであった。
微小血管組織のin vitroおよびin vivoにおける効果
上記の通り、種々の幹細胞調製物により、動物試験および臨床研究において種々の指標についての有益な効果が示された。多くの場合、投与された幹細胞の生存は比較的乏しい。したがって、本研究は、上記のいくつかの実施形態に関連して考察されている通り、幹細胞に付随する治療的利益のいくつか(または全て)を実現するために生存可能な幹細胞が必要かどうかに取り組むために設計した。本研究では、上に開示されている方法に従って処理された、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源である微小血管組織を使用した。
新鮮に単離し、凍結乾燥および凍結乾燥/滅菌した微小血管組織の細胞数および生存能力が表16に示されている。各調製物の表現型が表17に示されている。
DNA染色の核取り込みに基づく)。しかし、微小血管組織を凍結乾燥することにより、微小血管組織中の細胞のトリパンブルーを排除する能力が有意に低下する。凍結乾燥により、生存細胞の百分率のおよそ70%の低下が誘導される。放射線に曝露させることにより、生存能力がさらに低下し、したがって、微小血管組織中の細胞のおよそ2%のみが生存可能であった。さらに、機能的な間葉系幹細胞についてアッセイした場合(確立したコロニー形成単位−線維芽細胞(CFU−F)アッセイを使用する)、凍結乾燥または凍結乾燥/滅菌した調製物において機能的な間葉系幹細胞は検出されなかった。
た。種々のやり方で処理した微小血管組織を虚血した肢に0日目、3日目、および7日目に導入し、0日目、7日目、および14日目にマウスをレーザードップラーによって画像化した。図11に示されている通り、生理食塩水を注射した対照の動物では、7日後または14日後に血流の回復がほとんど示されない(虚血した肢は矢印で示されている)。対照的に、凍結乾燥した微小血管組織では、14日目までに少なくとも部分的な血流の回復がもたらされた。しかし、凍結乾燥/滅菌した微小血管組織では、7日目までに血流の有意な増加がもたらされ、14日目の血流は反対側の対照肢と大きく区別できなかった。これらのデータにより、in vitroにおける遊走データが確証され、いくつかの実施形態では、凍結乾燥/滅菌した微小血管組織により血流の回復を増強することができることが示される。
Claims (7)
- 治療剤を含む、損傷した神経の処置のための組成物であって、前記治療剤は、濃縮された多能性細胞を含み、前記組成物は、前記組成物の送達を必要とする対象に送達されることを特徴し、前記組成物中に存在する前記細胞の2%以下が生存可能である、組成物。
- 前記多能性細胞が、放射線照射によって滅菌されている、請求項1に記載の組成物。
- 前記多能性細胞が、微小血管組織から単離されている、請求項1に記載の組成物。
- 前記多能性細胞が、望ましくない組織成分から分離されている、請求項1に記載の組成物。
- 治療剤の送達が、損傷した神経の領域への注射または外科的適用を含む、請求項1に記載の組成物。
- 治療剤の送達が、全身注射を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記治療剤が、皮膚または神経組織に直接またはその近くに適用される散剤、ヒドロゲル、パテまたは溶液である、請求項1に記載の組成物。
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