DE69713312T2

DE69713312T2 - Verwendung von arabinogalaktan in kryokonservierungsmedien für zelle

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Publication number: DE69713312T2
Application number: DE69713312T
Authority: DE
Inventors: E. Ellington; Adams Oliver
Original assignee: BIO ORIGYN SPOKANE LLC
Current assignee: BIO ORIGYN SPOKANE LLC
Priority date: 1996-03-25
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: CA2250084A1; US5897987A; JP4031044B2; WO1997035472A1; EP0891134B1; JP2000507547A; DE69713312D1; US6593138B1; EP0891134A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegenden Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet von Medien, die Arabinogalactan enthalten, zur Verwendung bei der Kryokonservierung von somatischen Zellen. Die langfristige Lagerung von somatischen Zellen und Geweben hat eine weitverbreitete wesentliche Bedeutung für die Forschung und biomedizinische Gebiete. Die Kryokonservierung von Zellen und Geweben ist nützlich zum Beispiel bei der Lagerung von Blutprodukten zur klinischen Verwendung, der Einrichtung von Organbanken, der langfristigen Lagerung von Zellinien, um eine unveränderliche Zellpopulation bereitzustellen, und der Lagerung von Zellpopulationen zu Forschungs- oder medizinischen Zwecken.
Somatische Zellen können ohne Beschränkung gelagert werden, wenn sie die Temperatur von flüssigem Stickstoff erreichen (-196ºC). Es ist jedoch allgemein erwiesen, daß der Gefrierprozeß selbst zu einer unmittelbaren und langfristigen Schädigung von Zellen führt, wobei die größte Schädigung an den Zellen stattfindet, während sie die mittlere Temperaturzone (-15ºC bis -60ºC) während des Abkühlens und Auftauens durchlaufen (Mazur, Am. J. Physiol., 247: C125-142, 1984). Die hauptsächlichen schädigenden physikalischen Ereignisse, die bei Zellen während des Prozesses des Gefrierens eintreten können, schließen Dehydratisierung und die intrazelluläre Eiskristallbildung ein. Während des Gefrierens wird gelöster Stoff aus der Festphase zurückgestoßen, was zu einer abrupten Konzentrationsveränderung in dem nicht-gefrorenen Teil der Lösung führt. Eine biologische Zelle antwortet auf diese Perturbation durch Dehydratisieren, um einen neuen Gleichgewichtszustand zwischen intrazellulären und extrazellulären Lösungen zu erreichen. Bei hohen Abkühlungsraten kann ein Gleichgewicht nicht aufrechterhalten werden, weil die Rate, mit der das chemische Potential in der extrazellulären Lösung erniedrigt wird, viel größer als die Rate ist, mit der Wasser aus der Zelle diffundieren kann. Das Endresultat dieses Ungleichgewichts ist, daß eine intrazelluläre Eisbildung (IIF) beobachtet wird, die für die Zelle tödlich ist. Toner, J. of Applied Phys., 67: 1582-1593 (1990). Bei niedrigen Abkühlungsraten werden Zellen für lange Zeitperioden bei hohen Temperaturen unterhalb Null gegenüber hohen extrazellulären Konzentrationen ausgesetzt, was zu potentiell schädigenden hohen intrazellulären Konzentrationen führt. Lovelock, Biochem. Biophys. Acta, 10: 414-446 (1953).
Die klinische und kommerzielle Anwendung von Kryokonservierung für bestimmte Zelltypen ist beschränkt durch die Fähigkeit, eine signifikante Anzahl an insgesamt lebensfähigen Zellen wiederzugewinnen. Signifikante Verluste hinsichtlich der Zellebensfähigkeit werden bei bestimmten primären Zelltypen beobachtet. Beispiele eines zellulären Gefrier-Auftau- Traumas sind bei der Kryokonservierung von Hepatocyten (Borel-Rinkes et al., Cell Transplantation, 1: 281-292, 1992), Schweinehornhäuten (Hagenah und Bohnke, 30: 396-406, 1993), Knochenmark (Charak ef al., Bone Marrow Transplantation, 11: 147-2154, 1993) und Schweine-Aortaklappen (Feng et al., Eur. J. Cardiothorac. Surg., 6: 251-255, 1992) angetroffen worden.
Kryokonservierungsprotokolle erfordern typischerweise die Verwendung von kryoprotektiven Mitteln ("CPAs"), um klinisch relevante Überlebensraten für Säugerzellen zu erzielen. Eine Vielzahl von Substanzen sind als potentielle Zusatzstoffe, um das Überleben von Zellen beim Gefrierprozeß zu verbessern, verwendet oder erforscht worden. Die beiden am häufigsten verwendeten Substanzen sind Glyzerin und Dimethylsulfoxid. Andere verwendete Substanzen schließen Zucker, Polymere, Alkohole und Proteine ein. CPAs können, grob gesehen, in zwei verschiedene Kategorien eingeteilt werden; Substanzen, die die Zellmembran durchdringen; und impermeable Substanzen. Ein Schutzmechanismus stammt aus der Reduktion der Netto- Konzentration an ionischen gelösten Stoffen für eine Temperatur unterhalb von Null, wenn ein CPA vorhanden ist. Dieser kolligative Effekt trifft für alle Substanzen zu, die als ein CPA fungieren (Fahy, Biophys. J. 32: 837-850, 1980). Die Zugabe eines CPA verändert jedoch die Ionizität der Lösung. Sowohl Gewebe als auch intakte Organe können eine reduzierte zelluläre Lebensfähigkeit aufweisen, wenn sie gegenüber hinreichend großen schrittweisen Veränderungen in der äußeren Osmolarität ausgesetzt werden, die durch die Einführung einer Gefrierlösung produziert wird. Pegg, Cryobiology, 9: 411-419 (1972). Zusätzlich ist ein langfristiges Aussetzen bereits gegenüber niedrigen Konzentrationen von bestimmten CPAs bei Zimmertemperatur potentiell schädigend (Fahy, Cryobiology, 27: 247-268, 1990). Zwei der am weitesten verwendeten kryokonservierenden Mittel, Dimethylsulfoxid ("DMSO") und Glyzerin, sind schädigend gegenüber aufgetauten Zellen aufgrund von osmotischen Komplikationen und müssen von den Zellen nach dem Auftauen mittels Spülung und Zentrifugieren entfernt werden.
Ein weitere Medienbestandteil, der routinemäßig zu Gefriermedien zugegeben wird, um Zellschädigung und -tod während des Gefrierens und Auftauens zu reduzieren, ist Serum. Dieser Zusatzstoff ist jedoch hochkomplex und kann eine Anzahl an Faktoren (bekannte und unbekannte) hinzufügen, die die Zellfunktion stören oder verändern können. Andere nicht- permeierende protektive Mittel, wie Ethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon (Klebe und Mancuso, In Vitro, 19: 167-170, 1983), Saccharose und Kulturmedium (Shier und Olsen, In Vitro Cell Dev. Biol., 31: 336-337, 1995), sind im Hinblick auf ihre Effektivität als kryoprotektive Mittel für Zellen mit unterschiedlichen Resultaten studiert worden.
US-Patent Nr. 4,004,975 an Lionetti et al. offenbart die Kryokonservierung von Leukocyten aus zentrifugiertem Blut in einer Lösung aus Hydroxyethylstärke und Dimethylsulfoxid. US- Patent Nr. 5,071,741 an Brockbank sowie PCT WO 92/08347 an Cryolife, veröffentlicht am 29. Mai 1992, offenbaren die Verwendung von Polysacchariden, die aus Algen stammen, wie etwa Agarose und Alginat, in einem kryoprotektiven Zellmedium. US-Patent Nr. 5,405,742 an Taylor offenbart eine Lösung zur Verwendung als ein Blutersatzstoff und zum Konservieren von Gewebe, die Dextran einschließt.
PCT WO 95/06068 (Zusammenfassung) offenbart die Verwendung von Polysacchariden in, um die hämatopoietischen Funktionen zu verbessern und als ein radioprotektives Mittel zu dienen. Die Verwendung von Gummi arabicum, Kirschharz und Aprikosenharz in Medium zum Einfrieren von Schafsamen wird in Platov et al., Ovtsevodstvo, 10: 38-39 (1980) (Zusammenfassung) offenbart. Holtz et al., Proc. Fourth Intern. Symp. Repr. Phys. Fish, (1991) offenbart die Verwendung von Sacchariden, wie Glucose und Saccharose, bei der Kryokonservierung von Forellensamen. Hill et al., J. Lab. Clin. Med., 111: 73-83 (1988) offenbart die Verwendung von Arabinogalactan, um gewaschene murine Blutplättchen mittels Zentrifugieren zu erhalten. Maisse, Aquat. Living Resour., 7: 217-219 (1994) offenbart eine Studie des Effekts von Kohlenhydraten, wie Glucose und Maltose auf die Kryokonservierung von Forellenspermien. Isotonische Saccharose in Kombination mit Kälberserum ist in einem Medium zur Kryokonservierung von Säugerzellen verwendet worden. Shier und Olsen, In Vitro Cell. Dev. Biol., 31: 336-337 (1995).
Die Herstellung von Derivaten von Arabinogalactan und Arabinogalactan-Abbauprodukten wird in Prescott et al., Carbohydrate Research, 278: 113-128 (1995), sowie US-Patent Nr. 5,478,576 an Jung et al. offenbart, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme einbezogen ist.
Es gibt einen Bedarf für Zusatzstoffe, die Zellgefriermedien zugefügt werden können, die die Zellen während des Gefrierens stabilisieren und die Zellen vor Schädigung schützen, die nicht toxisch sind und die für einen großen Bereich von Zelltypen in einer großen Vielfalt von Zellkultur- und klinischen Anwendungen geeignet sind.
Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Medien zur Konservierung von somatischen Zellen während des Gefrieren bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Medien bereitzustellen, die verwendet werden können, um somatische Zellen zu konservieren und die Lebensfähigkeit der Zellen beim Gefrieren und Auftauen aufrechtzuerhalten. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Medien bereitzustellen, die für die Kryokonservierung eines großen Bereichs von verschiedenen somatischen Zelltypen verwendet werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zum Kryokonservieren von somatischen Zellen bereitgestellt. In einer Ausführungsform wird ein Zell-Kryokonservierungsmedium bereitgestellt, das eine effektive Menge an Arabinogalactan enthält, um die Lebensfähigkeit von Zellen beim Gefrieren, der Lagerung und dem Auftauen aufrechtzuerhalten. Die Zellen können während der Lagerung auf eine Temperatur von ungefähr oder unterhalb von 4ºC, zum Beispiel auf ungefähr -200ºC abgekühlt oder gefroren werden. Bevorzugt wird das Medium auf eine Temperatur zwischen ungefähr -70ºC und -200ºC gefroren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ultra-raffiniertes Arabinogalactan im Kryokonservierungsmedium bereitgestellt, fakultativ in Kombination mit einem zweiten Kryokonservierungsmittel, wie etwa Dimethylsulfoxid. Das Medium kann für die Kryokonservierung einer großen Vielfalt von verschiedenen Zelltypen aus verschiedenen Quellen verwendet werden. Zum Beispiel können Säugerzellen, einschließlich Schweine-, Hunde-, menschlichen, Pferde-, Nagetier- und bovinen Zellen, indem Medium kryokonserviert werden. Die Anwesenheit von Arabinogalactan im Medium schützt die Lebensfähigkeit der Zellen in dem Medium während des Prozesses des Gefrierens, der Lagerung und des Auftauens.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Kryokonservierung von somatischen Zellen und Geweben bereitgestellt. In einer Ausführungsform werden Medien, die ultra- raffiniertes Arabinogalactan enthalten, und Verfahren zur Verwendung der Medien beim Kryokonservieren von Zellen zum Schutz der Zellebensfähigkeit beim Gefrieren und Auftauen bereitgestellt. In dem Verfahren dient Arabinogalactan als ein nicht-permeierendes kryoprotektives Mittel und übt vorteilhafterweise keinen Effekt auf die Osmolalität der extrazellulären Umgebung aus.

Arabinogalactan

Arabinogalactan ist ein wasserlösliches Polysaccharid, das aus Spezies des Genus Larex isoliert werden kann. Arabinogalactan kann bis zu 35% des gesamten Kernholzes einiger Spezies ausmachen. Stout, "Larch Arabinogalactan" in Industrial Gums, R. L. Whistle Ed., Academic Press, New York, S. 307-310, 1959. Es ist stark löslich und kann in 95% Reinheit aus Lärchen-Spänen erhalten werden. Die vorhandenen Unreinheiten sind überwiegend monomere Zucker, Polyphenole und Salze. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ultra-raffiniertes Arabinogalactan, das hochaufgereinigt ist, in dem Zell-Gefriermedium verwendet. Verfahren zu Herstellung von ultra-raffiniertem Arabinogalactan werden in US-Patent Nr. 5,116,969 offenbart, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme einbezogen wird. Ultra-raffiniertes Arabinogalactan von einer Reinheit größer als 95% oder fakultativ größer als 99,9% (Larex UFTM) ist erhältlich von Larex, International, St. Paul, Minnesota. Ultra-raffiniertes Arabinogalactan liefert vorteilhafterweise einen kleinen oder keinen Beitrag zur Osmolalität von wäßrigen Lösungen, in denen es ein gelöster Stoff ist. Ultra-raffiniertes Arabinogalactan ist vorteilhafterweise hochstabil, nicht toxisch und wasserlöslich.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Arabinogalactan", wenn nicht anders spezifiziert, natürlich vorkommendes oder synthetisches Arabinogalactan, Teile von Arabinogalactan, wie etwa Abbauprodukte, und chemisch oder biochemisch modifiziertes Arabinogalactan oder Teile davon ein, die modifiziert worden sind, unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet verfügbar sind, die in einem Medium zur Kryokonservierung von somatischen Zellen wirksam ist, um somatische Zellebensfähigkeitseigenschaften beim Gefrieren und Auftauen von somatischen Zellen in dem Medium zu schützen.
Wie hierin definiert, bezieht sich "ultra-raffiniertes Arabinogalactan" auf Arabinogalactan, das aus einer Pflanzenquelle, wie etwa Bäumen des Genus Larix mit einer Reinheit größer als 95% isoliert worden ist. Das Molekulargewicht des Arabinogalactan in einer Ausführungsform reicht von ungefähr 6.000 bis 2.500.000. In einer anderen Ausführungsform ist das Molekulargewicht des ultra-raffinierten Arabinogalactans zwischen ungefähr 10.000 und 30.000 Daltons (mittels Größenausschlußchromatographie mit einem Pullulan-Bezugswert).
Arabinogalactan stellt eine nützliche preiswerte Alternative zur Verwendung von DMSO oder Serum bei Medien zur Zell-Kryokonservierung bereit. Arabinogalactan aus Larix-Spezies ist nützlich, weil es extrem wasserlöslich ist, mit einer sehr engen Molekulargewichtsverteilung natürlich vorkommt und stark verzweigt ist und daher nicht Viskositätsproblemen unterliegt.

Zell-Kryokonservierungsmedien

In einer Ausführungsform wird das Zellmedium durch Zugabe von ultra-raffiniertem Arabinogalactanpulver, wie etwa Larex UFTM, erhältlich von Larex, International, St. Paul, Minnesota, zu einer ausgeglichenen Salzlösung, geeignet für einen spezifischen Zelltyp, gebildet, wobei die Konzentration an ultra-raffiniertem Arabinogalactan ausreicht, um die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen der Zellen beim Gefrieren, der Lagerung und dem Auftauen zu schützen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Arabinogalactan innerhalb des Zell-Kryokonservierungsmediums aufgelöst, jedoch kann das Medium ebenso Formulierungen einschließen, bei denen Arabinogalactan dispergiert ist.
Das Zell-Kryokonservierungsmedium wird hergestellt durch Zugabe einer effektiven Konzentration von Arabinogalactan zu einem einfachen Medium, wie etwa einem Gewebe- oder Zellkulturmedium mit ausgeglichenem Salzgehalt, das für einen spezifischen Zelltyp angelegt ist. Die Konzentration von Arabinogalactan kann so hoch sein wie die maximale Konzentration von Arabinogalactan, die in dem Kryokonservierungsmedium löslich ist, und reicht typischerweise von zwischen 5 und 70% (Gew./Vol.) in dem Kryokonservierungsmedium. Eine bevorzugte Konzentration von Arabinogalactan liegt zwischen ungefähr 14 und 20% (Gew./Vol.), obwohl die Konzentration an Arabinogalactan ebenso zwischen ungefähr 20 und 50%, bevorzugt zwischen ungefähr 44 und 50% (Gew./Vol.) sein kann. Dulbecco's Minimal Essential Medium ("DMEM") ist das bevorzugte Medium für viele Zelltypen. Andere Zusammensetzungen können den Zellmedien zugegeben werden, wie etwa Aminosäuren, Cytokine, Lipide, Wachstumsfaktoren, Albumine, Antibiotika, Antimykotika, Albumine, Steroidhormone und Proteinhormone. Spezialisierte Zellkulturmedien, die auf dem Gebiet verfügbar sind, die für einen individuellen Zelltyp angelegt und optimiert sind, können verwendet werden.
Zusätzlich zu Arabinogalactan können fakultativ eines oder mehrere zusätzliche kryoprotektive Mittel in dem Medium vor der Lagerung einbezogen werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "kryoprotektives Mittel" auf eine synthetische chemische oder natürliche Verbindung, die Zellschädigung während der Gefrier- und Auftauereignisse verhindert. In einer Ausführungsform wird Arabinogalactan in dem Medium in Kombination mit DMSO bereitgestellt. Die Konzentration von DMSO kann zum Beispiel von ungefähr 1 bis 10% (Volumenprozent) im Medium reichen. Zusätzliche kryoprotektive Mittel, die zu dem Kryokonservierungsmedium zugegeben werden können, schließen Serum, Wachstumsfaktoren, Glyzerin, Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Heparinsulfat, Chondroitinsulfat, Serumalbumin, Heparin, Polyvinylpyrrolidon, Stärken, Zellulosen, Polyethylenglykol, Propylenglykol und N,N-Dimethylformamid ein. Serumformulierungen, die auf dem Gebiet verfügbar sind, können dem Medium zugegeben werden, wie etwa fötales bovines Serum, zum Beispiel in einer Konzentration zwischen ungefähr 10 und 40% (Volumenprozent) oder bovines neonatales Serum. In einigen Ausführungsformen wird Serum in dem Gefriermedium, das Arabinogalactan enthält, zusammen mit einem zusätzlich permeierenden kryoprotektiven Mittel, wie etwa DMSO, einbezogen. Das Medium kann in leichter Weise für eine individuelle Zellprobe eingestellt werden.
Das Vorhandensein von Arabinogalactan in den Medien, alleine oder in Kombination mit anderen kryoprotektiven Mitteln, reduziert die Zellschädigung aufgrund des Kryokonservierungsprozesses und erhöht die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen. Obwohl auf keine Theorie beschränkt, ist es möglich, daß der Schutzeffekt während des Gefrieren durch Veränderung der Bildung von extrazellulären Eiskristallen und Reduktion von zellulärer osmotischer Dehydratisierung während des Kryokonservierungsprozesses stattfinden kann.

Zell-Gefrierprozeduren

Zellen oder Gewebe können von kommerziellen Lieferanten oder unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren erhalten werden. Das Kryokonservierungsmedium wird einem Zellpellet oder einer Gewebeprobe zugegeben, und das Medium wird gründlich mit den Zellen gemischt oder das Gewebe wird in das Medium eingetaucht, und das Medium, enthaltend das Gewebe oder die Zellprobe wird abgekühlt oder gefroren, zum Beispiel auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff.
In einer beispielhaften Prozedur wird ultra-aufgereinigtes AG, in einer 50% Gewicht/Volumen ("w/v")-Konzentration in einer gepufferten isotonischen Salzlösung hergestellt. Diese Lösung wird dann steril-gefiltert (0,2 um) und entweder direkt als das kryokonservierende Medium verwendet oder zum Beispiel in Kombination mit DMSO (abhängig vom Zelltyp). Die einzufrierenden Zellen werden gezählt, mittels Zentrifugieren konzentriert, in dem gewählten Gefriermedium resuspendiert (z. B. AG oder AG + DMSO; 1 · 10&sup6; - 1 · 10&sup7; Zellen/Gefäß), aliquotisiert in 1,8 ml Kryo-Gefäße (Nung), äquilibiert für ungefähr 30 Minuten bei 4ºC, schrittweise abgekühlt für 18 Stunden bei -80ºC und unmittelbar in flüssigen Stickstoff (-196ºC) übertragen. Es kann bevorzugt sein, die Zellprobe und das Kryokonservierungsmedium abzukühlen, z. B. auf ungefähr 4ºC, bei Verwendung von potentiellen cytotoxischen kryoprotektiven Zusatzstoffen, wie etwa DMSO oder Glyzerin, um osmotischen Streß oder Schädigung an den Zellen zu reduzieren. Wenn kein permeierendes kyroprotektives Mittel im Gefriermedium verwendet wird, ist die Temperatur, bei der das Gefriermedium den Zellen oder Geweben zugegeben wird, kein wesentlicher Faktor. Die Zellen werden durch Rühren des Gefäßes in 37ºC Wasser aufgetaut, bis nur einige wenige Eiskristalle verbleiben, werden dann unmittelbar in ein geeignetes Volumen an Kulturmedium, das für den zu kultivierenden Zelltyp spezifisch ist, verdünnt. Wenn kein permeierendes kryoprotektives Mittel, wie etwa DMSO, verwendet wird, ist eine weitere Behandlung der Probe vor dem Kultivieren nicht erforderlich, da das Gefriermedium, das Arabinogalactan enthält, nicht gegenüber den Zellen toxisch ist. Das Entfernen eines Zell-permeierenden oder Zell-schädigenden kryoprotektiven Mittels, wie etwa DMSO oder Glyzerin, kann durch Verdünnung mit Kulturmedium oder durch Waschen der Zellen zum Beispiel mittels Zentrifugieren implementiert werden.
Zellen, die in entweder AG alleine oder in AG plus DMSO eingefroren werden, weisen wenigstens äquivalente Lebensfähigkeit nach dem Auftauen auf im Vergleich mit einem Standard-Gefriermedium, das DMSO, Kulturmedium und Serum enthält, gemessen mittels eines sechstägigen in-vitro-Wachstumstest. Die Vorteile der Verwendung von Arabinogalactan gegenüber der Verwendung von Serum schließen minimales Pathogenrisiko, weniger Lagerungsprobleme, da das Arabinogalactan nicht gegenüber Zellen toxisch ist, keine Protein- Kontaminationen, die bei Protein-Assays oder -Studien stören können, geringere Kosten, reproduzierbarere Produkte und eine Eignung für eine große Vielfalt an unterschiedlichen Zelltypen ein. Die Verwendung von Arabinogalactan ist ebenso vorteilhaft aufgrund seiner geringen Viskosität und einem geringen Beitrag zur Osmolarität der Lösung. Weiterhin ist Arabinogalactan nicht toxisch gegenüber Zellen, sondern ist hoch kompatibel mit einer großen Vielfalt von unterschiedlichen Zelltypen.

Zelltypen

Jede Zelle aus einem großen Bereich von somatischen Zellen kann kryokonserviert werden in einem Medium, das Arabinogalactan einschließt, wie hierin offenbart. Eine große Vielfalt von Zelltypen, die aus einer Vielfalt von Spezies isoliert werden, kann in dem Medium, das Arabinogalactan einschließt, kryokonserviert werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "somatische Zelle" auf jede beliebige Zelle, die keine Gamete (Spermium oder Oocyte) oder eine totipotente Zelle, wie embryonische Zellen, ist; und der Begriff "Gewebe" bezieht sich auf eine Vielzahl von ähnlichen Zellen, die ihre interzellulären Verbindungen und die in- vivo-Architektur beibehalten haben, einschließlich z. B. Muskelgewebe, Nervengewebe, Bindegewebe und Epithel. Beispielhafte somatische Zellen, die kryokonserviert werden können, schließen zum Beispiel Epithel-, Bindegewebs-, Muskel-, Amniocyten-, Nerven-, Hirn-, Schleimhaut-, Blut-, Knorpel-, Brust-, Nieren-, Leber-, Pankreas-, Knochen-, Hornhaut-, arterielle, Lungen- und Hautzellen ein. Somatische Zellen, die zum Beispiel aus dem Kreislaufsystem stammen, können kryokonserviert werden. Säugerzellen, einschließlich Schweine-, Hund-, menschliche, murine, Pferde- und bovine Zellen, können kryokonserviert werden. In einer anderen Ausführungsform können somatische Vogelzellen, Tumorzellen oder genetisch veränderte Zellen in dem Arabinogalactan-enthaltenden Medium kryokonserviert werden.

Arabinogalactan-Produkte

Arabinogalactan ("AG")-Formulierungen können zum Beispiel in der Form einer sterilen 50%-Lösung eines AG-Sirups bereitgestellt werden, der in einer gepufferten isotonischen Salzlösung in zum Beispiel 50, 100 und 500 ml-Flaschen verdünnt wird. Diese Lösung kann dann entweder direkt für eine Zell-Kryokonservierung verwendet werden oder mit DMSO und/oder dem Zellkulturmedium der Wahl gemischt werden. Vorher zubereitete Konzentrationen von Arabinogalactan, in Kombination mit DMSO und/oder Kulturmedium können bereitgestellt und für unterschiedliche Zelltypen angelegt werden.

Zell-Lebensfähigkeits-Assays

Die Lebensfähigkeit einer Zelle nach Gefrieren und Auftauen, einschließlich der Fähigkeit, eine normale Zellfunktion aufrechtzuerhalten, kann unter Verwendung von auf dem Gebiet verfügbaren Verfahren getestet werden. Die Lebensfähigkeit von Zellen nach dem Gefrieren und Auftauen kann zum Beispiel durch Messen der Zellwachstumsraten, Messen der Stoffwechselfunktionen oder Bestimmen der Fähigkeit von einer Zelle (von Zellen), Vital- Farbstoffe auszuschließen, beurteilt werden.
Ein häufiger Assay, der verwendet wird, um die Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen zu testen, ist der MTT-Assay (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983). Die Grundlage des MTT-Assay ist die Umwandlung von MTT (Tetrazoliumsalz (3-(4,5-Dimethyl-thiazol- 2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in einen unlöslichen blauen Formazan-Kristall mittels mitochondrialer Dehydrogenasen. Die Menge an gebildetem Formazan-Kristall ist direkt proportional zu der Anzahl der stoffwechselaktiven Zellen. Kurz dargestellt, werden die Zellen für eine 4-stündige Periode in einer MTT-Lösung kultiviert (100 ul einer 500 ug/ml-Lösung pro Napf einer 96-Napf-Platte). Nach dieser Inkubation wird das MTT-Medium aspiriert, die Zellen werden mit PBS gespült und die resultierenden Formazan-Kristalle in Propanol oder DMSO aufgelöst. Die 96-Napf-Platten werden dann unter Verwendung eines Mikroplatten- Lesegeräts, das auf eine Extinktion von 580 nm eingestellt ist, abgelesen. Die Zellebensfähigkeit kann entweder als eine prozentuale Angabe der Kontrolle ausgedrückt werden oder kann in absoluten Zellzahlen unter Verwendung einer Standardkurve ausgedrückt werden, die aus seriellen Verdünnungen von Zellen stammt, die in Serum-enthaltendem Medium kultiviert wurden.
Der Vital-Farbstoff-Ausschluß-Assay beruht auf der Fähigkeit von lebenden, intakten Zellen, die gesunde Membranen haben, bestimmte hochmolekulargewichtige Farbstoffe, wie etwa Trypan-Blau auszuschließen. In diesem Assay wird eine Zellprobe mit dem Trypan-Blau- Farbstoff vermischt. Die Zellen können unmittelbar mikroskopisch untersucht werden, um zu bestimmen, welche Zellen den Farbstoff ausgeschlossen haben. Diejenigen Zellen, die den Farbstoff aufgenommen haben und blau in der Farbe erscheinen, werden als tot eingestuft und haben keine intakte Membran. Die Zellen werden unter Verwendung eines Hämocytometers bei einer Vergrößerung von 100 X ausgezählt. Die Gesamtzellzahlen werden gezählt und mit der Anzahl an blauen Zellen verglichen. Die Gesamtzahl an Zellen in fünf Quadraten des Hämocytometers werden gezählt. Diese Anzahl wird durch fünf geteilt, das resultierende Ergebnis mit 10.000 multipliziert, um die Anzahl an Zellen pro ml der ursprünglichen Lösung zu ergeben.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht-beschränkenden Bespiele besser verstanden werden.

Beispiel 1: Isolierung der Zelltypen

Zellen können aus einer Vielzahl von Geweben isoliert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Brust (Epithel, Stromal, Endothel, Macrophagen, Myoepithel), Blutgefäße (Endothel, glatter Muskel), Leber (Hepatocyten, Kupferzellen), Niere (Glomeruli-Zellen), Haut (Fibroblasten), Hirn (Neuronen), Pankreas (Inselzellen), Blut (Immunzellen), Lunge (Epithel, alveolare Macrophagen) oder Speicheldrüsen (Fibroblasten, Epithel). Isolierungsprozeduren sind spezifisch für spezifische Gewebe, beinhalten aber im allgemeinen eine Zerkleinerung des Gewebeisolats, einen Verdau des gehackten Gewebes mit einem Enzym, wie etwa Collagenase, in einem Gewebekulturmedium mit einem ausgeglichenem Salzgehalt (z. B.. DMEM), enthaltend ein Protein, wie etwa bovines Serumalbumin (BSA). Das verdaute Gewebe wird gefiltert, um größere, nicht-verdaute Gewebefragmente zu entfernen, und dann in Gewebekultur-behandelte Platten (z. B. Nalgene, Corning) zum Etablieren von Primärkulturen übertragen.
Zellinien können von der American Tissue Culture Collection (ATCC) erhalten werden. Diese Zellinien werden kultiviert, passagiert und von ATCC gelagert und schließen Zellen aus einer großen Vielzahl von Geweben und Spezies ein. Diese Linien werden von ATCC entweder in einem gefrorenem Zustand oder bereits in Kultur erhalten.
Gewebetypen, wie oben erwähnt, können gesammelt und für kurze Zeitperioden in einem ausgeglichenen Gewebekulturmedium gelagert werden. Die Gewebe müssen in einer kühlen Umgebung (4ºC) gelagert werden, um Stoffwechselabbau zu verhindern. Es ist schwieriger, Gewebefragmente einer höheren Größe zu halten, aufgrund der Unfähigkeit von Zellen, die sich in dem zentralen Teil des Gewebes befinden, die notwendigen Nährstoffe und Sauerstoff zu erhalten. Gewebestücke haben ebenso weniger kontrollierte Gefrier-Auftau-Raten, was zu einer großen Vielfalt an Veränderungen hinsichtlich des chemischen Potentials, das während des Gefrierprozesses zwischen den Zellen erzeugt wird, und zu einer größeren Zellschädigung aufgrund der Dehydratisierung und intrazellulären Eisbildung führt.

Beispiel 2: Zell-Kryokonservierung in einem Arabinogalactan-enthaltenden Medium

Die Lebensfähigkeit von unterschiedlichen Zelltypen nach dem Gefrieren in einem Medium mit und ohne Arabinogalactan wurde untersucht. Ultra-raffiniertes Arabinogalactan ("AG") wurde hergestellt als eine 50% (Gewicht/Volumen) konzentrierte Stammlösung, aufgelöst in einer gepufferten isotonischen Salzlösung. Diese konzentrierte Stammlösung wurde dann entweder direkt als das kryokonservierende Medium verwendet oder wurde in Kombination mit einem Kulturmedium (abhängig vom Zelltyp), DMSO und/oder Serum in den folgenden Verhältnismengen verwendet: Tabelle 1: Kryokonservierungsmedium: Verhältnis der Bestandteile
Die folgenden sieben Zelltypen wurden getestet:
Maus-Mamma-Epithelzellen (NMuMG; ATCC);
Normale Rattennieren-Epithelzellen (NRK; ATCC);
Rattenleber-Epithelzellen (Klon 9; ATCC);
Menschliche dermale Fibroblasten (BUD 8; ATCC);
Bovine Lungenarterien-Endothelzellen (CPAE; ATCC);
Preneoplastische Maus-Mamma-Zellen (-SA, erhalten von Dr. H. Hosick, Washington State University); und
Nerz-Lungen-Fibroblasten (MiCl; ATCC).
Jeder der obigen Zelltypen wurde auf die folgende Weise gefroren.
Konfluente Zellkulturen wurden trypsiniert, und es wurden Konzentrationen von 1.000.000 Zellen in 1,5 ml von jedem der sechs unterschiedlichen Gefriermedien verdünnt. Gefäße wurden auf 4ºC für 30 Minuten abgekühlt und in einen -70ºC-Gefrierschrank für 18 Stunden übertragen. Die Gefäße wurden dann in flüssigen Stickstoff zur Lagerung geworfen.
Der Effekt der unterschiedlichen Gefriermedien auf die Zellebensfähigkeit nach dem Gefrieren wurde bestimmt durch Testen von: (1) Die Zellebensfähigkeit unmittelbar nach dem Auftauen, bestimmt unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluß-Assay; (2) Plattierungseffizienz am Tag 1 (Anzahl der Zellen, die in der Lage sind, einen Tag nach dem Ausplattieren in einem Serum-enthaltenden Standard-Medium sich anzuheften und lebensfähig zu bleiben), bestimmt unter Verwendung des MTT-Assay; (3) Zellzahlen an den Tagen 3 und 6; und (4) Verhältnis der Zellzahlen am Tag 6/Tag 1, um die Gesamtwachstumsraten der Zellen zwischen den Behandlungen zu vergleichen.
Jeder Zelltyp wurde kultiviert, bis ausreichende Anzahlen erreicht wurden, um zwei (2/7) Zelltypen oder drei (5/7 Zelltypen)-Replikate der Kryokonservierung in jedem der sechs unterschiedlichen Gefriermedien zu ermöglichen. Für jede Behandlung wurden pro Replikat 10 Datenpunkte erzeugt. Deshalb wurden entweder 20 oder 30 Datenpunkte für jede Behandlung pro Zelltyp generiert. Die Daten wurden sowohl innerhalb des Zelltyps als auch unter allen Zelltypen analysiert. ANOVA wurde verwendet, um alle Behandlungsgruppen gegen das Standard-Industrie-Gefriermedium zu vergleichen.

Lebensfähigkeit unmittelbar nach dem Auftauen

Für alle getesteten Zelltypen gab es im wesentlichen keinen Unterschied (p > 0,25) bei der Lebensfähigkeit unmittelbar nach dem Auftauen für Zellen, die mit Arabinogalactan mit oder ohne DMSO eingefroren wurden, im Vergleich mit dem Industriestandard (Zellkulturmedium + Serum + DMSO). Es gab eine signifikante Reduktion hinsichtlich der Lebensfähigkeit von Zellen, die in Arabinogalactan und Serum ohne DMSO eingefroren wurden (p = 0,0075).

Ausplattierungseffizienz am Tag 1

Dieser Parameter mißt die Fähigkeit von somatischen Zellen, sich an Kulturplatten anzuheften und nach einem Auftauvorgang lebensfähig zu bleiben. Dies ist eine wichtige zu messende Variable, da Zellen scheinbar intakte Membranen haben können (positive Lebensfähigkeit) unmittelbar nach dem Auftauen, gemessen mittels des Trypan-Blau-Ausschluß-Assay, können sich jedoch nicht normal an Kulturplatten anheften und beginnen, sich zu teilen.
Für sechs der sieben getesteten Zelltypen gab es im wesentlichen keinen Unterschied (p > 0,1) hinsichtlich der Zellzahlen am Tag 1 zwischen den Zellen, die in Arabinogalactan und DMSO eingefroren worden waren, im Vergleich mit dem Industriestandard. Für alle Zelltypen hatten die Zellen, die in einer Kombination von DMSO + Serum + Arabinogalactan eingefroren wurden, übereinstimmend eine hohe Ausplattierungseffizienz am Tag 1.

Zellebensfähigkeit am Tag 6

Dieser Parameter gibt einen Hinweis auf die Wachstumsrate von Zellen über sechs Tage in Kultur in einem Serum-enthaltenden Standardserum. Die Analyse der Daten aus allen Zellen kombiniert (innerhalb der Behandlung) wies im wesentlichen auf keinen Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen hin (p = 0,99).

Verhältnis von Lebensfähigkeit am Tag 6/Lebensfähigkeit am Tag 1

Das Verhältnis der lebensfähigen Zellen am Tag 6/Tag 1 stellt ein gutes Maß für die Wachstumsraten der Zellen über eine sechstägige Wachstumsperiode dar. Die Wachstumsraten der Zellen, die in Arabinogalactan + DMSO eingefroren wurden, waren den Zellen überlegen, die in Standardmedium eingefroren wurden (p = 0,1). Die Zellen, die in Arabinogalactan + Serum ohne DMSO eingefroren wurden, führten zu dem schlechtesten Wachstum über eine sechstägige Periode. Ein erläuterndes Beispiel wird in Tabelle 2 bereitgestellt, das das Verhältnis der Zellzahlen am Tag 6/Tag 1 für CPAE-Zellen zeigt. Tabelle 2: Wachstumsraten: Rangfolge

Resultate mit unterschiedlichen Zelltypen

Arabinogalactan kann verwendet werden, um Serum in einem Standard-Gefriermedium, in einer Formulierung mit DMSO, für alle untersuchten Zelltypen zu ersetzen. AG alleine (Medium 3) wurde verwendet, um einige Zelltypen einzufrieren. Insbesondere war die Zelleistung nach dem Gefrieren entweder besser oder äquivalent in Medium 3 mit einem Standard- Gefriermedium (Medium 1) für 5 der 7 getesteten Zelltypen (-SA, NMuMG, MiCl, BUD-8 und CPAE).

Claims

1. Medium zur Kryokonservierung und Kryoprotektion von somatischen Zellen, umfassend Arabinogalactan als ein kryokonservierendes Mittel, wobei das Medium eine effektive Konzentration von kryokonservierendem Mittel umfaßt, um die Lebensfähigkeit zu erhalten und Zellschädigung und Zelltod von darin aufbewahrten Zellen bei Einfrieren und Auftauen zu verringern.

2. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 1, wobei das Arabinogalactan ultra- raffiniertes Arabinogalactan ist.

3. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 2, wobei die Konzentration von Arabinogalactan in dem Medium die maximal in dem Medium lösliche Konzentration ist.

4. Kryoprotektives Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Konzentration von Arabinogalactan zwischen 5 und 75% (Gewicht/Volumen), bevorzugterweise 5 und 70% (Gewicht/Volumen) beträgt.

5. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 4, wobei die Konzentration von Arabinogalactan in dem Medium zwischen 10 und 70% (Gewicht/Volumen) beträgt.

6. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 5, wobei die Konzentration von Arabinogalactan zwischen 20 und 50% (Gewicht/Volumen) oder 14 und 20% (Gewicht/Volumen) beträgt.

7. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 6, wobei die Konzentration von Arabinogalactan zwischen 44 und 50% (Gewicht/Volumen) beträgt.

8. Kryoprotektives Medium nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Medium Arabinogalactan in einer wäßrigen gepufferten isotonischen Salzlösung umfaßt.

9. Kryoprotektives Medium nach einem der Ansprüche 2 bis 3, wobei das Medium weiterhin eine Zusammensetzung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren, Cytokinen, Lipiden, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Antimycotika, Steroidhormonen, Proteinhormonen und Albuminen, umfaßt.

10. Kryoprotektives Medium nach jedem voranstehenden Anspruch, weiterhin umfassend ein zweites kryoprotektives Mittel.

11. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 10, wobei das zweite kryoprotektive Mittel Dimethylsulfoxid ("DMSO") ist.

12. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 11, wobei das Medium DMSO in einer Konzentration von zwischen 1 und 10% (Volumenprozent) umfaßt.

13. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Medium weiterhin Serum umfaßt.

14. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 13, wobei das Medium fötales Rinderserum in einer Konzentration von zwischen 10 und 40% (Volumenprozent) umfaßt.

15. Kryoprotektives Medium nach jedem voranstehenden Anspruch, weiterhin umfassend somatische Zellen.

16. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 15, wobei die somatischen Zellen Epithel-, Bindegewebs-, Muskel-, Amniocyten-, Nerven-, Hirn-, Schleimhaut-, Blut-, Knorpel-, Brust-, Nieren-, Leber-, Pankreas-, Knochen-, Hornhaut-, arterielle, Lungen-, oder Hautzellen sind.

17. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 15, wobei die somatischen Zellen vom Kreislaufsystem abgeleitet sind.

18. Kryoprotektives Medium nach Anspruch 15, 16 oder 17, wobei die somatischen Zellen Säugerzellen sind.

19. Verfahren zur Kryokonservierung von somatischen Zellen, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Einbringen von somatischen Zellen in ein kryoprotektives Medium gemäß jedem der Ansprüche 1-18, umfassend eine effektive Menge von Arabinogalactan, um die Lebensfähigkeit der Zellen im Anschluß an Einfrieren und Auftauen zu erhalten; und

b) Einfrieren des Mediums, das die Zellen umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, weiter umfassend:

a) Lagern des Mediums; das die Zellen umfaßt; und

b) Auftauen des Mediums; das die Zellen umfaßt; wobei das Medium die Zelllebensfähigkeit während des Einfrierens, des Lagerns und des Auftauens schützt.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei Schritt (b) ein Einfrieren des Mediums, das die Zellen umfaßt, auf eine für die Lagerung der Zellen geeignete Temperatur umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Temperatur 4ºC oder darunter ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Temperatur zwischen -70ºC und -200ºC ist.

24. Verfahren nach jedem der Ansprüche 19 bis 23, wobei die somatischen Zellen Epithel-, Bindegewebs-, Muskel-, Amniocytennerven-, Hirn-, Schleimhaut-, Blut-, Knorpel-, Brust-, Nieren-, Leber-, Pankreas-, Knochen-, Hornhaut-, arterielle, Lungen-, oder Hautzellen sind.

25. Verfahren nach jedem der Ansprüche 19 bis 23, wobei die somatischen Zellen vom Kreislaufsystem abgeleitet sind.

26. Verfahren nach jedem der Ansprüche 19 bis 25, wobei die somatischen Zellen Säugerzellen sind.