DE69534151T2

DE69534151T2 - Gefriergetrocknete Blutzellen, Stammzellen und Plättchen und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE69534151T2
Application number: DE69534151T
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Iijima; Yoshikazu Hoya-shi Ishii; Nobuhiro Funakoshi; Keiji Okada; Tadamichi Urawa-shi Kawada
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-21
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2015-02-22
Also published as: EP0668013A2; EP0668013A3; EP0668013B1; DE69534151D1; US5656498A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten Blutzellen, Stammzellen und Plättchen, das kein besonderes Kühlmittel und/oder Vorrichtung während des Kühlens benötigt, so dass nur eine geringe Energiemenge benötigt wird, wobei Mischen/Entfernen eines Gefrierschutzmittels, wie Glycerol oder Ähnlichem unnötig ist.
Relevanter Stand der Technik
Hinsichtlich der Erhaltung des eigenen Blutes für eine Transfusion in Zeiten, in denen es notwendig ist, und seltenen Blutes, das für Notfälle für Menschen gelagert wird, die seltene Bluttypen besitzen, Blut für allgemeine Transfusion, ebenso wie Blutbestandteile der zuvor Genannten benötigen alle Lagerung. Diese Lagerungszeit schließt für gewöhnlich Zeiträume von mindestens einem Monat ein.
Bei der Langzeitlagerung von Blut und Blutbestandteilen stellen ein Gefrierverfahren zum Gefrieren des Genannten bei –80°C unter Verwendung eines elektrischen Gefriergerätes, ein Gefrierverfahren unter Verwendung von flüssigem Stickstoff (ungefähr –196°C Lagerung) und ein Gefrierverfahren unter Verwendung von flüssigem Helium (–270°C Lagerung) bekannte Verfahren dar. Alle diese bekannten Blutlagerungsverfahren benötigen ein besonderes Kühlmittel, Behälter zum Kühlen und eine Energiequelle zum Durchführen des genannten Kühlens. Zusätzlich ist es vor der Gefrierlagerung notwendig, einige Gefrierschutzmittel, Verbindungen, die lebende Zellen gegen den Gefrierschaden von wachsenden Eiskristallen oder einigem Stress schützen, hinzuzumischen, wie einige Glycerol lösungen mit dem Blut, und anschließend dieses Gefrierschutzmittel zu dem Zeitpunkt der Verwendung nach dem Auftauen zu entfernen.
Zusätzlich werden in der Langzeitlagerung von Blut und Blutbestandteilen dieses Langzeitlagerungsverfahren von Blut und Blutbestandteilen in der folgenden Weise durchgeführt.
Ein Beispiel, in dem konzentrierte rote Blutzellen (Hämatokritwert = 55 ~ 90 %) gefroren werden, wird im Folgenden erklärt (der Hämatokritwert ist der Anteil von Blutzellbestandteil gegenüber Gesamtblutbestandteil: der normale Hämatokritwert von Blut eines gesunden Menschen ist ungefähr 45 ~ 50 %).

1) Unter Verwendung von Natriumcitrat oder Heparin als ein Anticoagulant wird Blut, das Spendern entnommen wurde, zentrifugiert und getrennt, um Plasma zu entfernen, und der Puffermantel bildet dadurch konzentrierte rote Blutzellen, die einen Hämatokritwert von 55 ~ 90 % besitzen.
2) Eine äquivalente Menge an Gefrierschutzmitteln umfassend hauptsächlich Glycerol wird anschließend zu diesen konzentrierten roten Blutzellen hinzugefügt. Diese Lagerungslösung kann beispielsweise das Folgende umfassen:
Die genannte Zusammensetzung wird in gereinigtem Wasser gelöst und auf ein Endvolumen von 100 ml gebracht.
3) Das Blut wird nach dem Mischen anschließend in ein Lagerungsgefäß gegeben und gefroren. Beim Gefrieren von Blut, das in ein Gefäß gegeben wurde, das normalerweise in der Transfusion verwendet wird (Volumen 200 ml), hängt die durchschnittliche Kühlgeschwindigkeit von dem Verfahren ab; jedoch wird ein schnelles Verfahren bei ungefähr 100°C/min kühlen, während ein langsames Verfahren bei einigen °C/min kühlen wird. Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Kühlgeschwindigkeit des Blutes, der Glycerolkonzentration und der Hämolyse (die der Todesrate von Blutzellen entspricht) des Blutes nach dem Auftauen. Wenn man versucht, die Hämolyse auf weniger als einen festgelegten Wert zu begrenzen, genügt es im Falle einer schnellen Kühlgeschwindigkeit, Glycerol in einer verhältnismäßig geringen Konzentration zu verwenden, während es im Fall einer niedrigen Kühlgeschwindigkeit notwendig ist, Glycerol in einer verhältnismäßig hohen Konzentration zu verwenden. In der Praxis werden die folgenden zwei Verfahren verwendet. a)Hoch-Konzentrationsglycerol-niedrige-Gefriergeschwindigkeit-Verfahren b) Niedrig-Konzentrationsglycerol-hohe-Gefriergeschwindigkeit-Verfahren In a) wird die Eryoschutzlösung enthaltend Glycerol der Zusammensetzung, die in 2) erwähnt ist, zu einer äquivalenten Menge an Blut hinzugefügt, in ein geeignetes Gefäß gegossen und in ein elektrisches Gefriergerät bei –80°C gestellt. Zu diesem Zeitpunkt erreicht das Blut innerhalb des genannten Gefäßes eine Temperatur von –80°C in einem Zeitraum, der von zehn Minuten bis zwei Stunden reicht, somit beträgt die durchschnittliche Kühlgeschwindigkeit 1 ~ 10°C/min. Wenn beispielsweise das Kühlen von Raumtemperatur (20°C) für die eine Einheit der konzentrierten roten Blutzellen (≈ 200 ml) stattfindet, ist die durchschnittliche Kühlgeschwindigkeit = {20–(–80)}/10 ~ {20–(–80)}/120 = 10 – 0,83 1 ~ 10°C/min.
Im Fall von b), wenn zum Beispiel eine Niedrig-Konzentrationsglycerollösung aus 28 % Glycerol, 3 % Mannitol und 0,65 % NaCl zu einer äquivalenten Menge an Blut hinzugefügt wird, in ein geeignetes Gefäß gegossen und in flüssigen Stickstoff getaucht wird, erreicht das Blut innerhalb des genannten Gefäßes gemäß dieses Verfahrens die Temperatur des flüssigen Stickstoffs (–196°C) in 1 ~ 2 Minuten von Raumtemperatur. Deshalb beträgt die durchschnittliche Kühlgeschwindigkeit 2 – 4°C/sek. für eine Einheit des Bluts (≈ 200 ml). durchschnittliche Kühlgeschwindigkeit = {20–(–196)}/60 ~ {20–(–196)}/120 = 3,6 ~ 1,8 = 2 ~ 4°C/sek.
4) Zum Zeitpunkt der Verwendung nach dem Herausnehmen des Blutes aus einem Gefriergerät wird schnelles Auftauen unter Verwendung eines Wasserbades von ungefähr 40°C durchgeführt.
5) Nach dem Auftauen wird das Glycerol durch Waschen des Blutes unter Verwendung einer physiologisch isotonischen Salzlösung, wie Salzlake oder Ähnlichem entfernt. Dieses Verfahren benötigt einige Stunden um durchgeführt zu werden.

Hinsichtlich des Verfahrens zum Granulieren des Blutes ist herkömmlich ein Verfahren zum Durchführen von Granulierung mittels Durchführen von tropfenweisem Hinzufügen unter Verwendung eines Gases in flüssigem Stickstoff bekannt.
Zum Beispiel können Einzelheiten des genannten Verfahrens gefunden werden durch Bezugnahme auf T. Sato (A Study of Red Blood Cell Freeze Storage Using Droplet Freezing [übersetzt]; Journal of the Hokkaido University School of Medicine, Vol. 58, Nr. 2, Seiten 144 ~ 153 (1983)). In diesem Verfahren wird ein Verfahren, in dem die einströmende Luftstärke derart eingestellt ist, dass sie Tröpfen von verschiedenen Größen bildet, als das Verfahren zur Granulierung verwendet. In dem obigen Fall ist die Größe der Tröpfchen zum Mischen mit einem Gas relativ groß, z.B. 0,7 ~ 2,8 mm wie in 4 des genannten Dokuments gezeigt ist. Die Wiederherstellungsrate [100 – (die Hämolyse der roten Blutzellen)] ist ebenfalls schlecht, sie schwankt in dem 35 ~ 70 % Bereich. In derselben Figur, wenn die Größe auf 0,5 mm reduziert wird, fällt die Wiederherstellungsrate zusätzlich unter 20 %, was zur Verwendung ungeeignet ist.
In diesem Verfahren wird ein doppeltes Röhrchen verwendet, das aus einem Polyethylen inneren Röhrchen mit einem inneren Durchmesser von 0,4 mm, umgeben von einem äußeren Röhrchen mit einem inneren Durchmesser von 3 mm gebildet wird. Auf diese Weise wird Blut von dem inneren Röhrchen eingeführt, während Gas von dem äußeren Röhrchen eingeführt wird. Unter Verwendung der Bernoulli-Theorie wird Blut durch das Bilden von negativem Druck an dem Auslassende des inneren Röhrchens eingeführt, und Gas wird hineingemischt. Diese Mischung wird anschließend tropfenweise zu flüssigem Stickstoff hinzugefügt, der unterhalb des Genannten angeordnet ist. Die Körnchengröße der Bluttropfen wird gemäß dem Durchmesser des inneren Röhrchens bestimmt, während die tropfenweise Geschwindigkeit mittels der Flussmenge des Gases, das in das äußere Röhrchen fließt, bestimmt wird.
Folglich können gemäß diesem Verfahren, wie in der genannten 4 gezeigt ist, nur große Körnchen von 0,7 mm bis 2,8 mm oder Körnchen eines extrem begrenzten Bereiches gebildet werden. Wie in derselben Figur gezeigt ist, steigt die Körnchengröße wenn der Durchmesser des inneren Röhrchens vergrößert wird, was wiederum zu einem Anstieg in der Hämolyse führt. Zusätzlich be wirkt das Reduzieren des Durchmessers des inneren Röhrchens Verblenden, und tropfenweises Hinzufügen des Blutes wird dann unmöglich.
Mit anderen Worten kann in dem herkömmlichen Granulierungsverfahren, aufgrund der Verwendung eines einfachen Systems eines negativen Drucks basierend auf der Bernoulli-Theorie, eine ausreichende Kontrolle über die Granulierung nicht erhalten werden. Somit existieren Nachteile, wie eine große Körnchengröße im Bereich von 0,7 mm – 2,8 mm, so dass die Bildung von Körnchen von 0,5 mm oder weniger nicht möglich ist. Im Fall einer Körnchengröße von 0,5 mm ist die Kontrolle schwierig, was zu einer extrem schlechten Wiederherstellungsrate (d.h. die Hämolyse ist hoch) führt.
Die herkömmlichen Verfahren zum Lagern von Blut, die oben beschrieben wurden, besitzen den folgenden Nachteil.

1) Das Kühlverfahren benötigt ein spezielles Kühlmittel und ein Gefäß, was wiederum das Zuführen einer großen Menge an Energie benötigt. Beispielsweise sind flüssiger Stickstoff und flüssiges Helium teuer, sie kosten jeweils 100 Yen pro Liter und 3.000 Yen pro Liter, und sie benötigen ein besonders Gefäß bezüglich Verschluss und Kühlisolierung.
2) Eine Gefrierschutzlösung, die hauptsächlich aus Glycerol besteht, wird verwendet, und deshalb ist es notwendig, Zeit zum Entfernen des Glycerols nach dem Auftauen und vor der Verwendung vorzusehen.

Wie oben beschrieben, besitzen die herkömmlichen Blutlagerungsverfahren Probleme dahingehend, dass diese Verfahren ein spezielles Kühlmedium und Gefäße ebenso benötigen wie eine große Energiezufuhr. Darüber hinaus ist das Entfernen des Glycerols komplex und benötigt Zeit; somit können diese Verfahren nicht in Notfällen oder eiligen Situationen verwendet werden.
Zusätzlich besitzt das herkömmliche Blutgefrierverfahren unter Verwendung eines Tröpfchenverfahrens dahingehend Nachteile, dass zusätzlich zu der erhaltenen großen Körnchengröße (0,7 mm bis 2,8 mm) eine hohe Hämolyse resultiert, die nicht an eine praktische Verwendung angepasst werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen von gefriergetrockneten Blutzellen, Stammzellen und Plättchen bereitzustellen, das nur eine geringe Menge an Energie zur Lagerung benötigt, und bei normalen Temperaturen oder in einem Standardkühlschrank gelagert werden kann, wobei ein Verfahren zum Entfernen des Glycerols nicht notwendig ist.
Um dieses Ziel zu erreichen, stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten Blutzellen, Stammzellen und Plättchen bereit, umfassend die Schritte:
Vorbehandeln einer Flüssigkeit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut einschließlich Blutzellen, Knochenmarksflüssigkeit (hämatopoetische Stammzellen) und Plättchen in Blutplasma, mit einer Lösung enthaltend wenigstens eine Substanz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saccharid, Biopolymer, Säure und Säuresalz;
Vollziehen von Granulierung der vorbehandelten Flüssigkeit; Durchführen von schnellem Kühlen der Körnchen; und
Trocknen des gefrorenen Produkts durch Sublimation des Wassergehalts darin.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Granulierung vollzogen wird durch gemischtes Sprühen mit einem Gas, um Körnchen einer ersten vorbestimmten Größe mit schnellem Kühlen zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung eines gefriergetrockneten Produkts eines Flüssigkeitstyps, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut einschließlich Blutzellen, Knochenmarksflüssigkeit (hämatopoetische Stammzellen) und Plättchen suspendiert in Plasma; das gefriergetrocknete Produkt wird aus Clustern und/oder poröser Substanz, die eine Größe von nicht größer als 1 mm besitzen, gebildet und umfasst Körnchen, die eine Größe von einigen μm bis einige 100 μm besitzen.
Die GB-A-1 395 651 offenbart ein Sprühverfahren von Serum oder Plasma unter Verwendung von 16 bis 28 Gaugenadeln (Seite 2, rechte Spalte, Zeilen 96–98). Während des Sprühens durch Nadeln wird die Größe der Partikel durch Auswählen des Durchmessers der Nadeln kontrolliert. Jedoch kann in diesem Verfahren eine ausreichende Kontrolle über die Granulierung nicht erreicht werden, wie oben bezüglich herkömmlicher Verfahren beschrieben wurde.
Es gibt keine Beschreibung, die das gemischte Sprühen mit einem Gas und einer Cluster- (Produkt einer zweiten vorbestimmten Größe) Bildung in der GB-A-1 395 651 vorschlägt.
Die EP-A-474 409 an LIVESEY et al., lehrt ein Gefrierverfahren unter Verwendung einer cryogenen rotierenden Trommel und einer schabenden Schneide, wobei Blutkörnchen von der Trommel geschabt, in einem Gefäß gesammelt und anschließend gefriergetrocknet werden.
Zusätzlich offenbart die EP-A-474 409 eine Ultraschallvernebelung unter Verwendung einer Ultraschall-atomisierenden Düse (Seite 5, Zeilen 20–27). Es gibt keine Beschreibung in diesem Dokument, die das gemischte Sprühen mit einem Gas vorschlägt. Das gemischte Sprühen mit einem Gas ist in der Wirksamkeit der Granulierung der Ultraschallatomisierung überlegen.
In LIVESEY's Verfahren, selbst wenn Mikrotröpfchen mit Durchmessern von ungefähr 25 bis 250 μm mit dem Ultraschallvernebler erzeugt werden können, besitzt der Ultraschallvernebler nur eine geringe Leistung, die Mikrotröpfchen zu verteilen, und im Allgemeinen schwingt sein Schlag, wie durch die Pfeile 32 angezeigt ist, so dass die Mikrotröpfchen die Oberfläche 16 über einen Abgabemechanismus 34 erreichen können. In diesem Fall ist jedoch der Schlag (an die Oberfläche 16) zu lang, so dass die gebildeten Mikrotröpfchen dazu neigen, aneinander zu heften, was zu Mikrotröpfchen mit größeren Durchmessern führt.
Im Gegensatz dazu ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, Körnchen mit kleineren Durchmessern als jenen, die in den 3–5 gezeigt sind, zu erzeugen, und diese Körnchen bilden Cluster oder poröse Produkte mit einer großen Zahl von Poren auf der inneren Wand des gekühlten Gefäßes durch einen Sedimentationseffekt. Solche Cluster oder poröse Produkte stellen einen Vorteil beim Trocknen und ihrer Gewinnung davon dar.
Die obigen EP und GB Dokumente lehren weder noch schlagen sie ein Verfahren vor, bei dem die Granulierung einer Flüssigkeit mittels gemischtem Sprühen mit einem Gas, wie in der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
Zusätzlich lehren die obigen GB- und EP-Dokumente weder noch schlagen sie vor, dass ein gefrorenes Produkt einer zweiten vorbestimmten Größe (Cluster) aus Körnchen einer ersten vorbestimmten Größe in dem schnellen Kühlen erhalten werden.
Die WO-A-92 14360 offenbart ein Verfahren für die Lyophilisierung einer Mischung von kernhaltigen Zellen und Blutstoffen umfassend Eintauchen der Mischung in eine gepufferte Lösung, die Monosaccharid und Polymere einschließt und Sprühen der Zelle durch Sublimation des Wassers.
Dieses Dokument offenbart nicht, noch schlägt es das gemischte Sprühen mit einem Gas vor.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Blockdiagramm, das ein verfahrensmäßiges Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.
2 ist ein Querschnittdiagramm, das ein Beispiel einer Vorrichtung zum Durchführen von Granulierung und schnellem Gefrieren gemäß der vorliegenden Erfindung, und die Körnchenbewegung zeigt.
3 ist eine Graphik, die das Verhältnis zwischen durchschnittlicher Körnchengröße und Luftinjektionsdruck gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
4 ist ein Diagramm, das die Körnchengrößenverteilung an dem Auslass der Düse in dem Fall zeigt, wenn die Granulierung einer Flüssigkeit mit Blut bei einem Luftdruck von 1 kg/cm² unter Verwendung der Düse, der in 3 gezeigt ist, durchgeführt wird.
5 ist ein Diagramm, das die Körnchengrößenverteilung an dem Auslass der Düse in dem Fall zeigt, wenn die Granulierung einer Flüssigkeit mit Blut bei einer Luftdruck von 4 kg/cm² unter Verwendung der Düse, der in 3 gezeigt ist, durchgeführt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.
Der Begriff "Blut" wird in der Beschreibung der Ausführungsformen und der hier im Folgenden enthaltenden Figuren verwendet, so dass er wegen der Einfachheit Blut und Blutbestandteile bedeutet.
Im Folgenden wird eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, als ein Beispiel von Blut, basierend auf den Figuren.
1 ist ein Blockdiagramm, das ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt. In dieser Figur ist ein Mischmechanismus 1 zum Mischen von Blut 2 und Vorbehandlungszusatzlösung 3; die resultierende gemischte Flüssigkeit 7 dieses Blutes und der Vorbehandlungszusatzlösung; der Granulierungsmechanismus 4 zum Durchführen von Granulierung der gemischten Flüssigkeit aus dem Blut und der Vorbehandlungszusatzlösung; der Kühl-(Gefrier-)Mechanismus 5 zum Kühlen (Gefrieren) der gemischten Flüssigkeit, die oben granuliert wurde; der Trockenmechanismus 6; gefriergetrocknetes Blut 8, das für die Lagerung erhalten wurde; der Lagerungsmechanismus 9 (der im Folgenden erklärt wird) und der Wiederherstellungsmechanismus 10 gezeigt.
Als Blut 2 werden zum Beispiel konzentrierte rote Blutzellen mit einem Hämatokritwert von 55 ~ 90 % verwendet. Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich das genannte Blut vorzubehandeln. Als ein Beispiel einer Vorbehandlungszusatzlösung 3, kann eine Lösung enthaltend wenigstens einen Typ eines Saccharids, Biopolymers, Säure und Säuresalz erwähnt werden. Die konzentrierten roten Blutzellen werden anschließend mit der genannten Vorbehandlungszusatzlösung unter Verwendung einer geeigneten Menge von beiden Bestandteilen gemischt. Für das Mischverfahren kann irgendein Standardverfahren verwendet werden, wie Rühren, Bewegen, Vibration oder Ähnliches. Zusätzlich kann das Mischverfahren das Gießen des Blutes in die Vorbehandlungszusatzlösung, oder vice versa umfassen. Es ist bevorzugt, dass die Vorbehandlungszusatzlösung zu dem Blut während des Rührens hinzugefügt wird.
Das genannte Saccharid ist wenigstens ein Saccharid, das ausgewählt ist unter Mannose, Xylose, Glukose, Trehalose, Sucrose und Maltose.
Das genannte Biopolymer umfasst wenigstens ein Biopolymer, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Phosphat, Polyvinylpyrolidon (PVP) und Albumin. Als das genannte Phosphat können Phosphorylcholinchlorid (Sigma Reagenz Nr. P0378), 5-Phosphorylribose-1-pyrophosphat (Sigma Reagenz Nr. P8296), C₃H₃NO₆P (Sigma Reagenz Nr. P5506), C₃H₅NO₆P (Sigma Reagenz P0753), C₃H₈NO₆P (Sigma Reagenz Nr. P0878) und C₃H₁₀NO₆P (Sigma Reagenz Nr. P1003) erwähnt werden. Beispiele von Salzen der zuvor Genannten schließen Natriumsalze und Calciumsalze ein.
Als das genannte Albumin kann wenigstens ein Typ von Albumin genannt werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Albumin, Rinderalbumin und Eiweißalbumin.
Beispiele des genannten humanen Albumin schließen Sigma Reagenz Nr. A-1653, Sigma Reagenz Nr. A-1887, Sigma Reagenz Nr. A-9511, Sigma Reagenz Nr. A-8763, Sigma Reagenz Nr. A-3782, Sigma Reagenz Nr. A-6784, Sigma Reagenz Nr. A-6019, Sigma Reagenz Nr. A-6909, Dinitrophenol (Sigma Reagenz Nr. A-6661), und Ähnliche ein.
Zusätzlich schließt das genannte Rinderalbumin Sigma Reagenz Nr. A-2153, Sigma Reagenz Nr. A-3350, Sigma Reagenz Nr. A-4503, Sigma Reagenz Nr. A-3425, Sigma Reagenz Nr. A-9647, Sigma Reagenz Nr. A-8022, Sigma Reagenz Nr. A-6003, Sigma Reagenz Nr. A-2934, Sigma Reagenz Nr. A-9543, Sigma Reagenz Nr. A-4628, Sigma Reagenz Nr. A-7888, Sigma Reagenz Nr. A-4378, Sigma Reagenz Nr. A-3424, Sigma Reagenz Nr. A-7511, Sigma Reagenz Nr. A-7638, Sigma Reagenz Nr. A-0281, Sigma Reagenz Nr. A-3059, Sigma Reagenz Nr. A-3902, Sigma Reagenz Nr. A-7906, Sigma Reagenz Nr. A-6793, Sigma Reagenz Nr. A-6918, Sigma Reagenz Nr. A-3912, Sigma Reagenz Nr. A-7409, Sigma Reagenz Nr. A-7534, Sigma Reagenz Nr. A-7284, Sigma Reagenz Nr. A-1662, Sigma Reagenz Nr. A-3299, Sigma Reagenz Nr. A-3174, Sigma Reagenz Nr. A-7159, Sigma Reagenz Nr. A-7034, Sigma Reagenz Nr. A-3294, Sigma Reagenz Nr. A-7030, Sigma Reagenz Nr. A-9430, Sigma Reagenz Nr. A- 3803, Sigma Reagenz Nr. A-7688, Sigma Reagenz Nr. A-3675, Sigma Reagenz Nr. A-9306 und Ähnliche ein.
Beispiele des genannten Eiweißalbumins schließen Sigma Reagenz Nr. A-5253, Sigma Reagenz Nr. A-5378, Sigma Reagenz Nr. A-5503, Sigma Reagenz Nr. A-2512, Sigma Reagenz Nr. A-7641, Sigma Reagenz Nr. A-3154 und Ähnliche ein.
Zusätzlich schließen Beispiele der/des genannten Säure oder Säuresalzes wenigstens eine Substanz ein, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phytinsäure (auch als Inositolhexaphosphorsäure: IHP bekannt), Pyrophosphat, Adenosintriphosphat (ATP) und 2,3-Diphosphoglycerinsäure (2,3-DPG).
Beispiele des genannten Pyrophosphats schließen Calciumsalze (Ca₂P₂O₇), Eisensalze (Fe₄(P₂O₇)₃), Kaliumsalze (K₄P₂O₇), Natriumsalze (Na₂H₂P₂O₇ oder Na₄P₂O₇·10H₂O), Zinnsalze (Sn₂P₂O₇), Tributylammoniumsalze und Ähnliche ein.
Der pH-Wert der Vorbehandlungszusatzlösung 3 wird bei einem Wert zwischen 4 und 9 kontrolliert, und vorzugsweise zwischen 7,0 und 8,0. Die Reagenzien, die in diesem Verfahren verwendet werden, schließen Dikaliumhydrogen-phosphat und Kalium-dihydrogen-phosphat ein. Eine 1/15 molare Konzentrationslösung von jedem der Genannten wird gebildet, und diese Lösungen werden gemischt, um einen Puffer zu bilden. Die Vorbehandlungszusatzlösung (die im Folgenden erklärt wird) wird hergestellt in dem dieser Puffer als eine Basis verwendet wird. Die Endkonzentration wird eingestellt, so dass ein pH-Wert von 4 bis 9 und vorzugsweise ein pH-Wert von 7,0 und 8,0 daraus resultiert. In dem Fall wenn ein pH-Wert weniger als 4 beträgt, besteht eine Tendenz, dass sich die Zellmembran verhärtet, was zur Zerstörung der Deformationseigenschaften führt. Zusätzlich besteht eine Tendenz, dass sich die Zellmembran bei einem pH-Wert von größer als 9 auflöst.
Der Granulierungsmechanismus 4, wie in 2 gezeigt, kann zum Beispiel gemischtes Sprühen eines Gases, wie Luft, Stickstoffgas oder Ähnliches und Blut (die genannte gemischte Flüssigkeit) umfassen. Es ist möglich, die Granulierung mittels eines Kopfbestandteils, der unter Verwendung von Ultraschall angetrieben wird, durchzuführen.
2 ist ein Querschnittdiagramm, das einen Apparat zum Durchführen der Granulierung und des schnellen Gefrierens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, und die Bewegung der resultierenden Körnchen zeigt.
In 2 sind eine Düse 11, Gas 12, verteilte, gemischte Flüssigkeit 13, ein Gefäß 14 zur Blutgewinnung, ein Verschluss 14', Kühlmedium 15, ein Gefäß 16 zum Kühlen, eine Öffnung 17 zur Gasgewinnung, eine Drehachse 18 für das Gefäß 14, Drehrichtung 19 und ein Düsendurchmesser 20 vorgesehen. Wie in 2 gezeigt, durchläuft die gemischte Flüssigkeit eine verteilte Granulierung durch Mischen mit Gas 12 über die Düse 11. Die verteilte gemischte Flüssigkeit 13 ist in derselben Figur gezeigt. Das Gefäß 14 zur Verwendung bei der Blutgewinnung wird mittels eines Kühlmediums 15, wie flüssigem Stickstoff oder Ähnlichem gekühlt, das in das Gefäß 16 zur Kühlung gegeben wird. Die verteilte gemischte Flüssigkeit 13 wird schnell über die innere Wand des Gefäßes 14 zur Verwendung bei der Blutgewinnung gekühlt.
Gemäß den herkömmlichen Kühlverfahren, selbst bezüglich der genannten schnellen Kühlverfahren, im Fall der Granulierung zusätzlich zu einer hohen Hitzeleitfähigkeit (selbst in dem Fall wenn die Kühlgeschwindigkeit pro Einheit Volumen dieselbe ist), weil das Volumen selbst klein ist, wird die Kühlgeschwindigkeit pro Körnchen extrem groß.
Wenn beispielsweise das Kühlgeschwindigkeitsverhältnis abgeschätzt werden soll unter Berücksichtigung nur der Volumeneffekte, führt der Ver gleich der durchschnittlichen Kühlgeschwindigkeit mit Blut (oben beschriebener Fall) von einem Volumen von 200 ml zu der folgenden Berechnung: durchschnittliches Kühlgeschwindigkeitsverhältnis = v (Kühlgeschwindigkeit von 200 ml gepackten Zellen)/(Kühlgeschwindigkeit von Sphären mit Radius 10 μm) = 200/(4π(10 × 10–4)3/3) = 5 × 1010 mit anderen Worten, 5 × 10¹⁰-fach des Genannten.
Tatsächlich werden die Körnchen eines nach dem anderen oben auf den gefrorenen Körnchen verteilt, die an der inneren Wand des Gefäßes anheften, auf diese Weise reichern sich die Körnchen schrittweise an, während ihre granulierte Form erhalten bleibt, um große Aggregate zu bilden, d.h. große verzweigt geformte Cluster, wie beispielhaft in der vergrößerten Ansicht gezeigt ist, die mittels 2 dargestellt ist. Zusätzlich ist es alternativ möglich, ein großes Produkt mit einer großen Zahl von Poren zu bilden. Folglich ist die Kühlgeschwindigkeit dieser Körnchen, welche die oben beschriebenen Cluster oder das poröse Produkt bilden, kleiner als das genannte Verhältnis von 5 × 10¹⁰. Aufgrund der Abwesenheit eines aktuellen Mechanismus zum Messen dieser Quantität ist es schwierig, exakte Zahlen zu liefern, jedoch wird ein Verhältnis von wenigstens ungefähr 10³ bis 10⁶, in anderen Worten eine Kühlgeschwindigkeit von 1.000°C/sek. bis einige Millionen °C/sek. geschätzt.
Weil folglich die Kühlgeschwindigkeit ausreichend größer ist als die Kristallbildungsgeschwindigkeit von Eis des Wassers, das in dem genannten Blut enthalten ist, werden während des Gefrierens keine großen Eiskörnchen gebildet, und das Blut (Blutzellen) wird/werden gefroren, ohne das es/sie beschädigt wird/werden. Dieses Hochgeschwindigkeitskühlen trägt zu einer noch größeren Wiederherstellungsrate von Blutzellen bei, wenn es mit der genannten Vorbehandlungszusatzlösung kombiniert wird. Durch das Bereitstellen eines rotierenden Me chanismus 19 um die Achse 18, um eine konstante Kühlgeschwindigkeit aufrecht zu erhalten, ist es möglich äquivalente Kühlbedingungen für Blut aufrecht zu erhalten, welches an das Gefäß 14 zur Verwendung bei der Blutgewinnung anheftet. In dem Gefäß 14 zur Blutgewinnung ist eine Öffnung 17 zur Gasgewinnung vorgesehen, die als ein Mechanismus dient, der den Anstieg des Drucks innerhalb des Gefäßes begrenzt. Folglich ist es durch die genannte Struktur möglich, eine große Menge an Blut zu granulieren und zu kühlen. Zusätzlich besitzt das Gefäß 14 zur Blutgewinnung eine sterile Struktur.
Um die Kühleffizienz zu steigern, ist es möglich, das Gefäß 14 zu drehen, und/oder das Gefäß 14 während der Drehung zu kippen. Zusätzlich ist es in einem steril verschlossenen Gefäß auch möglich, die sofortige Gewinnung durch Sprühen in ein drehendes Kühlen unter Verwendung einer Schneide, wenn notwendig durchzuführen; die Gewinnung durch Sprühen auf einer Kühlplatte, die eine Plattenform aufweist und unter Anwendung einer relativen Geschwindigkeit, wenn notwendig, durchzuführen; die sofortige Gewinnung unter Verwendung einer Schneide und der Anwendung einer relativen Geschwindigkeit, wenn notwendig unter Verwendung einer Vielzahl von Düsen durchzuführen und/oder die sofortige Gewinnung nur unter Verwendung einer Schneide durchzuführen.
Die genannte Düse 11 besitzt vorzugsweise die folgenden Mechanismen. Mit anderen Worten werden in der Düse zur ultrafeinen Körnchenbildung mittels eines Hochgeschwindigkeits-Vortex-Gases, das in der japanischen Patentanmeldung, zweite Veröffentlichung, Nr. Hei-4-21551 (Veröffentlichungsdatum: 10. April 1992/japanisches Patent Nr. 1730868) eine Flüssigkeitseinspritzdüse; eine ringförmige Vortex-Kammer, die an einer Position gebildet wird, die zu der genannten Flüssigkeitseinspritzdüse passt; eine Vielzahl von gebogenen Einfuhröffnungen, die sich in einer Vortex-Weise in die Vortex-Kammer zum Einführen eines Hochgeschwindigkeitsluftstroms in die Vortex-Kammer erstrecken; und eine ringförmige Gaseinspritzdüse, die sich vor der Flüssigkeitseinspritzdüse öffnet und der Flüssigkeitseinspritzdüsenseite der Vortex-Kammer zugewendet ist, zum Vorstehen und Bilden eines dünnen konischen Hochgeschwindigkeits-Vortex, der einen Fokus vor der Flüssigkeitseinspritzdüse besitzt. Zusätzlich ist es auch möglich, Düsen zu verwenden, welche dieselben Funktionen besitzen, wie in dem japanischen Patent Nr. 1689645, japanischen Patent Nr. 1689660, japanischen Patent Nr. 1757351 und japanischen Patent Nr. 1770496 offenbart. Die genannten Dokumente offenbaren verschiedene Beispiele von Gas- und Flüssigkeitseinführverfahren.
In der genannten Struktur, wohingegen die innere Struktur der Düse in 2 nicht exakt gezeigt ist, wird die Pulverisierung • Granulierung einer Flüssigkeit durchgeführt mittels der Bildung eines Gases, das aus einem Gaseinführungsausgang eingeführt wird, mittels einer Vielzahl von gebogenen Einführöffnungen, die sich in einer Vortex-Weise in die Vortex-Kammer zum Einführen eines Hochgeschwindigkeitsluftstroms in die Vortex-Kammer erstrecken. Der resultierende Gas-Vortex gelangt durch die Vortex-Kammer und steht von der dünnen konischen, ringförmigen Gaseinspritzdüse vor, der einen Fokus vor der Flüssigkeitseinspritzdüse besitzt, um einen Hochgeschwindigkeits-Vortex zu bilden. Auf diese Weise wird die genannte Flüssigkeitspulverisierung • Granulierung durchgeführt. Mittels dieses Typs von Düse ist es möglich, die Granulierung einer Flüssigkeit einschließlich Blut (das im Folgenden beschrieben wird) durchzuführen. Zusätzlich ist die Verteilung der genannten Körnchengröße eng, und so ist es möglich, noch wichtiger, die Granulierung durchzuführen, um Körnchen von ungefähr derselben Größe zu bilden.
Das genannte Blut ist in flüssigen Tropfen (d.h. ein Aggregat einer Vielzahl von Blutzellen mit einer großen granulären Form) mit einer Körnchengröße verteilt, die in Abhängigkeit von dem Druck 12 des Gases variiert, das in und mit dem Düsendurchmesser 20 gemischt wird. In dem Fall wenn z.B. eine Düse mit einem Düsendurchmesser von 1,2 mm verwendet wird, ist das Verhältnis zwischen dem Druck des Gases und der genannten Körnchengröße wie in 3 gezeigt. Die vertikale Achse stellt die durchschnittliche Körnchengröße (mm) dar, während die horizontale Achse den Lufteinspritzdruck (kg/cm²) 23, 23' darstellt, wobei gebogene Linien das Verhältnis zwischen beiden, dem Gasdruck und der gebildeten Körnchengröße zeigen. Der gestrichelte Anteil von 3 stellt 1 ~ 20 cc/min. der blutgemischten Flüssigkeit dar. In dem Beispiel, dass in 3 gezeigt ist, d.h. im Fall wenn der Düsendurchmesser 1,2 mm betrug, besaßen die Körnchen, die über den Lufteinspritzdruckbereich von 0,5 ~ 6 kg/ cm² erhalten wurden, eine Größe von ungefähr einigen μm bis 40 μm, und sie waren verteilt und hefteten an dem Gefäß an. Wenn der Düsendurchmesser ansteigt, wandert die gebogene Linie 23 in die Richtung, die durch Pfeil 24 angezeigt ist, und damit ist es möglich, die Körnchengröße und die verwendete Menge der gemischten Flüssigkeit zu kontrollieren. Im Zuvorgesagten betrifft "Körnchen" das Produkt, das von der oben beschriebenen Düse verteilt wird, und "Cluster" bezeichnet ein Aggregat einer Vielzahl dieser Körnchen.
Die 4 und 5 zeigen Beispiele, in denen Flüssigkeiten, die Blut enthalten, bei jeweils 1 kg/cm² und 4 kg/cm² unter Verwendung der Düse, die in 3 beschrieben ist, granuliert und anschließend unter Verwendung eines Staubmessinstruments unter Verwendung eines Lasers gemessen wurden. Wie aus diesen Figuren ersichtlich ist, ist die erhaltene Körnchengröße kleiner als einige 10 μm, was zu einer scharten Verteilung und einer überlegenen Gleichheit der Größen führt. Darüber hinaus stellt in den 4 und 5 n die Zahl der zu messenden Körnchen dar.
Wie aus 3 entnommen werden kann, ist es möglich die Granulierung durch den Gasdruck und die Flüssigkeitsflussmenge bezüglich einem gegebenen Düsendurchmesser zu kontrollieren. Es ist auch möglich, die oben genannte Granulierung durch Steigern/Verringern des Düsendurchmessers zu kontrollieren. Zusätzlich ist die Kontrolle der Körnchengröße zwischen einigen Mikrometern und einigen hundert Mikrometern durch eine Einspritzdüse möglich; jedoch können im Fall von roten Blutzellen, bezüglich einer Zellgröße von vorzugsweise 10 μm bis 200 μm (Durchmesser der Körnchen) geeignete Ergebnisse unter Verwendung einer Einspritzdüse erreicht werden, die einen Durchmesser besitzt, der ungefähr einigen bis einigen zehn Zellen entspricht.
Wie oben beschrieben werden die Körnchen, die von der Einspritzdüse verteilt werden durch anschließendes Anheften an die Gefäßwand gekühlt (gefroren). Folglich akkumulieren in dem gefrorenen Blut einzelne Körnchen (sie behalten ihre original granulären Formen) und binden, um verzweigt förmige Cluster zu bilden. Zusätzlich können im Fall von konzentrierter Akkumulierung dieser Körnchen poröse Produkte mit einer großen Anzahl von Poren gebildet werden.
Zum Beispiel in dem Fall wenn Körnchen, die durch die Injektionsdüse verteilt sind, mit einer Körnchengröße von ungefähr 30 μm gebildet werden, werden verzweigt förmige Cluster oder poröse Produkte gebildet, die ungefähr einige 10 bis einige 100 Körnchen enthalten. Eine Beobachtung unter dem Elektronenscanningmikroskop zeigt verzweigt förmige Cluster und/oder poröse Produkte, die in der Größe von 100 bis einige hundert Mikrometer reichen, d.h. einer Gesamtgröße des Produkts nach dem Gefriertrocknen von 1 mm oder weniger (was im Folgenden erklärt wird).
Wie andererseits durch die vergleichenden Beispiele gezeigt wird, in dem Fall wenn keine Granulierung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, anstelle der Bildung der oben beschriebenen Produkte werden massige Feststoffe enthalten, die so die Lagerung und die Wiederherstellungsverfahren beschränken. Im Fall der unabhängigen Körnchen, die eine Körnchengröße von ungefähr 30 μm oder weniger aufweisen (d.h. in dem Fall wenn keine Cluster gebildet werden), aufgrund der Bildung eines leichtgewichtigen Pulvers nach dem Gefriertrocknen, werden diese Körnchen zusätzlich einfach verteilt und sind deshalb extrem schwierig zu handhaben.
Darüber hinaus ist es als ein Verfahren, das sich von dem oben beschriebenen Granulierungs- und Gefrierverfahren unterscheidet, auch möglich, ein Verfahren zu verwenden, in dem kleine Blutkörnchen durch Sprühen von Blut in ein Gas mit einer Temperatur von mindestens unterhalb des Gefrierpunkts gefroren werden. Dieses Verfahren wird als "Eisschreiber" bezeichnet und schließt ein Verfahren zum Bilden kleiner gefrorener Körnchen durch das Einfrieren einer Flüssigkeit in ein Stickstoffgas bei einer Temperatur von flüssigem Stickstoff ein.
Darüber hinaus ist es ideal, ein Sprühverfahren in Kombination mit jedem der genannten Verfahren durchzuführen.
Nach dem Abschluss eines Anheftungsverfahrens wird der Verschluss 14' sofort entfernt, und das Gefäß 14 für die Blutgewinnung wird in einen Vakuummechanismus 6 gestellt. Es ist möglich, einen herkömmlichen Trockner (in den Figuren nicht gezeigt) als diesen genannten Trocknungsmechanismus 6 zu verwenden. Weil das angeheftete/gefrorene Blut sich bei einer extrem niedrigen Temperatur befindet, wird die Herstellung von gefriergetrocknetem Blut 8 durch Durchführen einer Dehydration durch ein Sublimationsverfahren in dem genannten Trockner abgeschlossen. Zu diesem Zeitpunkt werden, wie oben beschrieben, verzweigt förmige Cluster oder poröse Produkte gebildet, die eine Größe von einigen hundert Micron besitzen.
Es ist möglich, gefriergetrocknetes Blut 8 in einem herkömmlichen Kühlschrank (Lagerungstemperatur von ungefähr 5°C) zu lagern. Zum Zeitpunkt der Verwendung wird das gefriergetrocknete Blut durch einen Wiederherstellungsmechanismus 10, der in 1 gezeigt ist, wiederherstellt, und nach dem Waschen kann dieses wiederhergestellte Blut in einer Transfusion oder Ähnlichem verwendet werden.
BEISPIELE
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung konkret durch die Beispiele beschrieben.
In den folgenden Beispielen 1 bis 7 und Vergleichsbeispielen 1 bis 3 wurden Xylose, Glukose, Mannose und Disaccharid von 1 bis 2 Mol und PVP mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40.000 verwendet. Zusätzlich wurden ähnli che Ergebnisse unter Verwendung von Pyrophosphat mit jeweils Natrium-, Calcium-, Kalium- und Eisensalzen erhalten.
Beispiel 1
Das vorliegende Beispiel betrifft die Wiederherstellungsrate von Blutzellen zu dem Zeitpunkt der Wiederherstellung nach der Lagerung. Eine Vorbehandlungszusatzlösung einer repräsentativen Zusammensetzung, die in Tabelle 1 (die im Folgenden beschrieben wird), gezeigt ist, wird hergestellt und mit einer äquivalenten Menge an Blut (konzentrierte rote Blutzellen: Hämatokritwert = 55 90 %) gemischt, danach wird die Granulierung • Gefriertrocknung durchgeführt. Der Lufteinspritzdruck und die Flüssigkeits- (Blut) Einspritzmenge wurden jeweils auf 1 kg/cm² und 20 cc/min. gesetzt, so wurden die Körnchengröße an dem Düsenauslassende auf durchschnittlich ungefähr 30 bis 40 μm geschätzt. Auf diese Weise wurden als das Produkt nach dem Gefriertrocknen verzweigt förmige Cluster von 300 bis 700 μm erhalten. Der Wassergehalt, der zum Zeitpunkt des Trocknens eingelagert war, betrug 0–30 %. Das resultierende Blut wurde in einem herkömmlichen Kühlschrank (Temperatur 5°C für 1 Monat gelagert und anschließend durch Hinzufügen der Vorbehandlungszusatzlösung in einer Menge wiederhergestellt, die identisch war zu jener zum Zeitpunkt des Mischen (Probe #1 und #2). Zu diesem Zeitpunkt, aufgrund der exzellenten Übereinstimmung der Wiederherstellungslösung, löste sich das gefriergetrocknete Blut einfach, und eine erfolgreiche Wiederherstellung wurde beobachtet. Die Proben #3 und #4, die für 3 Monate gelagert wurden, wurden ebenfalls hergestellt. Jedes resultierende Blut wurde für 10 Minuten bei 2.000 rpm zentrifugiert, der Überstand wurde gesammelt, und das Hämoglobin wurde unter Verwendung eines Blutzellzählers (Sysmecs NE-8000) gemessen. Dieses gemessene Ergebnis wurde anschließend durch die Hämoglobinzählung der gemischten Flüssigkeit vor der Granulierung • Gefriertrocknung (zuvor gemessener Wert geteilt), um die Hämolyse zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt war die Hämolyse nahe an der Wiederherstellungsrate nach Granulierung • Gefriertrocknung. Die Wiederherstellungsrate entspricht 100 – (Hämolyse) (%).
Vergleichsbeispiele 1 und 2
In den Vergleichsbeispielen 1 und 2 wurde jedes Experiment ohne Durchführung der Granulierung mittels des genannten Verfahrens durchgeführt, in dem, nachdem eine blutgemischte Flüssigkeit wie oben in eine Flasche gegeben wurde, gefriergetrocknetes Blut gemäß denselben Techniken hergestellt wurde. Das resultierende Produkt war ein getrockneter massiger Feststoff, der eine Form besaß, die ähnlich war zu der inneren Form des Gefäßes (es besteht keine Körnchengröße aufgrund des Weglassen des Granulierungsverfahrens). Dieses gefriergetrocknete Blut wurde gemäß denselben Techniken wie oben wiederhergestellt (Lagerungszeitraum einen Monat). Dieses genannte Produkt löste sich nicht einfach, wenn es in die Wiederherstellungslösung eingetaucht und gemischt wurde. Somit benötigte die Lösung (Wiederherstellung) einen langen Zeitraum. Zusätzlich wurde dasselbe Experiment (Vergleichsbeispiel 3) unter Verwendung einer Vorbehandlungszusatzlösung mit nur Glukose wiederholt. Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I gezeigt.
Tabelle 1
Beispiel 2
Hinsichtlich der Beispiele #1 bis #4 in Beispiel 1 wurde Granulierung gefolgt durch Gefrieren und Trocknen unter Verwendung eines Tintenjetkopfes durchgeführt, der in einem Nadeldrucker als Düse von Beispiel 1 verwendet wur de. Der Düsendurchmesser trug 100 μm. Der genannte Tintenjetkopf wurde durch einen Ultraschallbestandteil angetrieben, und die Lauffrequenz betrug 30 ~ 80 kHz. Das vorbehandelte Blut wurde anschließend in eine Tintenkartusche gegeben, und die Granulierung wurde durchgeführt. Die Größe des Blutes schwankte in Abhängigkeit von der Lauffrequenz. Der Bereich für das vorliegende Experiment führte zu einer Körnchengröße von ungefähr 5 – 30 μm.
Folglich wurde nach dem Messen der Wiederherstellungsrate der roten Blutzellen nach Gefriertrocknung (100 – Hämolyse) %, ein exzellentes Ergebnis von 75 – 95 % erhalten. In derselben Weise wie oben werden verzweigt förmige Cluster, die eine Größe von 100 μm oder weniger besitzen, in dem vorliegenden Experiment gebildet. Wie durch die genannten Ergebnisse gezeigt, besaß das gefriergetrocknete Blut der vorliegenden Erfindung eine überragende Lagerungsstabilität und eine ausreichende Wiederherstellungsrate für die praktische Verwendung. Deshalb kann dieses gefriergetrocknete Blut während der aktuellen Transfusion angewendet werden.
In den folgenden Beispielen 3 – 5 betrug das Molekulargewicht von jeweils PVP, Phosphat und Dextran ungefähr 40.000. Auf diese Weise wurden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung des Phosphats im Falle von jeweils Natriumsalzen und Calciumsalzen erhalten. Zusätzlich wurden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung des Pyrophosphats im Fall von Natriumsalz, Kaliumsalz, Calciumsalz und Eisensalz erhalten.
Beispiel 3
Die Vorbehandlungszusatzlösung der Zusammensetzung, die in Tabelle II gezeigt ist, wurde hergestellt, mit einer äquivalenten Menge an Blut gemischt, und dann granuliert • gefriergetrocknet. Die Granulierungs • Geschwindigkeit des schnellen Kühlens betrug 1.000°C/sek. ~ einige 1.000.000°C/sek., was ungefähr eintausend bis einige millionenfach der Kühlgeschwindigkeit der herkömmlichen Technik betrug. Der Wassergehalt, der zu dem Zeitpunkt des Trocknens eingelagert war, betrug 0 ~ 30 %. Die resultierenden verzweigt förmigen Cluster aus Blut wurden für einen Monat in einem herkömmlichen Kühlschrank (Temperatur 5°C) gelagert und anschließend durch Hinzufügen einer Vorbehandlungszusatzlösung in einer identischen Menge zu jener des Zeitpunkts des Mischens wiederhergestellt. Das resultierende Blut wurde anschließend für 10 Minuten bei 2.000 rpm zentrifugiert, der Überstand wurde gesammelt, und ein Hämoglobingehalt wurde unter Verwendung eines Blutzellzählers (Sysmecs NE-8000) aufgenommen. Diese Messung wurde dann durch den Hämoglobingehalt der gemischten Flüssigkeit (zuvor gemessen) vor Granulierung • Gefriertrocknung geteilt, um die Hämolyse zu erhalten. Die Hämolyse zu diesem Zeitpunkt war sehr nahe an der Wiederherstellungsrate nach Granulierung • Gefriertrocknung. Diese Ergebnisse sind in Tabelle II unten gezeigt.
Tabelle II
Tabelle II (Fortsetzung)
Beispiel 4
Mit der Ausnahme des Austauschens des Biopolymertyps, das in der Vorbehandlungszusatzlösung verwendet wurde, wurde das Experiment gemäß demselben Verfahren wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III unten gezeigt.
Tabelle III
Beispiel 5
Mit der Ausnahme des Austauschens des Säure- oder Säuresalztyps, das in der Vorbehandlungszusatzlösung verwendet wurde, wurde das Experiment gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 3 durchgeführt. Darüber hinaus waren die Konzentrationen für jeden Bestandteil wie folgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV unten gezeigt.
Tabelle IV
Das Blut nach der Wiederherstellung in den genannten Beispielen wurde anschließend unter Verwendung einer physiologischen Salzlösung oder Ähnlichem gewaschen und in der aktuellen Transfusion verwendet, wo exzellente Ergebnisse erhalten wurden.
In den folgenden Beispielen 6 ~ 8 und Vergleichsbeispiel 4 betrug das Molekulargewicht von jeweils PVP, Phosphat und Dextran 40.000. Auf diese Weise wurden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von Phosphat im Fall von jeweils Natriumsalzen und Calciumsalzen erhalten. Zusätzlich wurden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von Pyrophosphat im Fall von Natriumsalz, Kaliumsalz, Calciumsalz und Eisensalz erhalten. Zusätzlich betrug der pH-Wert hauptsächlich 7,4, und die Wiederherstellungsrate von Flüssigkeiten mit verschiedenen pH-Werten von 4 bis 9 nach dem Gefriertrocknen, Lagerung der Wiederherstellung führte zu ähnlichen Werten.
Beispiel 6
Eine reine Blutzusammensetzung (konzentrierte rote Blutzellen) und die Vorbehandlungszusatzlösung, die in Tabelle V gezeigt ist, wurden jeweils hergestellt und mit einer äquivalenten Menge an Blut gemischt. Anschließend wurde die Granulierung • Gefriertrocknung an diesen jeweiligen Präparationen durchgeführt. Die Granulierung • Geschwindigkeit des schnellen Kühlens betrug 10³°C/sek. ~ 10⁶°C/sek., was beim Vergleich mit der Kühlgeschwindigkeit der herkömmlichen Technik zu einer Geschwindigkeit von 10³ ~ 10⁶-mal so schnell wie die Genannte führte. Der Wassergehalt, der zu dem Zeitpunkt des Trocknens eingelagert war, betrug nur 0 ~ 30 %. Nachdem das resultierende getrocknete Blut (das Produkt gleicht verzweigt förmigen Clustern) in einem Standardkühlschrank (Temperatur 5°C) für einen Monat gelagert wurde, wurde die reine Blutpräparation unter Verwendung einer äquivalenten Menge der Vorbehandlungszusatzlösung wiederhergestellt, während die Vorbehandlungszusatzlösung wiederhergestellt wurde unter Verwendung einer Vorbehandlungszusatzlösung in einer Menge identisch jener zum Zeitpunkt des Mischens. Die resultierenden Blutpräparationen wurden anschließend für 10 Minuten bei 2.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde jeweils gesammelt. Die Hämoglobingehalte wurden anschließend durch einen Blutzellzähler (Sysmecs: NE-8000) aufgenommen. Diese Werte wurden jeweils durch den Hämoglobingehalt der gemischten Flüssigkeit (gemischte Flüssigkeit jeweils der konzentrierten roten Blutzellen und der Vorbehandlungszusatzlösung), die zuvor vor der Granulierung • Gefriertrocknung gemessen wurden, geteilt, um für jedes eine Hämolyse zu erhalten. Basierend auf der Hämolyse zu diesem Zeitpunkt wurden die Wiederherstellungsraten nach der Granulierung Gefriertrocknung nahe bei (100 – Hämolyse) % bestätigt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt.
Tabelle V
Beispiel 7
Mit der Aufnahme, dass der Biopolymertyp, der in der verwendeten Vorbehandlungszusatzlösung eingesetzt wurde, ausgetauscht wurde, wurde das Experiment gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse sind Tabelle VI unten gezeigt.
Tabelle VI
Beispiel 8
Mit der Ausnahme, dass der Säuretyp oder Säuresalztyp, der in der verwendeten Vorbehandlungszusatzlösung eingesetzt wurde, ausgetauscht wurde, wurde das Experiment gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 6 durchgeführt. Darüber hinaus waren die Konzentrationen für jeden Bestandteil wie folgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII unten gezeigt.
Tabelle VII
Das Blut aus dem obigen Beispielen nach der Wiederherstellung wurde mit einer physiologischen isotonischen Salzlösung oder Ähnlichem gewaschen und anschließend in einer aktuellen Transfusion verwendet, wo exzellente Ergebnisse erhalten wurden.
Vergleichsbeispiel 4
Die konzentrierten roten Blutzellen aus Tabelle V wurden gefroren (die Gefrierzeit benötigte einige Minuten) und unter Verwendung der langsamen, herkömmlichen Kühlgeschwindigkeit ohne Durchführen der Granulierung getrocknet. Nach dem Trocknen entstand ein massiger Feststoff, der verschieden war von dem verzweigt förmigen Cluster und/oder der porösen Substanz, die in dem obigen Beispielen beschrieben ist. Anschließend, nachdem die gefriergetrockneten Zellen unter denselben Bedingungen wie oben gelagert wurden, wurde das Blut unter Verwendung der Vorbehandlungszusatzlösung behandelt. Dieses Verfahren führte zu der Zerstörung aller Blutzellen, was eine Wiederherstellungsrate von null ieferte.
In den folgenden Beispielen 9 ~ 11 und Vergleichsbeispiel 5 wurde humanes Albumin und Rinderalbumin eingesetzt, die jeweils ein Molekulargewicht von 66.000 besaßen. Somit wurden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung des humanen Albumins und in gleicher Weise für Rinderalbumin erhalten. Zusätzlich wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, selbst in dem Fall, wenn wenigstens zwei Typen von Albumin, ausgewählt unter humanem Albumin, Rinderalbumin und Eiweißalbumin, in der Mischung verwendet wurden. Der pH-Wert resultierte hauptsächlich in einem Wert von 7,4: ähnliche Werte wurden auch für die Wiederherstellungsrate nach Gefriertrocknung/Lagerung/Wiederherstellung in dem Fall erhalten, wenn Lösungen von pH-Werten zwischen 4 und 9 verwendet wurden.
Beispiel 9
Eine reine Blutzusammensetzung (konzentrierte rote Blutzellen) und die Vorbehandlungszusatzlösung, die in Tabelle VIII gezeigt ist, wurden jeweils hergestellt, und mit einer äquivalenten Menge an Blut gemischt. Die Granulierung • Gefriertrocknung wurden anschließend mit diesen jeweiligen Präparationen durchgeführt. Die Granulierung schnelle Kühlgeschwindigkeit betrug 10³°C/sek. 10⁶°C/sek., die anschließend mit der Kühlgeschwindigkeit der herkömmlichen Technik verglichen wurde, was zu einer 10³ ~ 10⁶-fachen Geschwindigkeit der Genannten führte. Der Wassergehalt, der zu dem Zeitpunkt der Trocknung eingelagert war, betrug 0 ~ 30 %. Es wurde bestätigt, dass die Form des resultierenden getrockneten Bluts zu verzweigt förmigen Clustern oder porösen Produkten mit einer Größe von einigen hundert Micron führte. Nachdem das resultierende getrocknete Blut in einem herkömmlichen Kühlschrank (Temperatur 5°C) für einen Monat gelagert wurde, wurde die reine Blutpräparation unter Verwendung einer äquivalenten Menge der Vorbehandlungszusatzlösung wiederhergestellt, während die Vorbehandlungspräparation unter Verwendung der Vorbehandlungszusatzlösung in einer Menge, die identisch war zu jener zum Zeitpunkt des Mischens, wiederhergestellt wurde. Die resultierenden Blutpräparationen wurden anschließend für 10 Minuten bei 2.000 rpm zentrifugiert, und der Überstand wurde jeweils gesammelt. Der Hämoglobingehalt wurde anschließend durch einen Blutzellzähler (Sysmecs: NE-8000) aufgenommen. Diese Werte wurden jeweils durch den Hämoglobingehalt der gemischten Flüssigkeit (jeweils gemischte Flüssigkeit der konzentrierten roten Blutzellen und der Vorbehandlungszusatzlösung), die vor der Granulierung/Gefriertrocknung gemessen wurden, geteilt, um eine Hämolyse für jede zu erhalten. Basierend auf der Hämolyse zu diesem Zeitpunkt wurden die Wiederherstellungsraten nach der Granulierung/Gefriertrocknung nahe bei (100 – Hämolyse) % bestätigt. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle VIII gezeigt.
Tabelle VIII
Tabelle VIII (Fortsetzung)
Beispiel 10
Mit der Ausnahme, dass der Albumintyp, der in der verwendeten Vorbehandlungszusatzlösung eingesetzt wurde, ausgetauscht wurde, wurde das Experiment gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 9 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX unten gezeigt.
Tabelle IX
Beispiel 11
Mit der Ausnahme, dass der Säuretyp oder Säuresalztyp, der in der verwendeten Vorbehandlungszusatzlösung eingesetzt wurde, ausgetauscht wurde, wurde das Experiment gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 9 durchgeführt. Darüber hinaus waren die Konzentrationen für jeden Bestandteil wie folgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle X unten gezeigt.
Tabelle X
Das Blut in den obigen Beispielen wurde nach der Wiederherstellung mit einer physiologischen isotonischen Salzlösung oder Ähnlichem gewaschen und anschließend in einer aktuellen Transfusion verwendet, wo exzellente Ergebnisse erzielt wurden.
Vergleichsbeispiel 5
Die konzentrierten roten Blutzellen aus Tabelle VIII wurden gefroren (die Gefrierzeit benötigte einige Minuten) und unter Verwendung der langsamen, herkömmlichen Kühlgeschwindigkeit ohne Durchführen der Granulierung getrocknet. Das getrocknete Blut führte zu einer massigen Festsubstanz. Anschließend, nach dem Lagern der gefrorenen Zellen unter denselben Bedingungen wie oben, wurde das Blut mit einer Vorbehandlungszusatzlösung behandelt. Dieses Verfahren führte zu der Zerstörung aller Blutzellen, was eine Wiederherstellungsrate von null lieferte.
Beispiel 12
Mit der Ausnahme, dass die Knochenmarksflüssigkeit, die von humanen Patienten durch das folgende Verfahren entnommen wurde, gegen die reine Blutzusammensetzung (konzentrierte rote Blutzellen) aus Beispiel 9 ausgetauscht wurde, wurde die Vorbehandlungszusatzlösung, die in Tabelle XI gezeigt ist, hergestellt, mit einer äquivalenten Menge von Knochenmarksflüssigkeit gemischt und anschließend granuliert • gefriergetrocknet gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 9. Das Produkt resultierte in verzweigt förmigen Clustern mit einer Größe von einigen hundert Micron. Darüber hinaus wurde als das Albumin, das in der Vorbehandlungszusatzlösung von Tabelle XI enthalten ist, Zusammensetzungen von wenigstens zwei Typen des oben beschriebenen Rinderalbumins und/oder humanen Albumins (derselbe oder verschiedene Typen von Albumin) jeweils verwendet, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten.
Die oben genannte Knochenmarksflüssigkeit schließt sowohl einen Extrakt ein, der direkt von dem Knochenmark entnommen wird als auch Stammzellen (periphere hämatopoetische Stammzellen), die in dem peripheren Blut aus Knochenmark durch eine chemische Behandlung oder Ähnliches mobilisiert wurden. Im Folgenden wird ein Beispiel des zuletzt Genannten erklärt. Die vorliegen de Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt. Zusätzlich können Details zu dem Genannten in der Referenz C. Shimazaki und M. Nakagawa ("Method for Extracting Autoperipheral Hemopoietic Stem Cells, and Transplant Effects for the Same"; Transfusion Medicine [übersetzt] Vol. 75, S. 1049: Juli Ausgabe 1993) gefunden werden.
Nach dem Durchführen einer Extraktion unter Verwendung eines CS3000-Model Apparats (hergestellt von Fenwal Co.) wurde 6 % HES (Hydroxyethylstärke) zu dem Blutextrakt in dem Transfusionspaket hinzugefügt. Die roten Blutzellen wurden entfernt, nachdem sie sich für eine Stunde abgesetzt hatten. Anschließend wurde nach dem Zentrifugieren für ungefähr 10 Minuten bei 1800 rpm das PRP (plättchenreiche Plasma) entfernt, um die gewünschten Stammzellen (periphere hämatopoetische Stammzellen) zu erhalten.
Nach dem Gefriertrocknen und Lagern für einen Monat in einem herkömmlichen Kühlschrank (Temperatur: ungefähr 5°C) wurden die Stammzellen unter Verwendung einer Flüssigkeit derselben Zusammensetzung wie die genannte Vorbehandlungszusatzlösung wiederhergestellt. Die resultierenden Stammzellen wurden anschließend unter einem Mikroskop beobachtet, und eine Zählung der Zahl von normalen Zellen wurde durchgeführt, um die Wiederherstellungsrate bezüglich der Anfangswerte (Zahl der normalen Zellen vor dem Gefriertrocknen und nach Hinzufügen der Vorbehandlungszusatzlösung) zu berechnen.
Tabelle XI
Vergleichsbeispiel 6
Eine herkömmliche Gefrierkonservierungslösung z.B. Lösung aus 5 % DMSO (Dimethylsulfoxid), 6 % HES (Hydroxyethylstärke) und 4 % Albumin wurde zu den extrahierten Stammzellen (periphere hämatopoetische Stammzellen) im Beispiel 12 ohne das Hinzufügen der Vorbehandlungszusatzlösung der vorliegenden Erfindung hinzugefügt, und ein Gefriertrocknen wurde durchgeführt. Das Produkt dieser Trocknung resultierte in einer massigen Festsubstanz. Nach dem Lagern gemäß demselben Verfahren wie oben beschrieben wurde die Zahl der normalen Zellen nach Wiederherstellung untersucht, was eine Wiederherstellungsrate von null ergab.
Beispiel 13
Mit der Ausnahme, dass eine Plättchenflüssigkeit, die durch herkömmliche Verfahren nach der Blutextraktion getrennt wurde und in demselben Plasma (Autoplasma) suspendiert wurde, anstelle der reinen Blutzusammensetzung (konzentrierte rote Blutzellen) aus Beispiel 9 verwendet wurde, wurde die Vorbehandlungszusatzlösung, die in Tabelle XII gezeigt ist, hergestellt, mit einer äquivalenten Menge der im Plasma suspendierten Plättchen gemischt und anschließend granuliert • gefriergetrocknet, gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 9. Das Produkt führte zu verzweigt förmigen Clustern mit einer Größe von einigen hundert Micron. Darüber hinaus wurden als das Albumin, das in der Vorbehandlungszusatzlösung enthalten ist, Zusammensetzungen aus wenigstens zwei Typen (den gleichen oder verschiedenen Typen von Albumin) des genannten Rinderalbumins und/oder humanen Albumins jeweils verwendet um ähnliche Ergebnisse zu erhalten.
Nach dem Gefriertrocknen und der Lagerung für einen Monat in einem herkömmlichen Kühlschrank (Temperatur: 5°C) wurden die Plättchen unter Verwendung einer Flüssigkeit derselben Zusammensetzung wie die genannte Vorbehandlungszusatzlösung wiederhergestellt. Die resultierenden Plättchen wurden unter Verwendung eines Blutzellzählers gezählt, um die Wiederherstellungsrate bezüglich der Anfangswerte (Zahl der Plättchen vor dem Gefriertrocknen und nach dem Hinzufügen der Vorbehandlungszusatzlösung) zu berechnen. Zusätzlich wurde nach dem Messen mit einem Plättchen Kohäsionsmessinstrument (hergestellt von CHRONO-LOG Corporation) festgestellt, dass die resultierenden Werte nahe bei den normalen Werten liegen.
Tabelle XII
Ergebnisse der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung können gefriergetrocknete Blutzellen, Stammzellen und Plättchen bei normalen Temperaturen gelagert werden. Zusätzlich sind die genannten gefriergetrockneten Blutzellen, Stammzellen und Plättchen in der Lage, selbst längere Zeiträume der Lagerung zu überstehen, wenn sie stabil eingesetzt und in einem herkömmlichen Kühlschrank gelagert werden. Mit anderen Worten zeigt die vorliegende Erfindung nicht die Nachteile von herkömmlichen Blutlagerungsverfahren, d.h. sie benötigen ein spezielles Kühlmedium und Behälter zum Zeitpunkt der Lagerung und verlangen eine große Zuführung von Energie, um die Lagerungstemperatur zu erhalten. Darüber hinaus ist ein Mechanismus zum Entfernen des Glycerols des herkömmlichen Verfahrens in gleicher Weise nicht notwendig, weil sehr wenige Beschränkungen zum Zeitpunkt der Verwendung existieren. Folglich ist die vorliegende Erfindung, aufgrund ihrer Einfachheit, ideal zur Verwendung während Notfalltransfusionen oder Ähnlichem.

Claims

Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten Blutzellen, Stammzellen und Plättchen, umfassend die Schritte: Vorbehandeln einer Flüssigkeit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut einschließlich Blutzellen, Knochenmarksflüssigkeit (hämatopoetische Stammzellen) und Plättchen in Blutplasma, mit einer Lösung enthaltend wenigstens eine Substanz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saccharid, Biopolymer, Säure und Säuresalz; Vollziehen von Granulierung der vorbehandelten Flüssigkeit; Durchführen von schnellem Kühlen der Körnchen; und Trocknen des gefrorenen Produkts durch Sublimation des Wassergehalts darin, das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Granulierung vollzogen wird durch gemischtes Sprühen mit einem Gas, um Körnchen einer ersten vorbestimmten Größe zu erhalten; und ein gefrorenes Produkt einer zweiten vorbestimmten Größe aus dem Körnchen der ersten vorbestimmten Größe in dem schnellen Kühlen erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Säure oder das Säuresalz wenigstens eine Substanz ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phytinsäure, Pyrophosphat, Adenosintriphosphat und 2,3-Diphosphoglycerinsäure.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das schnelle Kühlen in einer Geschwindigkeit von 10³ °C/Sekunde bis 10⁶ °C/Sekunde durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste vorbestimmte Größe einige Mikrometer bis einige hundert Mikrometer beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die erste vorbestimmte Größe 10 μm bis 200 μm beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste vorbestimmte Größe 1 mm oder weniger beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste vorbestimmte Größe 100 μm bis einige hundert Mikrometer beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Granulierung vollzogen wird unter Verwendung einer Düse zur Bildung feiner Körnchen durch ein Hochgeschwindigkeits-Vortex-Gas; die Düse umfasst eine Flüssigkeitseinspritzdüse; eine ringförmige Vortex-Kammer, die an einer Position gebildet wird, die zu der Flüssigkeitseinspritzdüse passt; eine Vielzahl von gebogenen Einfuhröffnungen, die sich in einer Vortex-Weise in die Vortex-Kammer zum Einführen eines Hochgeschwindigkeitsluftstroms in die Vortex-Kammer erstrecken; und eine ringförmige Gaseinspritzdüse, die sich vor der Flüssigkeitseinspritzdüse öffnet und der Flüssigkeitseinspritzdüsenseite der Vortex-Kammer zugewendet ist, zum Vorstehen und Bilden eines dünnen konischen Hochgeschwindigkeits-Vortex, der einen Fokus vor der Flüssigkeitseinspritzdüse besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das schnelle Kühlen durch Sprühen des Blutes in ein Gas bei einer Temperatur unter dem Gefrierpunkt durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Saccharid wenigstens ein Saccharid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mannose, Xylose, Glukose, Trehalose, Sucrose und Maltose.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Biopolymer wenigstens ein Biopolymer ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Polyvinylpyrolidon und Albumin.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Albumin wenigstens ein Typ von Albumin ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Albumin, Rinderalbumin und Eiweißalbumin.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Lösung zur Verwendung in der Vorbehandlung einen pH zwischen 4 und 9 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Lösung zur Verwendung in der Vorbehandlung einen pH zwischen 7 und 8 aufweist.