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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft die Organkonservierung und den hypothermischen
Blutersatz. Diese Erfindung betrifft insbesondere Zusammensetzungen,
Verfahren und Systeme zur Organ- und Gewebekonservierung und/oder
zum hypothermischen Blutersatz.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Hypothermie
ist die Grundlage aller nützlichen
Verfahren zur Organ- und Gewebekonservierung und es hat sich gezeigt,
dass diese am effektivsten durch ein direktes Steuern der extrazellulären Umgebung
von Zellen und ein indirektes Steuern der intrazellulären Umgebung
von Zellen während
des Aussetzens an Kälte angewendet
wird. Das Regeln der extrazellulären
Umgebung von Zellen, um die Konservierung zu optimieren, basiert
auf verschiedenen Strategien die entweder statische Kaltlagerung
(oder Spülkonservierung)
oder kontinuierliche Perfusion bei niedriger Temperatur einschließen. Diese
verschiedenen Strategien benötigen
unterschiedliche Ansätze
der interventionellen Steuerung der extrazellulären Umgebung, um die Konservierung
zu optimieren, und daher unterschiedliche Designelemente für die zum
Bewirken dieser Strategie verwendeten Lösungen.
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Im
Prinzip basiert die kalte Spüllagerung
oder Konservierung auf der Prämisse,
dass eine Reduktion der Temperatur nahe an den aber nicht unter
den Eispunkt (0°C)
der Notwendigkeit vorbeugt, den Stoffwechsel in einem bedeutsamen
Ausmaß zu
unterstützen,
und dass die korrekte Verteilung von Wasser und Ionen zwischen den
intrazellulären
und den extrazellulären
Bereichen durch physikalische eher als durch stoffwechselbasierende
Mittel erhalten werden kann. Während
des Zeitraums, in dem die Stoffwechselpumpen deaktiviert sind, ist
die treibende Kraft des transmembranen Ionenflusses der Unterschied
im Ionengleichgewicht zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulären Fluid.
Die treibende Kraft für
die Wasseraufnahme (Zellenschwellen) sind die impermeanten intrazellulären Anionen.
Somit können
Veränderungen
durch Manipulieren der extrazellulären Umgebung, um chemische
Potentialgradienten aufzuheben, verhindert oder vermieden werden.
Auf dieser Basis wurde eine Vielzahl von Spül- oder Organauswaschlösungen entwickelt
und für
die Kaltlagerung untersucht. Diese Lösungen werden, auf Grund ihrer Ähnlichkeit
zu intrazellulärem
Fluid in einiger Hinsicht, häufig
als „intrazelluläre" Lösungen bezeichnet.
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Die
Hauptdesignelemente dieser „intrazellulären" Spüllösungen waren,
das ionische Gleichgewicht (besonders der monovalenten Kationen)
einzustellen und die Osmolalität
durch Einschließen
eines impermeanten gelösten
Stoffs zu erhöhen,
um den intrazellulären
osmotischen Druck auszugleichen, der für die Wasseraufnahme verantwortlich
ist. Der wichtigste Faktor der Effektivität von Kaltspüllösungen könnte jedoch
das Verhindern von zellulären Ödemen durch
das Einschließen
von impermeanten, gelösten
Stoffen sein, da festgestellt wurde, dass ionische Ungleichgewichte,
insbesondere Kaliumverlust, einfach und schnell reversibel sind.
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Vor
1988 war die Standardlösung
zur klinischen Konservierung der Bauchhöhlenorgane, hauptsächlich der
Niere, die Collins Lösung,
die hauptsächlich
aus Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, und Glucose besteht. In den
letzten Jahren wurde diese jedoch entweder durch eine modifizierte
Version, die „EuroCollins" genannt wird und
in der das Magnesiumsulfat weggelassen wird, oder häufiger durch
die University of Wisconsin Lösung
(UW Lösung)
abgelöst,
in der ein Großteil
der Phosphatanionen durch Lactobionat ersetzt wurde und in der die
Glucose durch Raffinose ersetzt wurde. Diese größeren Moleküle bieten einen besseren Schutz gegen
die negativen Effekte des Zellenanschwellens während der hypothermischen Lagerung.
Die Auswahl der Lösungen
für die
Herzkonservierung wurde stark von den vorhergehenden Erfahrungen
von Herzchirurgen mit kardioplegen Lösungen in der offenen Herzchirurgie
beeinflusst. In diesem Fall war das Hauptziel, ein schnelles Einstellen
des Herzschlags zu erreichen, und die Lösungen wurden mehr im Hinblick
darauf als im Hinblick auf den Schutz der Zellen während der
Lagerung konzipiert. Insbesondere deuteten frühere Studien an, dass die sehr
hohen Kaliumlevel (> 100
mM), die in Organkonservierungslösung
gefunden werden, für
das Herz schädlich
sein könnten.
Tatsächlich
war die am häufigsten
verwendete Lösung
St. Thomas's (Plegisol) mit
einem Kaliumgehalt von nur 16 mM.
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Die
Auswahl der Lösung
für die
Kardioplegie und die Herzmuskelkonservierung bleibt umstritten und ist
stark unterschiedlich. während
sich die UW-Lösung
zum Industriestandard für
Niere, Leber und Pancreas entwickelt hat wurde für die Herzkonservierung kein
solcher Standard übernommen.
Die Entwicklung der Vielzahl von Konservierungslösungen zur Organlagerung hat
außerdem
die Notwendigkeit einer sorgfältigen
Optimie rung im Hinblick auf die speziellen Charakteristika der zu
konservierenden Gewebe hervorgehoben.
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Die
Beachtung der biophysikalischen Eigenschaften von „intrazellulären" Spüllösungen,
um passive Diffusionsprozesse zu begrenzen, hat unfraglich zur Entwicklung
von Techniken geführt,
die die Basis für
die klinische Organkonservierung während der letzten 30 Jahre
geschaffen haben. Es wurde jedoch erkannt, dass eine weitere Optimierung
der Kaltspüllösungen durch
Einbeziehung von biochemischen und pharmakologischen Komponenten
erreicht werden kann, die effektiv sind, den schädlichen Effekten von Ischämie und
Reperfusionsverletzungen entgegenzuwirken. Zu einem begrenzten Grad
wurde dieser Ansatz in das Design der University of Wisconsin Organkonservierungslösung (UW-Lösung, vermarktet
als „ViaspanTM";
DuPont) einbezogen, die die am weitesten verbreitete Lösung zur
Kaltspülkonservierung
von Nieren, Lebern und Pancreaten ist. Mit der nötigen Rücksicht auf die Effekte von
Ischämie,
Sauerstoffmangel, Hypothermie und Reperfusionsverletzung auf Zellen,
gekoppelt mit der bewiesenen Effektivität von verschiedenen existierenden
Organkonserservierungslösungen,
hat sich ein allgemeiner Konsens über die wichtigsten Charakteristika
im Design von hypothermischen Lagerlösungen entwickelt. Diese schließen Folgendes
ein, nämlich
Minimieren des hypothermisch erzeugten Zellenanschwellens; Verhindern
der Expansion des interstitionalen Raums (besonders wichtig während der
Perfusion); Begrenzen von ionischen Ungleichgewichten; Verhindern
von intrazellulärer Azidose;
Verhindern von Verletzungen durch freie Radikale und Bereitstellen
von Substraten zur Regeneration von hochenergetischen Phosphatverbindungen
während
der Reperfusion.
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Bei
der kontinuierlichen hypothermischen Perfusionskonservierung, sind
die zuvor aufgelisteten wünschenswerten
Eigenschaften von hypothermischen Lösungen auch auf das Steuern
der extrazellulären
Umgebung mittels von kontinuierlichen Perfusionstechniken anwendbar.
Im Gegensatz zur statischen Kaltlagerung wird die kontinuierliche
Perfusion im Allgemeinen bei etwa 10°C gehalten und basiert auf einem
anderen Prinzip: es wird allgemein angenommen, dass ein moderater
Grad an Abkühlen
den Stoffwechselbedarf vermindert, aber dass eine kontinuierliche
Perfusion notwendig ist, um den unterdrückten Stoffwechsel zu unterstützen und
um katabolische Produkte zu entfernen. Da angenommen wird, dass
eine ausreichende Stoffwechselaktivität verbleibt, um aktiv ein fast
normales Zellvolumen und ionische Gradienten zu regulieren, sind die
Perfusate im Allgemeinen azelluläre,
isotonische, stark sauerstoffangereicherte Lösungen, die eine Zusammensetzung
aufweisen, die eher Plasma als intrazellulärem Fluid ähnelt. Solche Perfusate werden
deshalb als „extrazelluläre" Lösungen bezeichnet
und werden mit einem Druck durch das Gefäßbett eines Organs durchgespült, der
ausreicht um eine gleichförmige
Gewebeverteilung zu erreichen (typischerweise 40–60 mm Quecksilber). Um diesen
angewendeten hydrostatischen Druck auszugleichen und interstitiale Ödeme zu
vermeiden, werden onkotische Mittel wie Albumin oder synthetische
makromolekulare Kolloide in die Perfusate aufgenommen. Die Substratversorgung
des verbleibenden Stoffwechsels bei –10°C ist ebenfalls eine wichtige Erwägung und
es wurde in mehreren Organen gezeigt, dass hochenergetische Adeninnukleotide
während
der hypothermischen Perfusionskonservierung synthetisiert werden
können.
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Zusätzlich zum
Hauptziel des Unterstützen
des Stoffwechsels schafft die kontinuierliche Perfusion weitere
Vorteile gegenüber
der Spülkonservierung.
Diese schließt
das Auswaschen von angesammeltem Lactat und Protonen ein, wodurch
die Stoffwechselblockierung der Glykolyse aufgehoben wird; es wird
davon ausgegangen, dass dies besonders für Organe förderlich ist, die vorher eine
warme Ischämie
erlitten haben. Die Perfusion erleichtert außerdem das Entfernen von Erythrozyten
aus der Mikrozirkulation und hilft dabei, die Gefäßdurchgängigkeit
während
längerer
Lagerung aufrechtzuerhalten. Es wurde gezeigt, dass kontinuierliche Perfusion
die beste Möglichkeit
zum Erreichen von längerer
hypothermischer Konservierung (z.B. 3–7 Tage für Nieren) schafft, jedoch können Bedenken
wegen Schäden
am Gefässendothelium
während
längerer
Perfusion ein begrenzender Faktor sein.
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Obwohl
experimentell nachgewiesen wurde, dass sich der Zellstoffwechsel
bei niederen Temperaturen wie 10°C
fortsetzt und dass Adeninnukleotide während der hypothermischen Konservierung
wieder synthetisiert werden können,
wenn die geeigneten Substrate bereitgestellt werden, wird davon
ausgegangen, dass es unwahrscheinlich ist, dass dieser Stoffwechsellevel
Transmembranbewegungen von Ionen und Wasser verhindern kann, wobei
dies hauptsächlich
auf die Temperaturanfälligkeit
der aktiven Pumpen zurückzuführen ist.
Einige Verfechter der kontinuierlichen Perfusion haben daher das
Perfusat durch Erhöhen
sowohl der K+-Konzentration als auch der
Osmolalität
dementsprechend modifiziert. In ähnlicher
Weise kann davon ausgegangen werde, dass Modifikationen der Kaltspüllösungen einige
der identifizierten Grenzen dieses Ansatzes umgehen können. So
kann z.B. auf das Fehlen der Unterstützung des Stoffwechsels während der
Eislagerung durch Folgendes eingegangen werden, nämlich Anheben
der Lagertemperatur, Aufnehmen von biochemischen Substraten und
Anheben der Sauerstoffspannung, um die Adeninnukleotidwiederversorgung
zu fördern.
Auch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln wie Inhibitoren
der 5'-Nukleotidase
(z.B. Allopurinol) wurden als Mittel zum Vermeiden von Adeninnukleotidarmut
genannt.
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Im
Hinblick auf die spezifischen Anforderungen der Zellen in Abhängigkeit
der Temperatur ist es nicht notwendig, das Aufnehmen von spezifischen
sauerstofftragenden Molekülen
bei Temperaturen unter –10°C zu bedenken,
da einwandfrei nachgewiesen wurde, dass bei solchen niedrigen Temperaturen
die Stoffwechselaktivität
ausreichend unterdrückt
ist, so dass der O2-Bedarf durch gelöstes O2 in
der wässrigen
Lösung,
ohne Bedarf an Hämoglobin
oder synthetischen, O2-tragenden Molekülen gedeckt
werden kann.
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Eine
optimale Steuerung der intrazellulären und extrazellulären Umgebung
von Zellen während
der Hypothermie hängt
von der Interaktion von einer Reihe von Faktoren ab, die Folgendes
einschließen,
nämlich Temperatur,
Sauerstoffspannung, Säuregrad,
osmotischer Druck und chemische Zusammensetzung des Perfusionsfluides
oder der Auswaschlösung.
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Es
wurde jetzt erkannt, dass die aufeinander folgenden Phasen der Transplantationsprozedur,
nämlich Organbeschaffung,
Lagerung, Transport, Reimplantation und Reperfusion, unterschiedliche
Anforderungen für eine
optimale Konservierung in den verschiedenen Stufen stellen. Dies
wird durch Anzeichen illustriert, dass die Herzkonservierung mit
der „intrazellulä ren" Lösung, EuroCollins,
verbessert wurde, wenn das Herz anfänglich mit einer „extrazellulären" kardioplegischen
Lösung
zum Stillstand gebracht und anschließend vor der Reperfusion damit
gespült
wurde. Es ist daher unwahrscheinlich, dass irgendeine einzelne Formulierung
einer Konservierungslösung
optimalen Schutz während
allen Prozessstufen einer Transplantationsprozedur oder den interventionellen
Stufen von komplexen Operationen schafft.
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Das
Interesse an allgemeinen oder universellen Gewebekonservierungstechniken
wird exemplarisch durch den Bedarf nach Verfahren zum Schützen von
mehreren lebenswichtigen Organen und selbst des ganzen Körpers für Anwendungen
in der modernen Chirurgie dargestellt. Multiple Organentnahme zur
Transplantation kann durch eine hypothermische Perfusion des gesamten
Leichnams oder von Spenderorganblöcken optimiert werden, die
mehrere Organe aufweisen, um Verletzungen durch warme Ischämie zu minimieren.
Die größte Herausforderung
ist möglicherweise
der Schutz des gesamten Körpers
gegenüber
den Auswirkungen globaler Ischämie
in Zeiträumen
des Kreislauf- und/oder Herzstillstands zur „unblutigen" Chirurgie.
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Chirurgen
haben Fertigkeiten entwickelt, die es ermöglichen sehr komplexe, korrektive
und lebensrettende Operationen, insbesondere am Herzen und am Gehirn,
durchzuführen.
Viele dieser komplizierten und zeitaufwendigen Prozeduren weisen
einen inhärenten
Bedarf nach einem temporären
Stopp des Blutflusses auf und benötigen den Schutz des Patienten
gegen die schädlichen
Auswirkungen von Ischämie
und Sauerstoffmangel. Obwohl Hypothermie routinemäßig als
zusätzliche
schützende
Modalität
für chirurgische
Prozeduren verwendet wird, die einen Zeitraum von Herzstillstand
erfordern, gibt es einschränkende
Zeitbeschränkungen
(< 1 Stunde bei
Temperaturen normalerweise nicht unter 18°C) des sicheren Intervalls von
kalter Ischämie,
wenn neurologische Folgeerscheinungen vermieden werden sollen. Es
ist anerkannt, dass das Gelegenheitsfenster für einen sicheren chirurgischen
Eingriff durch Verwenden eines größeren Grades von hypothermischer
Stoffwechselunterdrückung
vergrößert werden
könnte,
aber dies wird, hauptsächlich
auf Grund der Effekte von tiefer Hypothermie auf das Blut, unannehmbar
gefährlich,
was zu Koagulopathien und irreversibler mikrovaskularer Verstopfung
führt.
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Die
US-Patente 5,643,712, 5,699,793, 5,843,024 für Brasile und 5,599,659, 5,702,881
für Brasile
et al., die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin eingeschlossen
sind, beschreiben separate Reanimations- und Konservierungslösungen für Gewebe
und Organe. Die Brasile Patente offenbaren Verfahren bei denen einige
Ausführungsformen
der Zusammensetzung dieser Erfindung angewendet werden können. Die
Brasile Patente offenbaren außerdem
Zusammensetzungen die in den Verfahren und Kits dieser Erfindung
verwendet werden können.
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Das
US-Patent 5,130,230 für
Segall et al. offenbart ein Verfahren zum Durchführen einer unblutigen, hypothermischen
Prozedur, das eine Vielzahl von Lösungen verwendet, die systematisch
auf ein Subjekt oder einen Patienten angewendet werden. Die internationale
Anmeldung WO 86/00812 offenbart ein Arzneimittel zum Verhindern
und Behandeln von ischämischen
Zellschäden,
das Folgendes aufweist, nämlich
zumindest einen Plasmavolumenexpander, zumindest einen Hydroxylradikalfänger, zumindest
ein Magnesiumsalz und zumindest eine calciumblockierende orga nische
Verbindung; und einen Kit der all die Bestandteile des Arzneimittels
einzeln oder in jeglicher Kombination aufweist. Das US-Patent 5,552,267
für Stern
et al. offenbart ein Verfahren zum Konservieren eines Organs das
eine Lösung
verwendet, die ausdrücklich
die Verwendung von Natriumionen, Chloridionen und Calciumionen vermeidet.
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Der
vorliegende Erfinder hat experimentelle Ansätze untersucht, die eine Technik
des unblutigen Blutersatzes einsetzen, wobei azelluläre synthetische
Lösungen
verwendet werden, die dazu konzipiert sind, das Herz, das Gehirn
und die inneren Organe während
mehrerer Stunden blutloser Perfusion zu schützen. Das Konzept des Verwendens
von ultratiefer Hypothermie (< 10°C) und eines
kompletten Blutersatzes ist aus mehreren Gründen ansprechend und basiert
auf einer Vielzahl von Faktoren. Erstens kann eine tiefere Hypothermie
eine effektivere Unterdrückung
des Stoffwechsels schaffen, wodurch die Toleranz gegenüber Ischämie erhöht wird
und der Sauerstoffbedarf auf Level minimiert wird, die in ausreichender
Weise in einer kalten wässrigen
Lösung
geliefert werden können,
ohne dass ein Bedarf an speziellen sauerstofftragenden Molekülen besteht.
Zweitens mildert eine vollständige
Exsanguination eine Komplikation ab, die mit der erhöhten Viskosität, Koagulopathien
und Erythrozytenverklumpungen von gekühltem Blut zusammenhängt. Drittens
kann ein vaskuläres
Reinigen schädliche
katabolische Produkte und gebildete Elemente entfernen, die in den
Ischämie- und den Reperfusionsverletzungskaskaden
teilnehmen. Ein vierter Vorteil ist, dass die vollständige Exsanguination
die Möglichkeit
bietet, die vaskulären
und extrazellulären
Bereiche direkt mit Fluiden zu beaufschlagen, die dazu konzipiert
sind, unter den Bedingungen ultratiefer Hypothermie schützend zu
sein. So können
zum Beispiel gelöste
Stoffe zugegeben werden, um das ionische und osmotische Gleichgewicht
auf zellulärem
und auf Gewebelevel beizubehalten; biochemische und pharmakologische
Zusatzstoffe können
helfen, die Gewebeintegrität
in einer Vielzahl von Wegen zu erhalten, einschließlich eines
effizienten vaskulären
Säuberns,
der Membranstabilisierung, des Fangens von freien Radikalen und
des Bereitstellens von Substraten für die Regeneration von hochenergetischen
Verbindungen während
des Wiedererwärmens
und der Wiederperfusion. Im Wesentlichen sind dies die Prinzipien,
die in größerem oder
kleinerem Maße
im Design der verschiedenen Lösungen
ausgebildet sind, die für
eine ex vivo Organkonservierung verwendet werden. In dieser Erfindung wurden ähnliche
Prinzipien im Design von neuen hypothermischen Blutersatzstoffen
angenommen.
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Die
zur Untersuchung dieses Ansatzes verwendete Arbeitshypothese war,
dass eine azelluläre
Lösung
dazu konzipiert werden kann, als universelle Gewebekonservierungslösung zu
wirken, und zwar während mehrerer
Stunden eines hypothermischen Gesamtkörperauswaschens, das Herzstillstand,
mit oder ohne Kreislaufstillstand, mit sich bringt. Unter dieser
Hypothese haben Taylor et al. zwei Lösungen formuliert und untersucht,
die als HypothermosolTM-purge (HTS-P) und
HypothermosolTM-maintenance (HTS-M) bezeichnet wurden
und die verschiedene Anforderungen während des unblutigen Verfahrens
erfüllen.
Einige Aspekte dieser Lösungen
sind in den US-Patenten 5,405,742 und 5,514,536 für Taylor
beschrieben, die beide in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin
eingeschlossen sind. Die Taylor Patente offenbaren Verfahren in
denen einige Ausführungsformen
der Zusammensetzung dieser Erfindung angewendet werden können. Die
Taylor Patente offenbaren außerdem
Zusammensetzun gen, die in den Verfahren und Kits dieser Erfindung
verwendet werden können.
Die Hauptlösung
(HTS-M) ist eine hyperkalämische „intrazelluläre" Lösung, die
spezifisch dazu konzipiert wurde, die zelluläre Integrität während des hypothermischen Intervalls
bei niedrigster Temperatur „aufrechtzuerhalten". Die zweite Lösung ist
dazu konzipiert, sowohl während
des Abkühlens
als auch während
des Erwärmens
als Schnittstelle zwischen dem Blut und der HTS-M Aufrechterhaltungslösung zu
wirken. Diese Begleitlösung
ist daher eine „extrazelluläre" Spüllösung, die
dazu konzipiert ist, beim Reinigen des Kreislaufes von Blut während des
Abkühlens
zu helfen, da das Entfernen der Erythrozyten aus der Mikrovaskulatur
ein wichtiges Ziel während
der ultratiefen Hypothermie ist. Die „Reinigungs"-lösung ist
auch dazu konzipiert, das System (Gefäßsystem und CPB Kreislauf)
während
des Erwärmens
von der hyperkalämischen HTS-M
Lösung
zu reinigen und möglicherweise
dabei zu helfen, angesammelte Toxine und Stoffwechselnebenprodukte
auszuspülen,
die bei der Reperfusion oxidativen Stress und Verletzungen durch
freie Radikale fördern
könnten.
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Basierend
auf den Prinzipien, die sich aus Konservierungsstudien von isolierten
Organen entwickelt haben, wurde ein Versuch unternommen, einige
der wichtigen Charakteristika in die Formulierung von HypothermosolTM-Lösungen
einzuarbeiten, und, wo immer möglich,
wurden Bestandteile ausgewählt,
die multiple Rollen erfüllen
können.
Diese Strategie maximiert die inhärenten Qualitäten der
Lösungen,
die durch das Design als universelle Gewebekonservierungslösungen unausweichlich
ein Hybrid von anderen hypothermischen Perfusaten und Lagermedien
sind.
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Die
Zusammensetzungen der HypothermosolTM-Blutersatzmittel
und das Grundprinzip ihrer Formulierung wurden in den US-Patenten 5,405,742
und 5,514,536 für
Taylor et al., die beide durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin
eingeschlossen sind, diskutiert. Es hat sich gezeigt, dass diese
Lösungen
das Gehirn, das Herz und die inneren Organe während 3,5 Stunden Herzstillstand
und globaler Ischämie
in einem blutfreien Hundemodell während einer kontrollierten
tiefen Hypothermie bei < 10°C schützen. Die
erfolgreiche Anwendung dieser Technik auf den Menschen würde eine
mehr als dreifache Verlängerung
der derzeitigen Beschränkung
von < 1 Stunde
für einen „sicheren" Stillstand ohne
ein hohes Risiko von neurologischen Komplikationen schaffen. Dieser
neue Ansatz für
die unblutige Chirurgie würde
das Gelegenheitsfenster für
einen chirurgischen Eingriff in einer Vielzahl zur Zeit nicht operierbaren
Fällen
hauptsächlich
auf den Gebieten der Herzkreislaufchirurgie, der Neurochirurgie
und der Notfalltraumachirurgie deutlich verbreitern.
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Seit
Kurzem wird die HypothermosolTM-Erhaltungslösung für die hypothermische
in vitro Konservierung einer Vielzahl von Geweben und Organen einschließlich isolierter
Herzen, fötalem
Rückenmark
und künstlich
hergestellter Haut verwendet.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf dem Konzept eines vereinheitlichten
Lösungssystems
zum Herstellen von multiplen Lösungen,
die für
die verschiedenen Stufen in Prozeduren des Organ- oder Gewebebeschaffens-Konservierens-Transplantierens
und/oder von unblutigen chirurgischen Prozeduren konzipiert und optimiert
sind.
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Während die
bekannten Systeme, einschließlich
der in den zuvor diskutierten Brasile- und Taylor-Patenten gelehrten,
völlig
unterschiedliche Zusammensetzungen für verschiedene Stufen von Prozeduren
zur Organbeschaffung, Konservierung und Transplantation benötigten,
schafft die vorliegende Erfindung eine oder zwei (oder wahlweise
mehr) Basiszusammensetzungen und eine Anzahl von verschiedenen Zusatzstoffen,
die zu der einen oder den mehreren Basiszusammensetzungen zugegeben
werden können,
um spezifische Zusammensetzungen herzustellen, die für spezifische
Stufen in Prozeduren zur Organ- oder Gewebebeschaffung, Konservierung
und Transplantation oder unblutigen chirurgischen Prozeduren nützlich sind.
In Ausführungsformen
können
die Basis und die Zusatzstoffe in unterschiedlichen Behältern in
einer einzigen Verpackung oder Kit gelagert werden. Außerdem werden
spezifische verbesserte Basiszusammensetzungen geschaffen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt den Lebensfähigkeitsindex
für MDCK
Zellen nach einem Lagerintervall;
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2 zeigt die vergleichende
Lebensfähigkeit
von A10 Zellen nach einem Lagerintervall von einem Tag;
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3 zeigt die vergleichende
Lebensfähigkeit
von CPAE Zellen nach einem Lagerintervall von einem Tag;
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4 zeigt die vergleichende
Lebensfähigkeit
von A10 Zellen nach einem Lagerintervall von 3 Tagen;
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5 zeigt die vergleichende
Lebensfähigkeit
von CPAE Zellen nach einem Lagerintervall von 3 Tagen;
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6 zeigt die vergleichende
Lebensfähigkeit
von A10 Zellen während
eines Zeitraums von 6 Tagen nach einem hypothermischen Lagerintervall
von 3 Tagen;
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7 zeigt die vergleichende
Lebensfähigkeit
von CPAE Zellen während
eines Zeitraums von 6 Tagen nach einem hypothermischen Lagerintervall
von 3 Tagen;
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8 zeigt eine lichtmikroskopische
Histologie von Jugularvenensegmenten nach einem Zeitraum von kalter
Ischämie
in DMEM Kulturmedium;
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9 zeigt eine lichtmikroskopische
Histologie von Jugularvenensegmenten nach einem Zeitraum von kalter
Ischämie
in „I-Base-HK" Konservierungslösung in Übereinstimmung
mit der Erfindung;
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10 zeigt interne renale
Widerstandsmessungen für
bei –9°C durchspülte Hundenieren;
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11 zeigt arterielle Flussgeschwindigkeiten
für bei
9°C durchspülte Hundenieren;
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12 zeigt den inneren renalen
Widerstand der in vivo für
konservierte Nieren gemessen wurde, die nach 20 Stunden Maschinenperfusionskonservierung
ektopisch transplantiert wurden;
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13 zeigt den mittleren arteriellen
Fluss der in vivo für
konservierte Nieren gemessen wurde, die nach 20 Stunden Maschinenperfusionskonservierung
ektopisch transplantiert wurden; und
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14 zeigt biochemische Indikatoren
(Kreatinin und BUN) der Nierenfunktion für Schweinenieren, die nach
einem Minimum von 20 Stunden Kaltlagerkonservierung transplantiert
wurden.
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15 und 16 zeigen vergleichende Lebensfähigkeiten
von mit DMSO kryokonservierten Zellen, die entweder in der neuen
phosphatfreien intrazellulären
Basisvehikellösung
mit hoher Kaliumkonzentration (HK-CV) oder EuroCollins-Lösung hergestellt
wurden. Die Daten stellen den Durchschnitt (±SEM) von 4 Wiederholungszellchargen
dar.
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Detaillierte
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
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Diese
Erfindung schafft ein vereinheitlichtes Lösungssystem zum Herstellen
multipler Lösungen,
die für
verschiedene Stufen in Prozeduren zur Organ und/oder Gewebebeschaffung,
Konservierung und Transplantation und/oder für unblutign chirurgische Prozeduren
konzipiert und optimiert sind.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
stellt die vorliegende Erfindung eine oder zwei Basiszusammensetzungen
und eine Anzahl von verschiedenen Zusatzstoffen bereit, die zu der
(den) Basiszusammensetzungen) zugegeben werden können, um spezifische Zusammensetzungen
herzustellen, die für
spezifische Stufen in Prozeduren zur Organbeschaffung, Konservierung
und Transplanta tion und/oder bei unblutigen chirurgischen Prozeduren
nützlich
sind. In Ausführungsformen
können
die Basis und die Zusatzstoffe in getrennten Behältern in einer einzelnen Verpackung
oder Kit gelagert werden.
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Eine
Basisformulierung weist ein Design auf, das die biophysikalischen
und minimalen biochemischen Bestandteile berücksichtigt, die für alle oder
eine gewünschte
Untermenge an Anwendungen standardisiert werden können. Diese
vereinheitlichte Basislösung
kann dann als Träger
für eine
Reihe von Zusatzstoff-„Cocktails" verwendet werden,
um ein System von Lösungen
abzuleiten, die für
verschiedene Bedürfnisse
optimiert sind.
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In
Ausführungsformen
der Reihe von Lösungen
des vereinheitlichten Lösungssystems
können
Lösungen
für die
warme ischämische
Zeit-Organkonservierung zum Beispiel Folgendes einschließen, nämlich eine hypothermische
Spül-/Reinigungslösung, eine
hypothermische Perfusat-/Erhaltungslösung, eine „normothermie" Perfusat-/Rettungslösung und/oder
eine Prä-Reimplantationsspül-/Ausspüllösung.
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Beispielhafte
Ausführungsformen
der Serie des vereinheitlichten Lösungssystems können zum
Beispiel die folgenden Basislösungen
einschließen:
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Intrazelluläre Basislösung des
vereinheitlichten Lösungssystems:
Minimalanforderungen für
die Kaltlagerung einschließlich
Kryokonservierungslösung.
Eine beispielhafte Formulierung einer solchen Lösung als bevorzugtes Ausführungsbeispiel
ist in Tabelle 2 gegeben.
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Extrazelluläre Basislösung des
vereinheitlichten Lösungssystems:
plasmaähnliche
Elektrolyte als Basis für
sauerstofftragende Moleküle
und andere Substrate, die für
eine optimierte „normotherme" Perfusion notwendig
sind.
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Beispielhafte
Ausführungsformen
der Serie des vereinheitlichten Lösungssystems können zum
Beispiel die folgenden Lösungen
aus Basis plus Zusatzstoff aufweisen:
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Reinigung
= extrazelluläre
Basis plus Reinigungszusatzstoff („Cocktail"), hauptsächlich dazu konzipiert, das
Gefäßsystem
in Vorbereitung für
die Konservierung von Blut zu reinigen.
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Erhaltung
= intrazelluläre
Basis plus Zellschutzzusatzstoff („Cocktail"), konzipiert, um die zelluläre Stabilität während der
Kaltlagerung zu schützen
und aufrechtzuerhalten. Idealerweise trifft dieses sowohl auf statische
Kaltlagerung als auch auf kalte Maschinenperfusion zu.
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Rettung
= extrazelluläre
Basis plus Rettungszusatzstoff („Cocktail") für
die nah-normotherme Perfusion.
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Spülung = extrazelluläre Basis
plus Spülzusatzstoff
(„Cocktail"), dazu konzipiert,
vor der Reimplantation unerwünschte
Konservierungsmoleküle
wegzuspülen.
Diese kann eine von der Reinigungslösung unterschiedliche Rolle
spielen, die dazu konzipiert ist, vor der Konservierungsphase Erythrozyten
und andere Blutbestandteile zu entfernen.
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Kryo
= konzentrierte intrazelluläre
Basis plus durchdringende oder nichtdurchdringende Kälteschutzzusatzstoffe
zur Konservierung von Zellen oder Geweben unter Null. Für die Kryoausführungsform
wird die intrazelluläre
Basis im Vergleich zu ihrer Verwendung allein und mit den meisten
anderen Additiven, vorzugsweise auf 3–4 mal ihrer Stärke, konzentriert.
Dies erleichtert ihre Kombination mit zugesetzten Kälteschutzverbindungen.
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Beispiele
einiger erläuternder
Zusatzstoffe, die in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung verwendet werden können, sind in Tabelle 3 aufgelistet,
es können
jedoch viele andere Additive verwendet werden.
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Beispielhafte
Lösungen
für ein
klinisches Organkonservierungsprogramm sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
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Tabelle
1. Strategie zum Design von Lösungen
für ein
klinisches Organkonservierungsprogramm
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Tabelle
2. Formulierung einer intrazellulären Basis des vereinheitlichten
Lösungssystems
(hohe Kaliumkonzentration)
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Es
wurde gegenüber
dem Stand der Technik einschließlich
HypothermosolTM eine beträchtliche
Anzahl von Verbesserungen bezüglich
der Kombinationen der Bestandteile und deren jeweiligen Konzentrationen
in das Design der Zusammensetzungen und Systeme der Erfindung eingearbeitet.
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Basierend
auf den Prinzipien, die sich aus den Konservierungsstudien an isolierten
Organen über
die letzten Jahrzehnte entwickelt haben, hat sich eine Liste wünschenswerter
Eigenschaften einer hypothermischen Blutersatzlösung, wie zuvor diskutiert,
ergeben. Wie zuvor umrissen, haben sich die strategischen Designs
von zur Organkonservierung verwendeten Lösungen abhängig von deren letztendgültiger Verwendung entweder
als Spüllösung zur
statischen Organlagerung oder als Perfusate für die kontinuierliche oder
intermittierende Perfusion des Organs unterschieden. Als einzigartiger
Ansatz wurde das vereinheitlichte Lösungssystem dieser Erfindung
im Hinblick darauf formuliert, universelle Lösungen zu entwickeln, die sowohl
für hypothermische
statische Lagerung von Geweben und Organen als auch für die Maschinenperfusionskonservierung
verwendet werden kön nen.
Es wurde der Versuch unternommen, die Hauptcharakteristika von effektiven, hypothermischen
Lösungen
in der Formulierung der Basislösung
zu kombinieren, und wo immer möglich
wurden Bestandteile ausgewählt,
die multiple Rollen erfüllen
können.
Zum Beispiel kann eine extrazelluläre Basislösung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung
mit verschiedenen unterschiedlichen Zusatzstoffen kombiniert werden,
um Reinigungslösungen,
Organrettungslösungen,
Präimplantationsspülungen und
dergleichen zu bilden. Diese Strategie maximiert die inhärenten Qualitäten der
Lösung,
die durch das Design als universelle Gewebekonservierungslösungen unausweichlicher
Weise ein verbesserter Hybrid von anderen hypothermischen Perfusaten
und Lagermedien ist.
-
Hervorragende
Designmerkmale für
wünschenswerte
Basislösungen
sind nachstehend beschrieben. Es wird außerdem für solche Eigenschaften Bezug
auf das US-Patent 5,405,742 genommen, das durch Bezugnahme in seiner
Gesamtheit hierin eingeschlossen ist.
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Eine
fundamentale biophysikalische Eigenschaft ist es, die optimale Konzentration
von Ionen und Kolloiden bereitzustellen, um während der Hypothermie das ionische
und osmotische Gleichgewicht in dem Organ oder dem Körpergewebe
aufrechtzuerhalten. Insbesondere wird oder werden ein oder mehrere
wirksame impermeante(s) Anion(en) eingeschlossen, um das Chlorid
im extrazellulärem
Raum teilweise zu ersetzen und ein osmotisches Zellenanschwellen
zu verhindern (d.h. um die in den Zellen fixierten Ionen auszugleichen,
die für
den onkotischen Druck verantwortlich sind, der zur osmotischen Zellenanschwellen
und ggf. zur Lyse während
der Ischämie
und der Hypothermie führt).
Eine Anzahl von Anionen, einschließlich Citrat, Glycerophosphat,
Gluconat und Lactobionat oder anionischer Formen von Aminosulfonsäuren wie
HEPES (N-2-(Hydroxyethylpiperazin)-N-2-ethansulfonsäure), TES
(N-tris(Hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure), MOPS (3-(N-Morpholin)propansulfonsäure), TAPSO
(3-3-N-tris(Hydroxymethyl)methylaminohydroxypropansulfonsäure) und
DIPSO (2-3-N-bis(Hydroxyethyl)amino-2-hydroxypropansulfonsäure) können geeignete
Kandidaten sein. Lactobionat (FW=358) wurde in vielen in den letzten
Jahren entwickelten Lösungen
ausschließlich als
das Hauptimpermeant verwendet; diese schließen zum Beispiel ViaspanTM, Hypdthermosol, Celsior, Cardiosol und
Churchill's Lösung ein.
Lactobionat ist außerdem
als starker Calcium- und Eisenchelator bekannt und kann daher dazu
beitragen, Zellverletzungen auf Grund von Calciumeinfluss und auf
Grund der Bildung von freien Radikalen zu minimieren.
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Bei
der Organperfusion lehren jedoch Belzer und Southard (Organ Preservation,
Annual Review of Medicine 1994; 46:235-247) gegen das Verwenden von Lactobionat
in einer Perfusionslösung
insbesondere für
Nieren. Belzer und Southard haben außerdem die Wichtigkeit von
Lactobionat als kritischer Bestandteil der UW Lösung erklärt, der nicht erfolgreich durch
ein anderes Anion wie Gluconat ersetzt werden kann. Belzer und Southard
lehren daher unterschiedliche und exklusive Rollen für Lactobionat
und Gluconat in Organkonservierungslösungen, die jeweils statische
Kaltlagerungs- oder Perfusionsansätze verwenden. Belzer lehrt
außerdem
weg von einem kombinierten Ansatz, der versucht, das Beste von einfacher
Spüllagerung
und kontinuierlicher Perfusion aufzunehmen, und zwar auf Grund von „spektakulär schlechten
Ergebnissen" (siehe „Organ
Preservation: Basic and Applied Aspects", Hrsg. D.E. Pegg et al., 1982, S. 339).
-
Die
osmotischen Bestandteile dieser Erfindung können durch das Einschließen von
Saccharose und Mannitol ergänzt
werden, wobei Letzteres auch Eigenschaften als Hydroxylradikalfänger aufweist
und den Vaskularwiderstand durch Induzieren einer Prostaglandin
vermittelte Vasodilatation reduziert, was ein zusätzliche
Vorteil sein kann.
-
Ein
makromolekulares onkotisches Mittel ist ein wichtiger Bestandteil
eines Blutersatzperfusats, um dabei zu helfen, den onkotischen Druck
gleich dem von Blutplasma zu halten. Jedes onkotische Mittel, das ausreichend
groß ist,
um sein Entweichen aus dem Blutkreislauf durch Durchtreten durch
die Fenestration des Kapillarbetts zu verhindern oder zu begrenzen,
kann in Betracht gezogen werden. Beispiele von annehmbaren kolloidalen
osmotischen Mitteln schließen
Folgendes ein, nämlich
Blutplasma; Expander wie Humanserumalbumin; Hetastarch oder Hydroxyethylstärke (HES),
ein künstliches
Kolloid, das aus wachsähnlicher
Stärke
entstanden ist und fast vollständig
aus Amylopektin besteht, wobei Hydroxyethylethergruppen in die α-1-4 verbundenen
Glucoseeinheiten eingeführt
wurden, ein Gelatinepolypeptid; Polyethylenglykol; und Polysaccharidpolymere
aus D-Glucose, wie zum Beispiel Dextrane. Ein bevorzugtes onkotisches
Mittel um den hydrostatischen Druck der Perfusion auszugleichen
und dabei zu helfen interstitiale Ödeme zu verhindern ist Dextran-40 (durchschnittliches
Molekulargewicht = 40,000 Daltons). Es war seit langem bekannt,
dass Dextran durch Verhindern des Verklumpens der roten Blutkörperchen
und durch Erhöhen
des intravaskulären
osmotischen Drucks und durch Vermindern des vaskulären Widerstandes
die Effizienz des Entfernens von Erythrozyten aus dem Mikrogefäßsystem
von gekühlten
Organen verbessern kann. Dextran findet klinisch breite Anwendung
als Plasmaexpander und wird einfach und schnell durch die Nieren
ausgeschieden. Es gibt außerdem
zahlreiche neue Hinweise darauf, dass Dextran-40 ein effektives
und gut toleriertes Kolloid in modernen Kaltlagerlösungen zur
Organkonservierung ist.
-
Die
Retention des Kolloids im vaskulären
Raum ist ein wichtiger Gesichtspunkt zum Erreichen einer idealen
onkotischen Unterstützung,
und im Zusammenhang mit der Perfusioin von isolierten Organen über mehrere
Tage können
andere Kolloide gegenüber
Dextran-40 bevorzugt werden. Für
die Ganzkörperperfusion im
Bereich von 3 Stunden kann jedoch die relative Permeabilität von verschiedenen
Kolloiden weniger wichtig als andere Qualitäten sein und nicht antigenes
Dextran 40 von klinischer Qualitätsstufe
ist auf Grund der zuvor umrissenen Gründe bevorzugt. Jedes Dextran,
das während
der hypothermischen Prozedur in den interstitialen Raum eindringen
sollte, wird nach der Rückkehr
zu physiologischen Bedingungen auch einfach daraus eluiert. Ein
weiterer möglicher
Vorteil der Verwendung von Dextran ist, dass die Viskosität des Blutersatzes
nicht so hoch sein wird wie mit anderen Kolliden, wie HES. Dies
ist auch eine wichtige Erwägung
unter rheologischen Gesichtspunkten bei einer Ganzkörper- oder
auch nur bei einer Cerebralperfusion. Obwohl die hierin beschriebene
bevorzugte Ausführungsform
zu aller erst die Nierenkonservierung betrifft, ist die universelle
Designstrategie des vereinheitlichten Lösungssystems für ausgedehnte
hypothermische Anwendungen einschließlich einer Ganzkörperauswaschung
gedacht.
-
Das
Ionengleichgewicht, insbesondere die Na+/K+ und Ca2+/Mg2+ Verhältnisse,
werden vorzugsweise so eingestellt, dass der passive Diffusionsaustausch
bei niedrigen Temperaturen, wenn die Ionenpumpen deaktiviert sind,
begrenzt wird. In der bevor zugten Ausführungsform mit hoher Kaliumkonzentration
der zuvor beschriebenen vereinheitlichten Lösung, sind die Konzentrationen
der monovalenten Kationen Na+ und K+ in etwa equimolar, um ihren passiven Transmembranaustausch
zu begrenzen. In einer alternativen Ausführungsform des vereinheitlichten
Lösungssystems
mit niedriger Kaliumkonzentration wird das Gleichgewicht von Na/K
im Hinblick auf die Bedenken wegen eines toxischen Effekts der hohen
K+-Konzentration im Herz auf 125/25 verändert. Die
Konzentration wird hoch genug gehalten, um einen kardioplegischen
Effekt der Lösung beizubehalten.
Im Bereich der Kardioplegie und der Herzmuskelkonservierung gibt
es gute Hinweise auf ein verbessertes Überleben unter Verwendung von
erhöhten
Konzentrationen von Magnesium und sehr niedrigen Mengen, die aber
nicht Null sind, von Calcium, um das mutmaßliche Calciumparadox zu vermeiden.
Etwas Glucose ist in diesen hypothermischen Lösungen als Substrat eingeschlossen,
aber die Konzentration ist niedrig, um eine exogene Überladung
während
der Hypothermie zu verhindern. Dies kann durch anaerobe Glykolyse
die Lactatproduktion und die intrazelluläre Azidose potenzieren.
-
Azidose
ist eine besondere Gefahr während
der Hypothermie und besondere Aufmerksamkeit wurde dem Einschluss
eines pH-Puffers
geschenkt, der unter den bei niedrigen Temperaturen vorherrschenden nicht-physiologischen
Bedingungen effektiv ist. HEPES wird als einer der am häufigsten
verwendeten biokompatiblen Aminosulfonsäurepuffer bevorzugt, von denen
gezeigt wurde, dass sie bei niedrigen Temperaturen überlegene
Pufferkapazitäten
aufweisen, und die als Hauptbestandteil in anderen hypothermischen
Gewebekonservierungsmedien eingeschlossen wurden. Synthetische zwitterionsche
Puffer wie HEPES, tragen außerdem auf
Grund ihres Molekulargewichts (HEPES=238 Daltons) zur osmotischen
Unterstützung
in den extrazellulären
Bereichen bei. Adenosin ist ein facettenreiches Molekül und kann
in die hypothermischen Blutersatzmittel nicht nur als Substrat für die Regeneration
von ATP während
des Wiedererwärmens,
sondern auch als vasoaktiver Bestandteil eingeschlossen werden,
um durch Vasodilatation ein effektives vaskuläres Spülen zu erleichtern. Glutathion
kann sowohl als zelluläres
Antioxidans und als Hydroxylradikalfänger, als auch als Cofaktor
für die
Glutathionperoxidase eingeschlossen werden, die den Stoffwechsel
von Lipidperoxiden und Wasserstoffperoxid ermöglicht.
-
Perfusionsvorrichtungen
und Verfahren, mit denen Ausführungsformen
dieser Erfindung verwendet werden können, sind in der gleichzeitig
anhängigen
US-Patentanmeldung Ser. No. 09/162,128 beschrieben, die hiermit
in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
-
Beispielhafte
wässrige
Formulierungen sowohl von intrazellulären als auch von extrazellulären Basislösungen sind
nachstehend erläutert.
Die Formulierungen können
im Wesentlichen etwa die aufgelisteten Mengen enthalten.
-
Beispielhafte intrazelluläre Basislösungen
-
Ionische Bestandteile
-
- 40–80
mM Na+;
- 50–90
mM K+;
- 0,01–0,1
mM Ca+ +;
- 5–25
mM Mg+;
- 20–40
mM Cl–;
-
pH Puffer
-
- 1–5
mM 2ZP04 –;
- 3–7
mM HCO3 –;
- 25–50
mM HEPES;
-
Impermeanten
-
- 25–50
mM Lactobionat;
- 10 mM-1M Saccharose;
- 15–30
mM Mannitol;
- 1–10
mM Glucose;
- 50–100
mM Gluconat;
-
Kolloide
-
-
Pharmakologische Bestandteile
-
- 0,1–2
mM Adenosin; und
- 1–5
mM Glutathion
-
Beispielhafte
intrazelluläre
Basislösung
mit hoher Kaliumkonzentration
-
Ionische Bestandteile
-
- 62,5 mM Na+;
- 70,0 mM K+;
- 0,05 mM Ca++;
- 15,0 mM Mg++;
- 30,1 mM Cl–;
-
pH Puffer
-
- 2,5 mM H2PO4 –;
- 5,0 mM HCO3 –;
- 35,0 mM HEPES;
-
Impermeanten
-
- 30,0 mM Lactobionat
- 15,0 mM Saccharose;
- 25,0 mM Mannitol;
- 5,0 mM Glucose;
- 70,0 mM Gluconat;
-
Kolloide
-
-
Pharmakologische Bestandteile
-
- 2,0 mM Adenosin, und
- 3,0 mM Glutathion.
-
Diese
beispielhafte intrazelluläre
Basislösung
weist eine Osmolalität
(mOsm/Kg) von 350, einen pH von etwa 7,6 und eine [K+]
[Cl–]
von etwa 2100 auf.
-
Beispielhafte
intrazelluläre
Basislösung
mit niedriger Kaliumkonzentration
-
Ionische Bestandteile
-
- 100–150
mM Na+;
- 15–40
mM K+; 0,01–0,1 mM Ca++;
- 5–25
mM Mg++;
- 20–40
mM Cl–;
-
pH Puffer
-
- 1–5
mM H2PO4 –;
- 3–7
mM HCO3 –;
- 25–50
mM HEPES;
-
Impermeanten
-
- 25–50
mM Lactobionat;
- 10 mM-1M Saccharose;
- 15–30
mM Mannitol;
- 1–10
mM Glucose;
- 50–100
mM Gluconat;
-
Kolloide
-
-
Pharmakologische Bestandteile
-
- 0,1–2
mM Adenosin; und
- 1–5
mM Glutathion
-
Beispielhafte
intrazelluläre
Lösung
mit niedriger Kaliumkonzentration
-
Ionische Bestandteile
-
- 125 mM Na+;
- 25,0 mM K+;
- 0,05 mM Ca++;
- 15,0 mM Mg++;
- 30,1 mM Cl–;
-
pH Puffer
-
- 2,5 mM H2PO4 –;
- 5,0 mM HCO3 –;
- 35,0 mM HEPES;
-
Impermeanten
-
- 30,0 mM Lactobionat;
- 15,0 mM Saccharose;
- 25,0 mM Mannitol;
- 5,0 mM Glucose;
- 70,0 mM Gluconat;
-
Kolloide
-
-
Pharmakologische Bestandteile
-
- 2,0 mM Adenosin; und
- 3,0 mM Glutathion
-
Beispielhafte extrazelluläre Basislösung
-
Ionische Bestandteile
-
- 120–160
mM Na+;
- 3–9
mM K+;
- 1–3
mM Ca++;
- 1–10
mM Mg++;
- 100–150
mM Cl–;
- 1–10
mM (SO4)2–;
-
pH Puffer
-
- 1–3
mM H2PO4 –;
- 20–30
mM HCO3 –;
- 5–15
mM HEPES;
-
Impermeanten
-
-
Kolloide
-
-
Pharmakologische Bestandteile
-
- 0,1–2
mM Adenosin; und
- 1–5
mM Glutathion
-
Beispielhafte extrazelluläre Basislösung
-
Ionische Bestandteile
-
- 141,2 mM Na+;
- 6,0 mM K+;
- 1,5 mM Ca++;
- 5,0 mM Mg++;
- 122,0 mM Cl–;
- 1,0 mM (SO4)2–;
-
pH Puffer
-
- 1,2 mM H2PO4 –;
- 25,0 mM HCO3 –;
- 25,0 mM HEPES;
-
Impermeanten
-
-
Kolloide
-
-
Pharmakalogische Bestandteile
-
- 1,0 mM Adenosin; und
- 3,0 mM Glutathion.
-
Diese
beispielhafte extrazelluläre
Basislösung
weist eine Osmolalität
(mOsm/Kg) von 315, einen pH von etwa 7,5 und ein [K+]
[Cl–]
von etwa 732 auf.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1: Hypothermische
Konservierung von Gewebekulturzellen
-
Es
wurden Vorabexperimente unternommen, um die Lebensfähigkeit
von Zellen nach hypothermischer Exposition bei 4°C in der exemplarischen Ausführungsform
der Erfindung mit hoher Kaliumkonzentration und in anderen Lagermedien
zu untersuchen. Diese Experimente wurden unter Verwendung einer
Hundenierenzelllinie (MDCK) durchgeführt, da dies eine vergleichbare
Referenz mit vorhergehenden Arbeiten bei der Entwicklung von hypothermischen
Lösungen
schuf . Die Zellen wurden mit 1 × 104 Zellen/Well
in Dulbecco's Modified
Essential Medium (DMEM) zur Kultivierung bei 37°C ausplattiert. Am nächsten Tag
wurde die Platte auf Eis verbracht und das DMEM Medium wurde wie
in 1 spezifiziert mit
100μl einer
der vier in diesem Experiment untersuchten Lagerlösungen ersetzt.
Jede Platte wurde entweder für
einen oder fünf
Tage bei 4°C gehalten.
Nach der Lagerung wurde die Vehikellösung entfernt und, in Vorbereitung
für die
Untersuchung der Lebensfähigkeit
unter Verwendung von Alamar Blue, wobei es sich um einen nicht toxischen
Indikator der mitochondrialen oxidativen Phosphorylation handelt
und das somit direkt den Stoffwechselstatus der Zelle misst, mit
DMEM Kulturmedium ersetzt.
-
Aus
den in 1 zusammengefassten
Daten wird ersichtlich, dass nach 24 Stunden Exposition bei 4°C der Lebensfähigkeitsindex
für Zellen,
die in Dulbecco's
Modified Essential Medium (DMEM) gelagert wurden, etwa so niedrig
wie die „keine-Zellen" Basislinienkontrolle
war, was anzeigt, dass Standard-DMEM-Kulturmedium
während
dieses Zeitraums der hypothermischen Lagerung keinen Schutz verleiht.
Die Antwort der in EuroCollins (EC) gelagerten Zellen war geringfügig besser,
aber im Vergleich mit den Indizes für die in zwei „intrazellulären" Lösungen (die
beispielhafte Ausführungsform
der Erfindung mit hoher Kaliumkonzentration und ViaspanTM)
gelagerten Zellen deutlich unterlegen. Wir schließen, dass „intrazelluläre" Lösungen,
wie die der Erfindung und ViaspanTM, während hypothermischer
Exposition im Vergleich entweder mit Standardkulturmedium oder mit
EuroCollins Organkonservierungslösung überlegenen
Zellschutz bieten. Die neue Lösung dieser
Erfindung bietet außerdem,
auf Basis dieser Vorabstudie, zumindest den gleichen Schutz wie
andere etablierte hypothermische Lösungen einschließlich des
Industriestandards für
Organe, ViaspanTM. Diese Experimente wurden
erweitert, um, wie nachstehend beschrieben, eine 24 Stunden Lagerung
von Schweinenieren einzuschließen.
-
Diese
Studien wurden erweitert, um zwei zusätzliche Zelltypen in vitro
einzuschließen,
wobei die Zelllebensfähigkeit
unter Verwendung von Alamar Blue zu verschiedenen Zeitpunkten im
Anschluss an die hypothermische Lagerung untersucht wurde. Die vaskuläre Glattmuskelzelllinie
(A10) und eine endotheliale Rinderlungenzelllinie (CPAE) wurden
in diesen Experimenten verwendet. Die Zellen wurden mit einer Dichte
von 1 × 10° Zellen/Well
in Standardzellkulturmedium ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Platten
auf Eis verbracht und das Medium wurde mit 100μl der verschiedenen Lagerlösungen ersetzt
(siehe 2–5).
-
Die
Platten wurden entweder für
einen oder drei Tage bei 4°C
im Kühlschrank
gelagert. Im Anschluss an die Lagerung wurden die Platten wiederum
auf Eis verbracht und die Lagerlösungen
wurden zur Messung der Zelllebensfähigkeit mit Alamar Blue durch
Medium ersetzt. Die Lebensfähigkeit
wurde zu zwei Zeitpunkten, entweder direkt nach der Exposition (2–5)
oder für
sechs aufeinanderfolgende Tage nach der Exposition bei 4°C (6 und 7) gemessen.
-
Die
vergleichende Lebensfähigkeit
der Zellen am Ende jedes Lagerintervalls ist in 2–5 dargestellt. Die Lebensfähigkeit
beider Zelltypen nach 24 Stunden hypothermischer Lagerung in UHK
war gleich oder besser als in ViaspanTM (2–5).
Nach drei Tagen bei 4°C
demonstrierte UHK für
A10 Zellen eine bessere Lebensfähigkeit
als ViaspanTM und eine ähnliche Lebensfähigkeit
für CPAE
(4 und 5). Im Vergleich dazu zeigten die anderen
Lösungen
DMEM, EC und Belzer's
MPS (Maschinenperfusionslösung)
alle nach drei Tagen der Lagerung einen unterlegenen Schutz. Die
Lebensfähigkeitsindizes
waren für
die A10 Zellen nicht größer als
die Hintergrundlevel (keine Zellen), sowohl nach einem, als auch
nach drei Tagen hypothermischer Lagerung. In EC Lösung zeigten
CPAE Zellen nach einem Tag hypothermischer Lagerung eine gewisse
Lebensfähigkeit,
aber nach drei Tagen ging die Lebensfähigkeit in EC auf Hintergrundlevel
zurück.
DMEM und die Belzer Lösung
lagen beide für
die CPAE Zellen nach einem und nach drei Tagen hypothermischer Lagerung
auf dem Hintergrundlevel.
-
Das
Messen der Zelllebensfähigkeit
direkt nach der Niedertemperaturlagerung gibt nicht notwendiger Weise
einen guten Hinweis auf das Zellüberleben.
Mit der Zeit können
die Zellen weitere Veränderungen
erfahren, einschließlich
der Reparatur von subletalen Verletzungen oder Zelltod durch die
Vorgänge
der Apoptose und Nekrose. Was auch immer das letztendgültige Schicksal
der hypothermisch exponierten Zellen sein mag, benötigen die
Prozesse Zeit zur vollen Manifestation, und die Überlebenskurven während den
Tagen im Anschluss an die Rückkehr
zu physiologischen Temperaturen sind informativ über den wahren Zustand der Lebensfähigkeit.
Im Licht dieser Bedingungen untersuchten wir die posthypothermische
Lebensfähigkeit
während
sechs aufeinanderfolgenden Tagen der Kultivierung bei 37°C weiter
(6 und 7). Eine solche Untersuchung war möglich, da
Alamar Blue für
Zellen nicht toxisch ist und als nicht zerstöreririscher Lebensfähigkeitsassay
wiederholt auf die gleiche Zellcharge angewendet werden kann.
-
6 und 7 veranschaulichen, dass im Allgemeinen
das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration („HK") die gleiche oder eine bessere Konservierung
als die anderen Lösungen
bereitstellte. Beide „intrazelluläre" Lösungen,
ViaspanTM und das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration
erwiesen sich im Vergleich mit anderen Lösungen als überlegen. Nach drei Tagen hypothermischer
Lagerung waren nur die CPAE Zellen, die im ViaspanTM oder
dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration gelagert wurden, und
nur die in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration gehaltenen
A10 Zellen in der Lage, sich in der Kultur fortzupflanzen.
-
Diese
und ähnliche
Beobachtungen zeigen, dass das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration
gegenüber
allgemein verwendeten Lösungen,
die für
die hypothermische Lagerung von Geweben und Organen verwendet werden,
zumindest gleich oder überlegen
ist.
-
BEISPIEL 2: Vergleichende
Kryokonservierung von Zellen unter Verwendung eines bevorzugten
Ausführungsbeispiels
der beispielhaften intrazellulären
High-K Basislösung.
-
Das
gleiche System, das zuvor für
die Zellen in Mikrotiterplatten beschrieben wurde, wurde verwendet, um
ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der beispielhaften intrazellulären
High-K Basislösung
als neue Trägerlösung für Kälteschutzzusatzstoffe
(CPA) zu untersuchen. Spezifisch wurde eine phosphatfreie Formulierung
der neuen High-K Lösung
hergestellt, um die bekannte Prezipitation von divalenten Phosphatkationen
in Anwesenheit des Kälteschutzmittels
DMSO bei niedrigen Temperaturen zu vermeiden. Das Zellüberleben
wurde nach Einfrieren und Auftauen in Anwesenheit einer Reihe von
DMSO Konzentrationen verglichen, die entweder in der neuen phosphatfreien
HK-Kälteschutzvehikellösung (HK-CV)
oder EuroCollins Medium hergestellt wurden. EuroCollins ist eine
Organkonservierungslösung, die
auf dem Gebiet der Kryobiologie ebenfalls als Vehikellösung für Kälteschutzmittel
verwendet wurde.
-
Zellen
wurden mit 2 × 10° Zellen/Well
ausplattiert und nach Inkubation über Nacht wurde das reguläre Kulturmedium
mit den experimentellen CPA Mischungen ersetzt, wobei das folgende
Protokoll verwendet wurde: die Platten wurden mit einer kontrollierten
Geschwindigkeit (1°C
pro Minute) auf –80°C abgekühlt und
dann über
Nacht bei –135°C gelagert.
Die Platten wurden dann unter Verwendung eines Erwärmungsprotokolls
mit zwei Schritten aufgetaut und die CPA wurde, unter Verwendung
von Mannitol als osmotischem Puffer, verdünnt. Die Zelllebensfähigkeit
wurde unter Verwendung des Alamar Blue Assays auf zelluläre Stoffwechselaktivität bei 37°C hin bewertet.
Die 15 und 16 zeigen die vergleichende
Lebensfähigkeit
von zwei Zelltypen nach Kryokonservierung in den jeweiligen Medien.
Die Daten zeigen, dass das optimale Überleben der beiden Zelltypen
unter Verwendung von 1–2
molaren DMSO erreicht wurde, aber dass die prozentuale Lebensfähigkeit,
die auf unbehandelte Zellen normalisiert wurde, für die in
der neuen intrazellulären
HK Basisvehikellösung konservierten,
im Vergleich mit EuroCollins Medium, merklich höher war. Dies war sowohl für die A10
Glattmuskelzellen als auch für
die endothelialen Rinderhornhaut (BCE) Zellen konsistent.
-
BEISPIEL 3: Strukturelle
Integrität
von hypothermisch gelagerten Venen
-
Die
hypothermische Lagerung von ganzen Organen, die mit einer Konservierungslösung gespült oder durchspült wurden,
ist in der klinischen Transplantation allgemeine Praxis. Dieses Verfahren
belässt
die endothelialen vaskulären
Zellen während
des Zeitraums der kalten Ischämie
in direkter Berührung
mit dem Konservierungsmedium. Die Auswirkung der Lagerbedingungen
auf die Integrität
des vaskulären
Endotheliums ist daher von äußerster
Wichtigkeit für
die Qualität
der Konservierung von intakten Organen.
-
Es
wurde eine Pilotstudie durchgeführt,
um die mikroskopischen Veränderungen
in der Gewebemorphologie zu vergleichen, wenn entnommene Blutgefäße in der
Beispielslösung
für hypothermische
Konservierung mit hoher Kaliumkonzentration eingetaucht und transportiert
wurden, und zwar im Vergleich mit Dubecco's Minimum Essential Medium (DMEM), wobei
es sich um ein verbreitetes Kulturmedium handelt, das dazu verwendet
wird, Gewebe ex vivo zu inkubieren und zu transportieren. Für drei separate
Experimente wurden frische Jugularvenen aus Kaninchen entnommen
(mit einem Verfahren das wir extensiv verwendet haben) und entweder
in vorgekühltes
DMEM oder das Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration eingetaucht.
Beide Lösungen
wurden auf Eis gehalten. Die Gewebeproben wurden dann in das Labor
transportiert, wo die Blutgefäße zum Fixieren
und Weiterverarbeiten für
die Histopathologie in Abschnitte geschnitten wurden. Die Gesamtzeit der
kalten Ischämie
in diesen Experimenten war relativ kurz, nämlich 34,5 ± 9,5 Minuten für die in
DMEM transportierten Proben und 37 ± 4 Minuten für die Proben
in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration.
-
Das
in DMEM auf Eis eingetauchte und transportierte Gewebe zeigte, wie
in 8 gezeigt, mikroskopische
Veränderungen
in der Tunika Intima und der Tunika Media. Die Intima war intakt,
es gab aber eine extreme Vakuolisierung (angezeigt durch die Pfeile)
der unterliegenden Basallamina, was wiederum die Extrusion von Endothelialzellen
in das Lumen verursachte und ein „aufgerundetes" Aussehen ergab.
Abgesehen von dieser Vakuolisierung wiesen die endothelialen Zellen
ein fast normales Aussehen auf. Die Glattmuskelzellen (SM) wiesen
ein etwas geschrumpftes Aussehen mit unregelmäßigen Konturen auf. Die Tunika
Adventitia war im Wesentlichen normal. Das Lumen L ist ebenfalls
dargestellt.
-
Im
Gegensatz dazu zeigten die Jugularvenen, die in dem Beispiel mit
hoher Kaliumkonzentration transportiert wurden, im Vergleich mit
der DMEM Gruppe, wie in 9 dargestellt,
wenige, wenn überhaupt irgendwelche
histologischen Veränderungen.
Die Tunika Intima war intakt und es gab wenig Hinweise auf eine Vakuolisierung
der darunterliegenden Basalmembran. Die Glattmuskelzellen (SM) erschienen
nicht geschrumpft und befanden sich in einer normalen horizontalen
Orientierung.
-
Diese
Vorabexperimente demonstrieren, dass die kalte Ischämie in den
in Kulturmedium gelagerten Venen innerhalb von weniger als einer
Stunde zu mikroskopischen Veränderungen
führt.
Im Gegensatz dazu zeigen die in dem Beispiel mit hoher Kaliumkonzentration
gelagerten Venen diese mikroskopischen Veränderungen nicht. Dies sind
wichtige Beobachtungen, da historisch geschlossen wurde, dass selbst
für eine
Kurzzeitlagerung Salzlösung
nicht das beste Konservierungsfluid ist. Außerdem haben mehrere Studien
gezeigt, wie sensitiv die Endothelialschicht gegenüber Handhabung
ist. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass kalte Konservierung nach
nur 3 Stunden Kaltlagerung zu schweren Veränderungen der Endothelialzellen
und deren merklichen Ablösen
führte.
Viele andere Studien haben jedoch mor phologische und funktionelle
Beschädigungen
von endothelialen Zellen dokumentiert, die durch Kaltlagerung in
autologem Ganzblut, normaler Salzlösung und Ringer's Laktat induziert
wurden. Eine neue Studie hat die „Goldstandard" Organkonservierungslösung ViaspanTM für
die Lagerung von Hundevenen mit autologem Vollblut und normaler
Salzlösung
verglichen. Die Studie zeigte, dass die intimale Hyperplasie und
die vaskuläre
Physiologie nach der Implantation in mit ViaspanTM behandelten
Venentransplantaten und frischen unbehandelten Kontrollen ähnlich war.
Im Gegensatz dazu zeigten die beiden anderen Behandlungsgruppen
statistisch signifikante Veränderungen.
Andere haben jedoch berichtet, dass Lösungen vom hyperkalemischen
Typ (von denen ViaspanTM ein Beispiel ist) Thrombophlebitis
und verminderte fibrinolytische Aktivität des Venenendotheliums verursachen
können.
Wie zuvor diskutiert, gibt es dokumentierte Befürchtungen wegen schädlicher
Auswirkungen von sehr hohen Kaliumleveln (> 100 mM) auf das Herz, wie sie in vielen
Organkonservierungslösungen
gefunden werden.
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BEISPIEL 4: Vergleichende
Organkonservierungsstudien unter Verwendung des Beispiels mit hoher
Kaliumkonzentration
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A. Vergleich der neuen
High-K (HK) Lösung
mit Belzer Maschinenperfusionslösung
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Eine
neue intrazelluläre
Basislösung
mit hoher Kaliumkonzentration wurde mit einer etablierten Lösung (Belzer
Maschinenperfusionslösung
[MPS]) während
kontinuierlicher 18–20
Stunden Perfusionskonservierung von, nach einer Stunde warmer Ischmie,
beschafften Hundenieren verglichen. Im Anschluss an die Beschaffung
aus erwachsenen Mischlingshunden (n–5) wurden beide Nieren mit
Viaspanlösung
gespült
und vor Beginn der Perfusion für
etwa zwei Stunden bei 4°C
gelagert. Die Perfusion wurde unter Verwendung eines multiplen Organwiedergewinnungsperfusionsprototyps
mit zwei unabhängigen
Kreisläufen
durchgeführt.
Eine Niere wurde mit der neuen intrazellulären Basislösung mit hoher Kaliumkonzentration
durchspült
und die gegenüberliegende
Niere wurde mit Belzer WS durchspült, beide bei etwa 9°C und einem
geregelten Druck von 35–40
mmHg. Nach 18–20
Stunden Perfusion wurden die Nieren ektopisch transplantiert, wobei
ein Hundekarotis Modell verwendet wurde.
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Die 10 und 11 zeigen, dass der mittlere arterielle
Durchfluss für
die mit der neuen Lösung
durchspülten
Nieren im Vergleich mit MPS zu jedem Zeitpunkt höher war und die vaskuläre Wiederstandskurve
für die
Nierengruppe der neuen Lösung
niedriger war. Im Allgemeinen waren diese physiologischen Parameter während der
in vitro Perfusion in beiden Gruppen ähnlich. Am Ende von einer Stunde
in vivo, zeigten die mit der neuen Lösung durchspülten Nieren
jedoch höhere
arterielle Flussgeschwindigkeiten (p < 0,5) und niederere interne renale
Wiederstände
(p < 0,5), als
die mit Belzer WS (6)
durchspülten
Nieren.
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Die
Ergebnisse deuten an, dass die neue Lösung für die Perfusionskonservierung
von Nieren eine überlegene
Alternative zu Belzer MPS sein könnte.
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B. Vergleich der neuen
High-K Lösung
mit Viaspanlösung
in einem Schweinemodell
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Die
Effektivität
einer neuen intrazellulären
Basislösung
mit hoher Kaliumkonzentration, die die minimalen theoretischen Anforderungen
für die
Organkaltlagerung erfüllt,
wurde in einem etablierten Schweinenierentransplantationsmodell
mit kommerziellem Viaspan verglichen. Diese in vivo Studien wurden
unter Verwendung eines autologen Schweinemodells durchgeführt, in
dem eine Niere entfernt, gespült
und vor der Reimplantation entweder mit der neuen Lösung mit
hoher Kaliumkonzentration (n=5) oder Viaspan (n=5) für zumindest
20 Stunden gelagert wurde. Die gegenüberliegende nicht operierte
Niere wurde 5–7
Tage später
entfernt und die Leistung der konservierten Niere wurde durch die
Bewertung von BUN, Kreatinin und der Histopathologie bestimmt. 14 zeigt biochemische Indikatoren
(Kreatinin und BUN) der Nierenfunktion für Schweinenieren die nach einem
Minimum von 20 Stunden Kaltlagerungskonservierung entweder in der
neuen intrazellulären
Basislösung
mit hoher Kaliumkonzentration oder Viaspan transplantiert wurden
und zeigt, dass zwischen den zwei Gruppen in allen Bewertungskriteria
keine statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet wurden.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese vorklinischen Resultate
andeuten, dass die Basisformulierung der neuen Lösung mit hoher Kaliumkonzentration
während
den klinisch relevanten Zeiträumen der
Nierenlagerung eine hypothermische Nierenzellenkonservierung bereitstellt,
die zumindest äquivalent
zu der des etablierten Standards Viaspan ist.