CN109843052A - 用于细胞冷冻保存的组合物和方法 - Google Patents

用于细胞冷冻保存的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109843052A
CN109843052A CN201780061611.9A CN201780061611A CN109843052A CN 109843052 A CN109843052 A CN 109843052A CN 201780061611 A CN201780061611 A CN 201780061611A CN 109843052 A CN109843052 A CN 109843052A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
freezen protective
composition
protective composition
biomaterial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780061611.9A
Other languages
English (en)
Inventor
施冰如
江昆琦
林政毅
黃廷宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Quanwei Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Quanwei Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quanwei Biotechnology Co Ltd filed Critical Quanwei Biotechnology Co Ltd
Publication of CN109843052A publication Critical patent/CN109843052A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于细胞冷冻保存的组合物，其包含渗透性冷冻保护剂、糖类和大分子。冷冻保存组合物对细胞和组织具有低毒性，并且在冷冻保存期间促进生物材料的存活和活性保留。

Description

用于细胞冷冻保存的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请62/405,447(2016年10月7日提交)和62/404,170(2016年10月4日提交)的优先权，其全部内容通过引用并入本发明。本申请还涉及2017年10月4日提交的名称为“用于维持细胞存活率的组合物和方法”的国际申请PCT/CN2017/，其全部内容通过引用并入本发明。
技术领域
本发明主要涉及冷冻保存领域。特别地，本发明涉及用于冷冻保存诸如细胞和组织的生物材料的组合物和方法。
背景技术
0℃或0℃以下的冷冻保存技术通常用于长期保存生物材料，例如：动物(包括人类细胞和组织)和植物的细胞和组织。请参阅Thompson等人,Cryopreservation and Thawingof Mammalian Cells,December 2014,eLS,John Wiley&Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0002561.pub2。有效长期储存这些哺乳动物细胞对于可否将这些细胞成功的应用于临床和作为研究工具是至关重要的。举例来说，干细胞可应用于细胞移植、组织工程和再生医学。而冷冻保存的卵母细胞、精子和胚胎则可用于辅助生殖技术。在移植医学中，需要冷冻保存如皮肤、眼角膜、胰岛和心脏瓣膜等活体组织。
已经表明，细胞内冰形成和渗透不平衡可在冷冻过程中损伤细胞。Gao等人，Mechanisms of Cryoinjury in Living Cells,ILAR Journal,2000,41(4):187-196。为了避免这种情况，冷冻保护剂(CPA)被用于在冷冻期间保持细胞和组织的活力。冷冻保护剂被表征为三个主要的化学类别：多元醇(例如二醇、甘油)、酰胺和亚砜。常用的冷冻保护剂包括甘油、二甲基亚砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG)。此外，可以加入一些添加剂，例如大分子和糖，以进一步减少冷冻保存期间对细胞和组织的损害。
在这些冷冻保护剂中，DMSO具有高细胞渗透性，并且是最有效且经常采用的。然而，DMSO具有生理毒性，并且已知当将细胞输注给受体时会引起高血压、恶心和呕吐。此外，在将解冻的细胞培养或输入受体体内后，DMSO的毒性趋于使细胞的存活率和/或功能衰弱。
缓慢冷冻和玻璃化是生物材料冷冻保存的两种传统方法。在缓慢冷冻期间，将细胞冷却至略低于其平衡冰点的温度，并将冰接种在细胞外介质中。当细胞外溶液中形成冰时，外部溶质浓度逐渐增加。结果，细胞脱水，细胞质的熔点降低，并且避免了细胞内冰的形成。玻璃化的定义是样品的粘度达到足够高的值以表现得像固体但没有结晶。参见Principles of Cryopreservation,Methods in Molecular Biology,vol.368:Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols,Second Edition,Humana Press Inc。如果快速冷却，可以在大多数液体中诱导这种玻璃样状态。添加冷冻保护剂可降低所需的高冷却速率。
用于冷冻保存哺乳动物细胞的常规技术通常与减少在临床或研究环境中细胞的潜在使用的缺点相关。因此，需要改进的冷冻保存介质和冷冻保存生物材料的方法。
发明内容
本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含：(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约1M的糖类；和(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子，其中单位％(w/v)和单位M基于保存组合物(例如，冷冻保存组合物)的总体积。
本发明还提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约1M的糖类；(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子；和(4)溶剂(例如水、缓冲液、盐水溶液、培养基如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或其他溶剂)。
本发明还包括保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含：(1)约2％(w/v)至约20％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约0.5M的糖类；和(3)约1％(w/v)至约5％(w/v)的大分子。
本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(1)约2％(w/v)至约20％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约0.5M的糖类；(3)约1％(w/v)至约5％(w/v)的大分子；和(4)溶剂(例如水、缓冲液、盐水溶液、培养基如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或其他溶剂)。
在一些实施方案中，保存组合物(例如，冷冻保存组合物)基本上不含DMSO。
在一些实施方案中，保存组合物(例如，冷冻保存组合物)还包含氨基酸、细胞因子、脂质、生长因子、抗生素、抗真菌剂、类固醇激素、蛋白质激素或其组合。
在一些实施方案中，保存组合物(例如，冷冻保存组合物)还包含生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)。在一些实施方案中，细胞以约105个细胞/ml至约107个细胞/ml的浓度存在于保存组合物(例如，冷冻保存组合物)中。
在一些实施方案中，保存组合物(例如，冷冻保存组合物)处于冷冻保存状态。
本发明提供了用于冷冻保存生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的方法，该方法包括以下步骤：(a)将生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)与冷冻保存组合物接触/混合/组合(例如，以形成混合物或形成组合)；和(b)将冷冻保存组合物和生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的混合物或组合冷冻。
在一些实施方案中，冷冻保存组合物和生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的混合物或组合在以下温度冷冻：约-70℃至约-200℃。
在一些实施方案中，细胞以约105个细胞/ml至约107个细胞/ml的浓度存在于混合物中。
在一些实施方案中，该方法还包括步骤(c)：将冷冻保存组合物和生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的冷冻的混合物或组合解冻。
在一些实施方案中，细胞具有至少70％或至少80％的解冻后存活率。
在一些实施方案中，渗透性冷冻保护剂包含甘油、聚乙二醇或其组合。
在一些实施方案中，糖类包括蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖或其组合。在一些实施方案中，糖类包括蔗糖、海藻糖或其组合。
在一些实施方案中，大分子的分子量为约65千道尔顿(kDa)至约200kDa。在一些实施方案中，大分子包含白蛋白、明胶或其组合。
在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人、猪、犬、马或牛的细胞。在一些实施方案中，细胞包含肿瘤细胞。在一些实施方案中，细胞包含成纤维细胞。在一些实施方案中，细胞包含干细胞。
本发明提供了包含本发明的保存组合物(例如，冷冻保存组合物)的试剂盒。
附图说明
图1显示使用不同的冷冻保存组合物CPA-1至CPA-9后的解冻后细胞存活率(参见实施例1)。DMEM被用作对照。
具体实施方式
本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物，例如冷冻溶液)，其包含渗透性冷冻保护剂、糖类(saccharide)(例如糖(sugar))和大分子。冷冻保存组合物对生物材料(例如，细胞、组织或器官)具有低毒性，并且在冷冻保存过程期间以及在冷冻保存状态中促进生物材料的存活和活性保留。
然后，生物材料可被用于各种研究和临床环境，例如，用于基于细胞的治疗、辅助生殖技术，或用于接受化学疗法或放射疗法的患者。在一个实施方案中，由于本发明的冷冻保存组合物的低毒性，可以在解冻后将具有细胞的组合物施用于受试者。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物基本上不含二甲基亚砜(DMSO)，不包含DMSO，或不含DMSO。在一些实施方案中，本发明的组合物表现出与使用二甲基亚砜(DMSO)相当的优异的冷冻保护作用。在一些实施方案中，与使用DMSO相比，本发明的组合物显示出相等或更好的冷冻保护作用。
本发明的组合物和方法可用于低温保存或冷冻保存，包括冷冻和冻干。
本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含：(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)的一种或多种渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约1M的一种或多种糖类；和(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子(其中单位％(w/v)和单位M基于保存组合物的总体积)。
在一些实施方案中，本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含(或由以下组成，或基本上由以下组成)：(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)一种或多种渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约1M的一种或多种糖类；(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子；和(4)溶剂。在一些实施方案中，溶剂是水、缓冲液、盐水溶液、培养基如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或其他溶剂。
在一些实施方案中，本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含：(1)约2％(w/v)至约20％(w/v)的一种或多种渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约0.5M的一种或多种糖类；和(3)约1％(w/v)至约5％(w/v)的大分子。
在一些实施方案中，本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含(或由以下组成，或基本上由以下组成)：(1)约2％(w/v)至约20％(w/v)一种或多种渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约0.5M的一种或多种糖类；(3)约1％(w/v)至约5％(w/v)的大分子；和(4)溶剂。在一些实施方案中，溶剂是水、缓冲液、盐水溶液、培养基如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或其他溶剂。
在一些实施方案中，渗透性冷冻保护剂包含甘油、聚乙二醇或其组合。
在一些实施方案中，糖类包括蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖或其组合。在一些实施方案中，糖类包括蔗糖、海藻糖或其组合。
在一些实施方案中，大分子的分子量(或平均分子量)为约30千道尔顿(kDa)至约500kDa、约40kDa至约400kDa、约50kDa至约300kDa、约60kDa至约300kDa、约65kDa至约200kDa、约65kDa至约150kDa、约65kDa至约100kDa或者约30kDa至约100kDa。
在一些实施方案中，大分子包含白蛋白、明胶或其组合。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种渗透性冷冻保护剂，其浓度范围为约0.5％(w/v)至约80％(w/v)、约1％(w/v)至约70％(w/v)、约2％(w/v)至约60％(w/v)、约2％(w/v)至约50％(w/v)、约2％(w/v)至约40％(w/v)、约2％(w/v)至约30％(w/v)、约2％(w/v)至约20％(w/v)、约5％(w/v)至约40％(w/v)、约10％(w/v)至约40％(w/v)、约20％(w/v)至约40％(w/v)、约10％(w/v)至约30％(w/v)、约10％(w/v)至约20％(w/v)、约20％(w/v)至约30％(w/v)或者约5％(w/v)至约50％(w/v)(基于保存组合物的总体积)。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种糖类或糖，其浓度范围为约0.05M至约2M、约0.08M至约1.5M、约0.1M至约1.2M、约0.1M至约1.1M、约0.1M至约1M、约0.1M至约0.9M、约0.1M至约0.8M、约0.1M至约0.7M、约0.1M至约0.6M、约0.1M至约0.5M、约0.1M至约0.4M、约0.1M至约0.3M、约0.2M至约1M、约0.3M至约1M、约0.4M至约1M、约0.5M至约1M、约0.6M至约1M、约0.1M至约0.8M、约0.1M至约0.6M、约0.1M至约0.5M、约0.1M至约0.4M或者约0.1M至约0.3M。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种大分子，其浓度范围为约0.5％(w/v)至约20％(w/v)、约0.6％(w/v)至约18％(w/v)、约0.8％(w/v)至约16％(w/v)、约1％(w/v)至约15％(w/v)、约1％(w/v)至约12％(w/v)、约1％(w/v)至约10％(w/v)、约1％(w/v)至约9％(w/v)、约1％(w/v)至约8％(w/v)、约1％(w/v)至约7％(w/v)、约1％(w/v)至约6％(w/v)、约1％(w/v)至约5％(w/v)、约1.2％(w/v)至约8％(w/v)、约1.5％(w/v)至约6％(w/v)、约2％(w/v)至约8％(w/v)、约2％(w/v)至约6％(w/v)、约2％(w/v)至约10％(w/v)或者约5％(w/v)至约10％(w/v)(基于保存组合物的总体积)。
如本发明所用，百分比“％(w/v)”是重量对体积百分比(w以克计，v以毫升计)；百分比“％(v/v)”是体积对体积百分比；百分比“％(w/w)”或“wt％”是重量对重量百分比。
在一些实施方案中，组合物包含约300mg/L至约8,000mg/L、约500mg/L至约7,000mg/L、约1000mg/L至约6000mg/L、约1000mg/L至约4500mg/L、约500mg/L至约2300mg/L、约1,000mg/L、约4,500mg/L、约500mg/L或者约2,300mg/L的葡萄糖。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物(例如，冷冻保存组合物)还包含氨基酸、细胞因子、脂质、生长因子、抗生素、抗真菌剂、类固醇激素、蛋白质激素或其组合。
在一些实施方案中，冷冻保存组合物还包含生物材料(一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)。在一些实施方案中，细胞在冷冻保存组合物中的浓度范围为约104个细胞/ml至约108个细胞/ml、约105个细胞/ml至约107个细胞/ml、约105个细胞/ml至约108个细胞/ml、约104个细胞/ml至约107个细胞/ml、约105个细胞/ml、约106个细胞/ml或者约107个细胞/ml。保存组合物中细胞的浓度可以高于108个细胞/ml或低于104个细胞/ml。在一些实施方案中，保存组合物中细胞的浓度可以根据细胞类型而变化。例如，对于卵母细胞，细胞浓度可以低，例如低至<1个个细胞/ml。对于特定细胞类型，技术人员可以确定浓度。
在一些实施方案中，本发明的组合物不包含生物材料(例如，细胞、组织或器官)。
本发明提供了用于冷冻保存生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)使生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)与冷冻保存组合物接触/混合/组合(例如，形成混合物或形成组合)；和(b)将冷冻保存组合物和生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的混合物或组合冷冻。在一些实施方案中，冷冻保存组合物和生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的混合物或组合在以下温度冷冻：约-70℃至-200℃。
本方法可以进一步包括步骤(c)：将冷冻保存组合物和生物材料(例如，一个或多个细胞、组织、器官和/或病毒颗粒)的冷冻的混合物或组合解冻。在一些实施方案中，细胞具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或者至少约95％的解冻后存活率。
在一些实施方案中，细胞包含肿瘤细胞。在一些实施方案中，细胞包含成纤维细胞。在一些实施方案中，细胞包含干细胞。
在一些实施方案中，细胞包含哺乳动物细胞，包括但不限于人、猪、犬、马或牛的细胞。
本方法可以进一步包括将解冻的生物材料给予受试者(例如，患者)的步骤。参见美国专利公开号20090130756。
本发明提供了用于保存(例如，冷冻保存)生物材料的方法。该方法可包括以下步骤：(a)将本发明的保存组合物与生物材料组合/混合/接触；(b)冷却和/或冷冻混合物；和(c)储存生物材料(例如，在适当的储存条件下)。
可以将生物材料添加到保存组合物中。或者，可以将保存组合物添加到生物材料中。在一些实施方案中，在该方法的步骤(a)中，将生物材料(例如，细胞)悬浮在保存组合物中。
适于冷冻或储存生物材料的温度可以变化。例如，可以将细胞冷冻或储存在约-70℃至约-200℃的温度范围内。在一个实施方案中，细胞可以在液氮的沸点温度或高于液氮的沸点温度，即，在约-196℃或更高温度下冷冻或储存。
在一些实施方案中，保存组合物是低温保存组合物(例如，低温保存溶液)。在一些实施方案中，保存组合物是冷冻保存组合物(例如，冷冻保存溶液)。在这种情况下，溶液可以是例如冷冻溶液(在这种情况下生物材料被冷冻)或冻干溶液(在这种情况下，生物材料被冻干)。
在一些实施方案中，本发明的冷冻保存组合物(具有或不具有生物材料)处于冷冻保存状态(或冷冻状态)，或已经从冷冻保存状态解冻。在一些实施方案中，本发明的冷冻保存组合物(具有或不具有生物材料)处于低温状态或处于冷冻干燥状态。
冷冻保存状态的冷冻保存组合物(也包含生物材料)可以通过慢速冷冻或玻璃化获得。参见美国专利号9,458,424。
本发明的保存组合物可以是液体或固体。在一些实施方案中，本发明的保存组合物是浓缩组合物，例如以干燥形式(例如，粉末、片剂、颗粒或任何其它合适的物理形式)或液体形式，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍等的储液。储液可以通过例如培养基、生理溶液、缓冲液、水等稀释2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍等。通过添加例如培养基、生理溶液、缓冲液、水等(例如，溶解在例如培养基、生理溶液、缓冲液、水等中)，可以将保存组合物的干燥形式转化为液体形式。
在一些实施方案中，本发明讨论的组分的浓度是本发明保存组合物的储液中组分的浓度。在一些实施方案中，本发明讨论的组分的浓度是本发明保存组合物的工作溶液中组分的浓度。
本发明的保存组合物可以是溶液。在一些实施方案中，组合物是本发明讨论的组分(例如，一种或多种渗透性冷冻保护剂、一种或多种糖类和一种或多种大分子)的水溶液。
在一些实施方案中，当制备本发明的组合物时，将本发明讨论的组分(例如，一种或多种渗透性冷冻保护剂、一种或多种糖类和一种或多种大分子)溶解在平衡电解质溶液(例如，盐水溶液、培养基如细胞培养基)中。在一些实施方案中，保存溶液具有适当浓度的电解质(例如钠、钾和/或氯离子)以维持正常的渗透压。用于冷冻保存的合适的盐水溶液是本领域熟知的。在一个实施方案中，盐水溶液是磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)。在一个实施方案中，盐水溶液包含下列中的一种或多种：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸钾、氯化钙和碳酸氢钠。
本发明的保存组合物可包含缓冲系统(例如，生理缓冲液)。本发明的保存组合物可包含平衡盐溶液或任何生理溶液。
缓冲系统的非限制性实例包括磷酸缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、BES、TES、乙酰氨基甘氨酸、甘氨酰胺、甘氨酰甘氨酸、TRICINE、TALP、三乙醇胺、veronal和HEPES。
在一些实施方案中，本发明组合物中缓冲剂的浓度范围为约1mM至约1000mM、约1mM至约200mM、约5mM至约200mM或约5mM至约50mM。
培养基的非限制性实例包括Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、Knockout-DMEM(KO-DMEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)、eagle基本培养基(BME)、DMEM/Ham's F12、Advanced DMEM/Ham's F12、Iscove改良的Dulbecco培养基和最小必需培养基(MEM)、Ham's F-10、Ham's F-12、Medium199、RPMI 1640培养基和其组合和/或其改良物。
在一些实施方案中，本发明组合物在室温或环境温度(例如，在25℃)具有约6.0至约8.5、约6.5至约8、约6.9至约7.5、或约7.2至约7.4的pH。
在一些实施方案中，保存组合物以单位形式包装。在一个实施方案中，冷冻保存组合物以10ml、50ml、100ml、500ml或1L的体积包装。在一些实施方案中，将保存组合物包装为1倍、5倍、10倍或20倍溶液。
本发明的组合物可以通过混合本发明所述的组分以固体形式获得，或通过将组分溶解在水、缓冲液、溶液、培养基等中作为水溶液获得。
定义
术语“保存”是指在其生物活性显著降低但仍然存活的条件下维持生物材料的过程，并且当从保存状态取出时可以恢复基本上正常的生物活性。保存的具体实例是冷冻保存和低温保存。
术语“保存组合物”涉及允许保存生物材料的组合物(或稀释或溶解时的组合物)，使得生物材料保持其活性。保存组合物的具体实施方案是用于在低温保存生物材料的组合物。在一些实施方案中，保存组合物是保存溶液。低温保存组合物和冷冻保存组合物是保存组合物的实例。
术语“冷冻保存”是指一个过程，其包括将生物材料的温度从高于生物材料(或生物材料和保存组合物的混合物)的冷冻温度的温度降低至低于该冷冻温度的温度的至少一个步骤。冷冻保存包括冷冻、玻璃化和冻干。术语“细胞的冷冻保存”是指冷冻和保存细胞，以便在所需的时间段内维持细胞而不进行传代培养(sub-culturing)。
术语“冷冻保存组合物”、“冷冻保存介质”或“冷冻组合物”是指在冷冻保存或冷冻之前将生物材料浸入其中的组合物或介质(或稀释或溶解时的组合物)，或可用于在冷冻前处理细胞或组织的组合物或介质。冷冻保存组合物含有一种或多种冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保存溶液可以是冷冻溶液、玻璃化溶液、冻干溶液和/或这些溶液的混合物。在一些实施方案中，冷冻保存组合物是冷冻保存溶液。在一些实施方案中，冷冻保存组合物是指用于在或低于约8℃、在或低于约4℃、在或低于约0℃、在或低于约-20℃、在或低于约-70℃、在或低于约-135℃、在或低于约-196℃或者在液氮中储存或冷冻生物材料的组合物或介质。
术语“适当的冷冻条件”或“适当的冷冻保存条件”是指将生物材料保持在存活状态的这种冷冻条件。
术语“低温保存”是指在低于生理温度但高于冷冻温度的温度保存，其中生物过程减慢，从而允许长期储存生物材料(例如，低于8℃并高于0℃，或在4℃和8℃之间。
术语“低温保存组合物”是指包含这样的组分的保存组合物，其允许生物材料承受低于8℃的温度和必要的代谢物以在这样的温度维持其活性。
术语“玻璃化”是指将材料转化为不含任何晶体结构的玻璃状无定形固体的过程。在玻璃化转变温度下发生玻璃质固化。
术语“非线性冷却”是指冷冻保存的过程，其中，通过设计，温度对时间的曲线不同于单直线或由具有不同斜率的两个线段制成的曲线。在一个实施方案中，非线性冷却冷冻保存方法通过在该方法的至少一部分期间非恒定的冷却速率实现。在另一个实施方案中，非线性冷冻保存方法通过两步冷却过程实现，其中细胞或组织以恒定或非恒定速率冷却至第一温度，然后以恒定或非恒定速率冷却至第二温度(例如，储存温度)。
“储存温度”是生物材料储存的温度。在一些实施方案中，储存温度在或低于约8℃、在或低于约4℃、在或低于约0℃、在或低于约-20℃、在或低于约-60℃、在或低于约-70℃、在或低于约-135℃、在或低于约-196℃或者在液氮中。
应将术语“基本上不含”试剂理解为不含试剂，或在保存组合物中存在的任何药剂的量都是如此之低，以致于在将生物材料从保存条件中取出后，对保存过程、对保存过程的结果、或对生物材料的性质(例如，活体物质如细胞的存活率，如果这些物质包括在这种材料中)没有任何影响。在一些实施方案中，术语“基本上不含”试剂意指试剂少于约5％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约4％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约3％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约2％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约1％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约0.5％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约0.2％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约0.1％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约0.05％w/w(或者％w/v或者％v/v)、少于约0.02％w/w(或者％w/v或者％v/v)或者少于约0.01％w/w(或者％w/v或者％v/v)。
关于数值的术语“约”是指所述数值的±10％。换句话说，数值可以在所述值的90％到所述值的110％的范围内。
冷冻保护剂
术语“冷冻保护剂”或“抗冻剂”在本发明中是指用于减缓或防止冰成核、冰晶生长、冰形成或其任何组合的化合物。冷冻保护剂有助于在冷冻保存下保持生物材料的存活率，并防止在冷冻保存中可能造成对生物材料的损害。
冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。
渗透性冷冻保护剂是可以穿透细胞膜并存在于细胞内的冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂的非限制性实例包括甘油、聚乙二醇、乙二醇、丙二醇(1,2-丙二醇、丙-1,2-二醇)和DMSO。
非渗透性冷冻保护剂是冷冻保护剂，其不穿透细胞膜并保留在细胞外溶液中。非渗透性冷冻保护剂的非限制性实例包括高分子量分子，例如糖类(例如蔗糖、海藻糖、麦芽糖)、糖、淀粉(例如羟乙基淀粉)、蛋白质(例如白蛋白如血清白蛋白)、percoll、ficol、聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、血清、血浆和其他大分子。在一些实施方案中，本发明的组合物包含非渗透性冷冻保护剂，其分子量大于或等于约342道尔顿(其为蔗糖的分子量)。
冷冻保护剂的非限制性实例还包括甲氧基化化合物，乙醇，2-甲氧基乙醇，1,2-二甲氧基乙烷，1-甲氧基-2-丙醇和甘油衍生物，例如3-甲氧基-1,2-丙二醇或1,3-二甲氧基-2-丙醇。在一些实施方案中，本发明的组合物包含或不含一种或多种甲氧基化化合物作为冷冻保护剂。在一些实施方案中，本发明的组合物包含或基本上不含一种或多种二醇作为冷冻保护剂。
本发明的组合物可包含一种或多种渗透性冷冻保护剂、一种或多种非渗透性冷冻保护剂、或一种或多种渗透性冷冻保护剂和一种或多种非渗透性冷冻保护剂的组合。
糖类
糖类包括低聚糖，例如单糖和二糖、多糖等。糖类包括糖。
糖类的非限制性实例包括：蔗糖、山梨醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、棉子糖、水苏糖、葡聚糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、木糖醇、肌醇、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖醇、麦芽糖醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糖原、直链淀粉、支链淀粉、菊粉、海藻酸钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶、葡萄糖胺、半乳糖胺及其组合。请参阅美国专利号6,673,607和7,094,601。
白蛋白
白蛋白的非限制性实例包括血清白蛋白(例如：人血清白蛋白或HSA)、血浆白蛋白(例如：人血浆白蛋白)、牛血清白蛋白和/或合成血清白蛋白、卵白蛋白、植物白蛋白或上述的组合。白蛋白的非限制性实例还包括胎牛血清。
白蛋白可以是天然来源的(例如，从天然来源纯化)或重组来源的(重组白蛋白)。在一个实施方案中，通过从人源的生物材料中纯化产生白蛋白。其可通过用于分级来自血液的血浆的常规技术(Cohn等人,J.Am.Chem.Soc.68(1946)459pp)或者通过根据J.Liautaud等人描述的技术(13th International IABS Conference,Budapest；A:"Purificationof proteins.Development of biological standard",Karger(ed.),Bale,27(1973)107pp)从人胎盘提取得到。在一个实施方案中，重组白蛋白在真核宿主中产生。
在一个实施方案中，术语“白蛋白”包括由该蛋白质的多态性产生的任何人白蛋白的天然变体。
明胶
在一些实施方案中，本发明保存组合物中的明胶的分子量(或重均分子量，或平均分子量)为约15千道尔顿(kD)至约40kD、约25kD至约40kD、约25kD至约50kD、约25kD至约45kD、约40kD至约50kD、约10kD至约100kD、约40kD至约100kD、约50kD道尔顿至约100kD、约100kD至约200kD、约100kD至约250kD、约80kD至约200kD、约150kD至约200kD、约100kD至约150kD或者约50kD至约200kD。
在一些实施方案中，明胶的等电点(pI)为约4.5至约9、约5至约9、约5至约7、约6至约7、约5至约6、约7至约9或者约4.7至约5.2。
在一些实施方案中，明胶来自于哺乳动物组织。在一些实施方案中，明胶来自于动物胶原。在一些实施方案中，明胶来自于动物如牛、鸡、猪和鱼的皮肤、骨骼、结缔组织、肌腱、韧带等的原材料，但不局限于此。在一个实施方案中，明胶来自于牛、猪或其组合。在一些实施方案中，明胶来自于牛骨、猪皮、牛的皮肤、猪肉、牛皮和/或鱼皮。在一个实施方案中，明胶是皮肤衍生的明胶和/或骨衍生的明胶。
在一些实施方案中，明胶是通过胶原的部分水解产生的肽和蛋白质的混合物。在一些实施方案中，明胶是胶原的水解形式。在一些实施方案中，明胶是变性胶原的形式。
在一些实施方案中，明胶可以是A型明胶或B型明胶。如本发明所用，A型明胶是由酸处理的原料得到的明胶；B型明胶是由碱处理的原料得到的明胶。
在一些实施方案中，为了生产明胶，通过化学水解和/或热水解进行胶原水解。在一个实施方案中，将胶原煮沸(例如，在水中)或加热(广泛地)以产生明胶。
在一些实施方案中，为了生产明胶，通过酸水解、碱水解和/或酶水解进行胶原水解。
在一些实施方案中，明胶的制造过程包含三个主要阶段：预处理、主要提取步骤、以及精炼和回收处理。预处理是将原料准备好以供主要提取步骤使用，并去除可对最终明胶产品的生理化学性质具有负面影响的杂质。主要提取步骤可用热水或稀酸溶液作多阶提取而将胶原水解成明胶。精炼和回收处理则包括：过滤、澄清、蒸发、灭菌、干燥、车辙(rutting)、研磨和/或筛分以从明胶溶液中除去水、混合所提取的明胶和/或获得干燥、混合和研磨的最终产品。
其他组分
在一些实施方案中，本发明的组合物可进一步包含氨基酸、细胞因子、脂质、生长因子、抗生素(例如青霉素、链霉素等)、抗真菌剂、类固醇激素、蛋白质激素、血清、蛋白质、盐、甲酰胺、甲氧基化化合物和/或聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇)。
氨基酸
本发明的保存组合物可以包含或不包含一种或多种氨基酸。
氨基酸包括旋光异构体，即D-异构体和L-异构体。氨基酸包括α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸和非天然氨基酸。氨基酸的非限制性实例包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及其组合。(请参阅Cryobiology,41(4):257-279(2000))
氨基酸衍生物也可用于本发明的组合物和方法中。氨基酸衍生物的非限制性实例包括：氨基酸盐类和氨基酸溶剂化物。氨基酸盐的非限制性实例包括：碱金属盐类或碱土金属盐类，例如：钠盐、钾盐和钙盐；氢卤酸盐类，例如：氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐类，例如：硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；和有机酸盐类，例如：富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、马来酸盐、乙酸盐、乳酸盐和抗坏血酸盐。氨基酸溶剂化物的非限制性实例包括水合物、醇化物(例如，甲醇化物、乙醇化物)和醚合物(例如，乙醚合物)。
在一些实施方案中，本发明组合物中的氨基酸浓度为0.01-10.0重量％，或0.1-1.0重量％。
DMSO
在一些实施方案中，本发明的保存组合物基本上不含二甲基亚砜(DMSO)，不包含DMSO，或无DMSO。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物包含DMSO。在各种实施方案中，DMSO的浓度少于或等于约4％(v/v)、少于或等于约3％(v/v)、少于或等于约2％(v/v)、少于或等于约1％(v/v)、少于或等于约0.5％(v/v)、少于或等于约0.1％(v/v)、少于或等于约0.05％(v/v)、少于或等于约0.02％(v/v)或者少于或等于约0.01％(v/v)。
维生素
在另一个实施方案中，保存组合物还包含一种或多种维生素。维生素的非限制性实例包括D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素和核黄素。
盐类
在一些实施方案中，本发明的组合物还包含一种或多种盐类，其包括无机盐和/或有机盐。无机盐的非限制性实例包括：氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠和磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、氯化钙、氯化镁、碳酸氢钾、单磷酸钾及其组合。
在一些实施方案中，该组合物不包含血清。在一些实施方案中，组合物不包含任何直接人或动物来源的原料，或使用人或动物来源的材料生产的材料。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含多个纳米颗粒、微粒、纳米管或其组合。示例性纳米颗粒、微粒或纳米管包括碳或贵金属(例如，金、银、钛、钯、铂和铜)纳米颗粒、微粒或纳米管。参见Choi等人,Applied Physics Letter 79:2252-2254,2001；Eastman等人,Applied Physics Letter 78:718-720,2001。
本发明的保存组合物可包含其他任选组分，包括但不限于肽、其他蛋白质、糖醇、氨基糖、糖蛋白和醇、pH控制剂、保湿剂、防腐剂、粘度控制剂或其组合。参见美国专利号9,055,739。
冷冻保存
本发明提供了用于冷冻保存生物材料的冷冻保存组合物和方法。
本发明方法包括使生物材料(例如，细胞、组织、器官、病毒颗粒)与冷冻保存组合物接触/组合。在一些实施方案中，该接触/组合/混合步骤包括将冷冻保存组合物加入细胞中，并将细胞与冷冻保存组合物混合。本发明方法的该步骤(例如，步骤(a))可以导致获得在介质中悬浮的细胞的混合物(例如，液体混合物)。
本发明提供了一种冷冻保存细胞的方法，其包括将细胞置于冷冻保存组合物中，并将冷冻保存组合物中的细胞冷冻保存的步骤。
在一些实施方案中，当处理细胞用于冷冻保存时，在将细胞悬浮在液体状态的冷冻保存组合物中后，通过将其保持在冷冻保存的条件下冷冻所得的悬浮液。当需要细胞时，将细胞和冷冻保存组合物的冷冻的混合物进行解冻过程，之后可以回收细胞。
在一些实施方案中，为了从基质上分离贴壁或半贴壁细胞(例如，以形成细胞悬浮液)，用酶(例如蛋白酶(例如胰蛋白酶))处理细胞。在一些实施方案中，通过机械刮擦由基质中松散的细胞，将细胞从培养基质(例如，细胞培养皿、烧瓶等)上分离。在一些实施方案中，为了从基质上分离贴壁或半贴壁细胞(例如，以形成细胞悬浮液)，用化学品(例如，去污剂)处理细胞。在一些实施方案中，在化学或酶处理的情况下，然后将细胞离心并洗涤以除去酶或去污剂。
可以根据许多方法将细胞和冷冻保存组合物物理组合。在一些实施方案中，细胞在与冷冻保存组合物组合之前存在于细胞悬浮液中。在一个实施方案中，将细胞与冷冻保存组合物组合的步骤包括在细胞悬浮液中提供用于冷冻保存的细胞，并将冷冻保存组合物加入细胞悬浮液中(混合或不混合)。在一个实施方案中，将细胞与冷冻保存组合物组合的步骤包括在细胞悬浮液中提供用于冷冻保存的细胞，并将细胞悬浮液加入冷冻保存组合物中(混合或不混合)。
在一些实施方案中，冷冻保存介质可以以逐渐增加浓度的逐步增量添加到生物材料(例如，细胞、组织、器官、病毒颗粒)中。
在一些实施方案中，在冷冻保存之前，改良细胞培养基以包括冷冻保存所需的所有组分，然后从培养基质(例如细胞培养皿、烧瓶等)中除去细胞。
在一些实施方案中，当与生物材料混合/组合时或之前，冷冻保存组合物的温度范围为约4℃至约45℃、约10℃至约40℃、约15℃至约40℃、约20℃至约40℃、约30℃至约40℃、约33℃至约38℃或者约37℃。
在一些实施方案中，在冷冻混合物之前平衡细胞和冷冻保存介质的混合物。例如，将混合物平衡约10秒至约1小时、约20秒至约50分钟、约20秒至约40分钟、约30秒至约30分钟、约30秒至约20分钟、约30秒至约10分钟、约30秒至约5分钟、约30秒至约2分钟、约30秒至约1分钟、约1分钟至约40分钟、约5分钟至约30分钟或者约5分钟至约10分钟。
在一些实施方案中，在冷冻混合物之前，将细胞和冷冻保存介质的混合物在约4℃至约45℃、约10℃至约40℃、约15℃至约40℃、约20℃至约40℃、约30℃至约40℃、约33℃至约38℃或者约37℃平衡。
在进一步的步骤中，本发明的方法有利于冷冻生物材料和冷冻保存组合物的混合物。在一个实施方案中，将包含生物材料的混合物转移至冷冻容器中，然后将其转移至零下温度。合适的容器包括但不限于Mr.冷冻容器(Thermo Scientific)。当放置在冷冻机中时，这种容器可以帮助提供固定的冷却速率。
在一些实施方案中，本发明方法包括将生物材料(例如，细胞、组织、器官、病毒颗粒)与本发明的保存组合物组合、并使组合的生物材料和本发明的保存组合物经受冷冻保存条件的步骤。如本发明所用，“冷冻保存条件”是指本领域中通常认为对于冷冻保存细胞有用的任何一组条件。在一个实施方案中，冷冻保存条件可以指提供冷冻保存温度或足够低于0℃的温度的环境，以减缓或停止细胞内的生物活性，包括但不限于细胞内的将导致细胞死亡的生化反应。在具体的实施方案中，冷冻保存温度包括以下温度：在或低于约0℃、在或低于约-20℃、在或低于约-50℃、在或低于约-60℃、在或低于约-70℃、在或低于约-80℃、在或低于约-90℃、在或低于约-100℃、在或低于约-110℃、在或低于约-120℃、在或低于约-135℃、在或低于约-196℃的温度或者在液氮中。
如本发明所用，术语“冷冻保存状态”是指处于冷冻保存温度的状态。
根据本发明的冷冻干燥和冷冻保存可以以适合于生物材料的任何方法进行。本发明的上述方法的冷冻可以在本领域已知的任何方法或装置中完成。
在一些实施方案中，本发明方法包括慢速冷冻生物材料。在一个实施方案中，对于慢速冷冻，首先将生物材料以受控速率冷却至低于-50℃、低于-70℃或-70℃至-100℃的温度；任选地随后进一步冷却生物材料，例如通过将生物材料转移至液氮(N2)。在一些实施方案中，受控速率是约-0.1℃/min至约-10℃/min、约-0.2℃/min至约-5℃/min、或约1℃/分钟的冷却速率。
在一些实施方案中，将具有含有生物材料的冷冻保存组合物的冷冻容器置于-70℃和-100℃之间的温度，或-80℃的温度一段时间(例如，过夜)。此后，可以将容器转移至约-196℃的液氮(N2)。
在一些实施方案中，将具有含有生物材料的冷冻保存组合物的冷冻容器置于-70℃和-100℃之间的温度，或-80℃的温度一段时间(例如，过夜)。此后，可以将容器转移至约-196℃的液氮(N2)。
在一些实施方案中，本发明方法包括生物材料的玻璃化。在一些实施方案中，冷冻保存组合物中的生物材料然后以约30,000-约100,000,000℃/分钟、等于或大于约50,000℃/分钟、等于或大于约100,000℃/分钟、等于或大于约200,000℃/分钟、等于或大于约350,000℃/分钟或者等于或大于约1,000,000℃/分钟的速率冷却。
在一些实施方案中，冷冻保存组合物中的生物材料暴露于小于或等于-80℃(例如，干冰)、小于或等于-100℃、-196℃(例如，液氮)或-205℃(例如，作为液氮和固氮的混合物的淤浆氮)的温度。
在一些实施方案中，可以在冷冻保存或复苏过程中提供连续温度控制。参见美国专利号9,485,984。
在一个实施方案中，本发明方法包括冷冻保存细胞的阶梯式方法，其包括将细胞冷却至第一温度，在第一温度保持第一时间段，然后将细胞冷却至第二温度以储存细胞。
在一个实施方案中，将生物材料(例如，细胞、病毒颗粒等)悬浮在冷冻保存组合物中，将由此制备的悬浮液分配到冷冻管(例如，冷冻管、冷冻瓶等)中，并且将得到的管直接置于超低温冷冻机(例如，-80℃)中以冷冻生物材料。在一个实施方案中，将冷冻保存组合物中的生物材料直接在-80℃的冷冻机中冷冻。
在一些实施方案中，冷冻步骤和/或解冻步骤的参数被优化，使得温度上升和/或下降速率不会破坏生物材料的完整性，并且不会不利地影响解冻后生物材料的存活率或功能。
在一些实施方案中，冷冻保存组合物中的生物材料在具有选定的温度降低速率的温度下降阶段中冷却。在一些实施方案中，温度下降阶段中的温度降低速率为约10℃/分钟、约1℃/分钟、约2℃/分钟、约5℃/分钟、约7℃/分钟、约12℃/分钟、约15℃/分钟、约17℃/分钟、约20℃/分钟或速率在上述值范围内。在一些实施方案中，温度下降阶段可包括以约10℃/10秒、10℃/20秒、10℃/30秒、10℃/40秒、10℃/50秒、10℃/60秒、10℃/70秒、10℃/80秒、10℃/90秒、10℃/100秒、10℃/110秒、10℃/120秒、10℃/130秒、10℃/140秒、10℃/150秒、10℃/160秒、10℃/170秒、10℃/180秒、1℃/190秒或者10℃/200秒的速率冷却生物材料。
在一些实施方案中，温度下降阶段可包括快速冷冻(例如，最大温度降低)步骤。
在一些实施方案中，本发明方法的冷冻步骤包括非线性冷却。非线性冷却的冷冻保存方案可以使用大容量冷冻单元(bulk freezing unit)或冷冻显微镜装置或其他合适的装置来执行，包括具有可编程热循环仪的装置，其可以被编程为根据预定的冷却曲线冷却细胞。
在一个实施方案中，本发明方法的冷冻步骤包括将生物材料冷却至第一温度持续第一段时间，然后将细胞冷却至第二温度以储存细胞。在一个实施方案中，将细胞冷却至约-3℃和-30℃之间的温度，在该温度保持1至30分钟，然后冷却至低于-60℃的温度以储存细胞。参见美国专利号9,078,429。
在一个实施方案中，该方法包括将细胞置于冷冻保存组合物中并使组合物达到4℃的起始温度。一旦包含细胞的组合物达到起始温度，将它们在该温度保持约15分钟。然后将细胞以约-1℃/min的速率冷却，直至细胞组合物达到约-3℃的温度。
在一个实施方案中，该方法包括将细胞置于冷冻保存组合物中并使组合物达到4℃的起始温度。然后将细胞以1℃/min的速率在4℃和-45℃之间冷却。然后，一旦组合物处于约-45℃的温度，组合物被进一步冷却直至细胞组合物达到约-120℃的储存温度。
在一个实施方案中，将冷冻保存中的细胞悬浮液分配到冷冻管或冷冻瓶等中，然后将其置于冷冻容器中。将冷冻容器转移至4℃约1小时，然后置于约-80℃的室中至少12小时，或至少24小时。然后将冷冻管储存在液氮中。
在一些实施方案中，生物材料任选地经受中间储存温度达所需的一段时间。中间储存温度可以为约0℃至约-100℃，约-50℃至约-60℃，约-60℃至约-70℃，约-70℃至约-80℃，约-80℃至约-90℃，约-90℃至约-100℃及其重叠范围。
在一些实施方案中，生物材料在转移至较长期储存之前在中间储存温度储存一段时间。例如，细胞可以在转移到液氮中长期储存之前保持在中间储存温度过夜或达任何其它合适的时间段。在其他实施方案中可以使用其他温度(例如，在-20℃，-30℃，-40℃，-50℃，-60℃等储存)。在若干实施方案中，使用具有多个(2、3、4、5或更多)中间储存温度的多步“逐步降低”过程。
冷冻保存组合物中生物材料的冷冻可以使用程序化的冷冻机完成。冷冻保存组合物中生物材料的冷冻可以在不使用程序化冷冻机的情况下完成。
冷冻可以是定向冷冻、静止冷冻等。
冷冻方法的非限制性实例包括使用定向冷冻装置、使用机械冷冻机、使用逐步冷冻装置、快速冷冻(slush freezing)、在低温流体中冷冻、在控制速率的冷冻机中冷冻、使用液体浴冷冻机、使用冷空气冷冻机等。参见美国专利号5,827,741和6,723,497。
可以使用能够提供延长的零下温度以维持冷冻保存状态的任何冷冻设备。冷冻和储存可以在同一装置中进行，或者可以在将冷冻的样品转移到长期储存装置之前使用第一冷冻装置。在一个实施方案中，使用液氮储存容器。在一些实施方案中，使用涉及更复杂的冷却装置的被动冷冻方法，例如可编程的速率控制的刨冰柜(Planer freezers)(刨床产品(Planer Products))。参见美国专利号8,512,941。
冷冻保存组合物中的生物材料可以冷冻保存状态储存任何时间长度直至需要它们。当细胞处于储存温度时，它们可以储存所需的时间，例如约1-5小时、约5-12小时、约12-24小时、约24-48小时、约48小时、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年或更长。参见美国专利公开号20170202212。
解冻
用于保存生物材料的适当储存条件可包括维持生物材料存活的任何此类条件。此类条件可包括在或低于约0℃、在或低于约-20℃、在或低于约-50℃、在或低于约-60℃、在或低于约-70℃、在或低于约-80℃、在或低于约-90℃、在或低于约-100℃、在或低于约-110℃、在或低于约-120℃、在或低于约-135℃、在或低于约-196℃的冷冻保存温度或者在液氮中。对于低温保存，温度可以在0至8℃之间。在冷冻干燥样品的情况下，温度可以是0℃以上(例如：室温、环境温度等)或0℃以下的任何温度，只要材料远离湿气即可。
生物材料可以在保存状态(例如，冷冻保存状态)保持数天、数周、数月或数年，直到需要生物材料。当需要时，回收冷冻保存的生物材料并解冻。
在一些实施方案中，本发明方法还包括将冷冻的组合物解冻的步骤，更具体地是在维持细胞存活率的条件下。
在一些实施方案中，冷冻保存组合物中的生物材料在约42℃或低于约42℃、约10℃至约40℃、约20℃至约37℃、室温或者约37℃在水浴中(例如：将冷冻管或冷冻瓶放置在水浴中)解冻。
在一个实施方案中，冷冻保存组合物中的生物材料在约37℃的水浴中解冻。任选地，然后将其移至较低温度，例如4℃或冰上。
在一些实施方案中，使用“渐进(step up)”解冻过程，其具有渐进加热速率(或升温增快速率)。例如，可以将冷冻瓶置于温度升高的顺序存储环境中，然后转移到体温附近的温度，例如温度约为37℃的水浴，或任何其他合适的温度。
在一些实施方案中，解冻冷冻保存组合物中的冷冻保存的生物材料的升温速率为约5℃/min至约80℃/min、约10℃/min至约70℃/min、约10℃/min至约60℃/min、约10℃/min至约50℃/min、约10℃/min至约40℃/min、约10℃/min至约30℃/min、约10℃/min至约20℃/min、约20℃/min至约40℃/min、大于约20℃/min、大于约25℃/min、大于约30℃/min、大于约35℃/min、大于约40℃/min或者约30℃/min。
在一些实施方案中，在解冻后，将生物材料洗涤、悬浮在合适的介质中并根据需要进行处理以用于研究或临床应用。
在一些实施方案中，在解冻后，将细胞转移至培养皿中用于再培养。细胞可在研究或临床应用前在适当条件下培养约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约86小时、约110小时、约1周、约2周或超过3周。参见美国专利公开号20170196221。
在一些实施方案中，在解冻后立即再培养复苏的贴壁细胞或半贴壁细胞。因此，复苏的细胞被提供恢复时间以克服例如在冷冻保存之前从培养物中移除期间造成的损伤。
在一些实施方案中，在解冻后，生物材料在体内使用而没有介入的培养步骤。
在一些实施方案中，在解冻后，可以将细胞重新悬浮在适合于预期用途的流体或其他介质中。例如，细胞可以重悬于任何渗透支持的溶液中。在一些实施方案中，细胞可以重悬于生理上相容的缓冲液中，例如本发明所述的缓冲液。优选地，提供用于体内方便递送的组合物的任何生理学相容性材料可用于重悬细胞。
冷冻保存细胞的存活率
本发明的组合物和方法可以允许细胞的保存(例如，冷冻保存)，其中细胞在恢复后保持良好的存活率。可以使用许多不同的方法停止保存，可以选择这些方法以适应保存方法和生物材料的性质，包括提高生物材料的温度，冻干的生物材料的水合和/或溶质的去除。
如本发明所用，术语“存活率”是指活的生物材料(例如细胞，例如，基于DNA和/或完整细胞膜系统的存在，或活病毒)的百分比。在一些实施方案中，活的生物材料是指包含一些活细胞或细胞部分的生物材料，所述细胞具有代谢活性或在从保存状态释放后将变得具有代谢活性。
在一些实施方案中，冷冻后生物材料(例如，细胞或病毒)的存活率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或者至少约95％。
在一些实施方案中，本发明组合物和方法确保冷冻后有限量的或最小程度的细胞坏死和凋亡。在一些实施方案中，观察到小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％或小于约1％的细胞坏死和/或凋亡。
可以通过本领域已知的任何方法测量存活率。在一些实施方案中，存活率使用锥虫蓝内摄试验或通过测量碘化丙锭摄取来测量。在一些实施方案中，存活率通过测定细胞有效附着的能力(例如，附着测定)来测量。在一些实施方案中，增殖测定可用于确定附着的细胞在冷冻保存后是否可如预期的那样增殖。可以将附着和增殖效率与未经历冷冻保存的对照细胞进行比较。
本领域已知有各种测试来确定细胞的存活率和功能。在一些实施方案中，这些测试取决于细胞类型和细胞的所需用途。
对于干细胞或祖细胞，本发明所述的方法可进一步确保细胞保持其多能性。这可以通过确定谱系特异性标志物的表达来确定。例如，间质干细胞的功能表征可以包括使用市售的分化试剂盒和RT-PCR在体外诱导脂肪形成、成骨和软骨形成分化以检测mRNA的谱系特异性表达，指示脂肪形成，成骨和软骨形成分化潜力。类似地，可以通过分离mRNA和测试细胞特异性标记来测试未分化干细胞的质量。在特定的实施方案中，保持分化成指定谱系的细胞的能力，即，与未处理的细胞没有显著差异。胚胎干(ES)细胞的多能性可以使用本领域已知的方法测试，包括例如Oct4-GFP表达、升高的碱性磷酸酶表达和SSEA-1表面糖蛋白表达。可以应用几种体外方法来评估实验处理后的干细胞恢复。这些评估可包括但不限于膜完整性，代谢和其他功能测定和/或培养中的菌落生长，以及荧光测定，例如SYTO/EB。在一些实施方案中，可以使用分化测试、免疫表型表征和/或形态学检查来测定干细胞和/或祖细胞。
对于受精卵的冷冻保存，可以在冷冻保存后确定卵裂率并与对照组比较以确定在冷冻保存过程中是否存在任何细胞损伤。卵母细胞的存活率可以通过检查冷冻保存后细胞的形态特征来确定。形态上存活的卵母细胞表现出完整的透明带和质膜和折射细胞质，而当在光学显微镜下观察时，未存活的卵母细胞看起来变性。卵母细胞存活和功能的最终标准是它们在体外和体内受健康精子受精的能力，然后是卵裂、胚泡和/或孵化或胎儿发育。参阅美国专利号9,538,745。
在一些实施方案中，本发明的保存组合物和方法以及使用本发明的冷冻保存组合物和方法从保存恢复的生物材料可用于研究和/或临床应用(例如，基于细胞的疗法、移植、再生医学、诊断和基因测试、用于监视的细胞/组织库、毒性试验和体外受精)。
生物材料
术语“生物材料”表示细胞、细胞聚集体、组织、器官、生物流体、病毒颗粒和任何其他膜实体，例如脂质体(天然或合成的)。
使用本发明的组合物和方法可以保存任何类型的细胞或组织。
在一些实施方案中，细胞是指哺乳动物细胞，包括人的细胞、鼠的细胞、猪的细胞、犬的细胞、马的细胞和牛的细胞，但不局限于此。细胞可来自濒危或受威胁物种的哺乳动物。细胞可来自人类或非人类哺乳动物，例如：猕猴家族(Cercopithecoidea family)、类人超家族(Hominoidea superfamily)、犬属家族(Canisfamiliaris)、猫属家族(Feliscatus)、仓鼠科(Cricetidae spp.)、马属(Equus spp.)(例如，家马(Equuscaballus)、Equus assinus)、马科家族(Equidae family)、欧洲牛、瘤牛、牛科家族(Bovidae family)、骆驼科家族(Camelidae family)、印度水牛、山羊(Capraaegagrushircus)、鹿科家族(Cervidae family)、鹿亚科家族(Cervinae family)、绵羊、大角羊(Ovis canadensis)、家山羊(Caprahircus)、家猪(Sus Scrofadomestica)、金仓鼠属(Mesocricetus spp.)、鼬属、豚鼠、长爪沙鼠、毛丝鼠属、褐家鼠、屋顶鼠、小家鼠、兔科家族(Leporidae family)、穴兔、水羚羊属、鸡属、火鸡(Meleagriagallopavo)、鸭科、林鼬、家鸽、野鸽、吐绶鸡、鸭嘴兽、冠孔雀、野牛、驼鸟属、美洲驼(Lama glama)、美洲鸵属、鸸鹋属、羊驼(Lama pacos)、驯鹿(Rangifer tarandus)、牦牛(Bos grunniens)、双峰驼(Camelusbactrianus)、单峰驼(Camelus dromedarius)以及任何濒危或受威胁的物种。
本发明组合物和方法可用于保存微生物、细菌、非哺乳动物细胞(例如：昆虫细胞、禽类细胞、鱼类细胞等)或植物细胞。
细胞的非限制性实例包括干细胞、祖细胞、胚胎、精子、卵母细胞、配子母细胞和受精卵。
细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。在一个实施方案中，细胞是成纤维细胞。
生物材料可以包括以下任何一种：成纤维细胞、干细胞、祖细胞、全血或其部分、红细胞、白细胞、脐带血或其部分、脐带血细胞、骨髓、卵母细胞、精子、卵子、胚胎、软骨、卵巢、心脏、皮肤、肾脏、肝脏、肺脏，但不局限于此。另外，所述生物材料可以包含细胞生物体，其可以是真核生物或原核生物，其包括：细菌和酵母等。另外，生物材料还可以包含能够存活于冷冻保存的所有多细胞生物，例如：线虫。血液部分可以包括血液的任何部分，其包括血细胞(白细胞和/或红细胞)、血浆和/或溶质和/或亚细胞组分(例如：细胞的部分，例如：血小板、降解细胞的组分等)、蛋白质、脂质、抗体等。
本发明的组合物和方法可用于保存任何类型的细胞，包括但不限于衍生自组织和器官的细胞物质，包括但不限于胰岛细胞、软骨细胞、神经源细胞、肝源细胞、眼源细胞、整形外科源细胞、结缔组织细胞、再生源细胞、心脏和心血管源细胞。
干细胞包括成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、外围血干细胞、脐带血干细胞、间质干细胞，源自组织和器官或其他来源的干细胞，包括胎儿和/或胚胎来源，以及干细胞与其他细胞和不同来源的混合物。成体干细胞包括：骨髓干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、眼睛干细胞、神经干细胞、心脏干细胞等。
在一些实施方案中，内胚层来源的干细胞是指肺上皮干细胞、胃肠道干细胞、胰腺干细胞或肝椭圆形红细胞(hepatic oval cell)和/或其祖细胞。在特定的实施方案中，泌尿生殖来源的细胞被分类为乳腺和前列腺干细胞或者卵巢和睾丸干细胞和/或其祖细胞。在特定的实施方案中，中胚层来源的细胞是骨髓细胞、造血干细胞、基质干细胞或心脏干细胞和/或其祖细胞。在特定的实施方案中，外胚层来源的细胞是神经干细胞、皮肤干细胞或眼睛干细胞和/或其祖细胞。
可使用本发明的组合物和方法冷冻保存的细胞类型包括：例如分化的细胞(例如：成纤维细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B细胞、T细胞、红细胞、巨噬细胞，单核细胞或肌细胞)和未分化的细胞(例如：胚胎干细胞、间质干细胞或成体干细胞)。细胞可以是单倍体、二倍体或四倍体。其他细胞包括来自膀胱、脑、食管、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道或子宫的细胞。
在进一步特定的实施方案中，细胞来自成人的脑、骨髓、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、心脏、肠、肝脏或其他成人组织。在特定的实施方案中，细胞选自内胚层、泌尿生殖器、中胚层或外胚层来源。
组织包括：角膜、软骨、骨骼、皮肤、心脏瓣膜、胰岛、来自人类、动物、鱼类、贝类和植物的胚胎以及来自人和动物的卵巢组织。本发明组合物和方法也可保存工程化组织和组织构建体。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于冷冻保存辅助生殖技术中的卵母细胞或精子，或用于接受化学疗法或放射疗法的患者。该方法还可用于干细胞的冷冻保存，然后干细胞可用作基于干细胞的疗法、细胞移植、组织工程和再生医学的基础。该方法还可用于冷冻保存动物的卵母细胞或精子，这种动物很少或有灭绝的危险，以备将来用于辅助生殖技术以保护物种。该方法可进一步用于畜牧业目的(例如，动物的繁殖和饲养)，例如，用于冷冻保存来自动物如牛、猪和绵羊的胚胎干细胞、配子体、卵母细胞或精子。
冷冻保存的细胞可用于治疗各种疾病。举例来说，在数个实施方案中，眼细胞用于治疗眼病，包括但不限于年龄相关性黄斑变性(湿或干)、糖尿病性黄斑水肿、特发性脉络膜新血管形成或高度近视性黄斑变性。在一些眼睛实施方案中，使用RPE细胞。在数个实施方案中，心脏干细胞被用于治疗心血管疾病，例如：心肌梗塞、缺血性心脏组织损伤、充血性心力衰竭、动脉瘤、动脉粥样硬化诱发事件、脑血管意外(中风)和冠状动脉疾病。在数个实施方案中，肝干细胞用于治疗肝病，例如：肝炎、肝硬化、癌症等。可使用本发明的方法和装置治疗其他组织中的疾病，例如：肾、肺、胰脏、肠、骨和/或软骨以及神经组织等。在一些实施方案中，收取的骨髓干细胞可用于重建由于白血病、癌症或减少血细胞计数的疗法而减少的造血细胞。
本发明也可用于各种治疗方法。细胞疗法或细胞治疗通常可包括人或动物细胞的移植以替换或修复受损组织和/或细胞。细胞疗法已用于重建关节受损软骨、修复脊髓损伤、加强弱化的免疫系统、治疗自身免疫性疾病，并帮助患有阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫等神经系统疾病的患者。进一步的用途包括治疗各种慢性疾病，例如动脉硬化、先天性缺陷和性功能障碍。
细胞疗法通常包括注射异种的(xenogenic)、同种的(allogenic)(来自另一个人供体)或自体的(autologous)(其中细胞被取出并移植回相同的患者)的全细胞或细胞提取物。
本发明的组合物和方法可用于以下应用中：其可用于将细胞储存一段时间以用于后续细胞疗法。这可以包括存储患者自身的细胞用于后续移植，以及存储通用细胞系(例如，用于研究或治疗的胚胎干细胞系)。
病毒或病毒颗粒可以是任何病毒。在一些实施方案中，病毒或病毒颗粒包含：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒等。在一些实施方案中，病毒或病毒颗粒是可用于基因疗法的那些病毒或病毒颗粒。
试剂盒
本发明还提供了包含本发明保存组合物(如本发明所述的固体或液体形式)的试剂盒。此类试剂盒可包括一个或多个包含本发明保存组合物的容器。在一个实施方案中，试剂盒包含本发明的保存组合物，其包含生物材料。在一个实施方案中，试剂盒包含用于保存(例如，冷冻保存)的生物材料。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于本发明中的任何方法中的使用说明书。在一个实施方案中，试剂盒包含用于用保存组合物和方法保存生物材料的说明书。所述试剂盒可以进一步包括基于鉴定所述受试者是否需要所述治疗来选择适合于治疗的受试者的说明。在一些实施方案中，说明书包括将在冷冻保存后解冻的生物材料给予需要治疗的受试者的说明。在一些实施方案中，试剂盒中提供的说明书是标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页还可指示生物材料的临床和/或研究应用。
试剂盒的多个部分可以同时或按时间顺序交错使用，即，在不同的时间点使用，并且对于试剂盒的任何组分具有相同或不同的时间间隔。可以选择时间间隔以获得期望的效果。
本发明所提供的试剂盒是置于合适的包装中。其中，合适的包装包括小瓶(例如：冷冻瓶)、瓶、安瓿、管(例如：冷冻管)、袋、烧瓶、罐、软包装等，但不局限于此。此外还包含了与特定装置(例如：冷冻容器、冷冻瓶和/或冷冻管)组合使用的包装。
试剂盒任选地可提供额外的组分，例如：缓冲液和说明信息(interpretiveinformation)。通常，试剂盒包括容器和容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些实施方案中，本发明提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
以下是本发明的实施例，但不应成为限制条件。
实施例1
冷冻溶液制备
制备9个冷冻溶液的储备样品(表1)。白蛋白是从Kedrion购买的HSA。明胶购自Gelita(明胶由牛皮制备；批号L600217)或Nippi(明胶由牛、猪和/或鱼等制备；批号S150806)。海藻糖购自Hayashibara。蔗糖购自J.T.Baker。甘油购自Spectrum。PEG购自SIGMA。实施例表中各种组分的百分比是％(w/v)。
在这些实验中，通过将所需试剂以所需工作浓度的两倍的浓度溶解在DMEM中来配制冷冻储液。因此，在以1:1的体积比与细胞悬浮液混合后，可以获得所需的工作浓度。同样，如果需要，也可以制备具有所需工作浓度的3倍、4倍或5倍浓度的冷冻储液。
表1：2倍冷冻储液
冷冻细胞
培养成纤维细胞并使其扩增5天。在细胞达到约80-90％融合状态后，将细胞用胰蛋白酶作用并悬浮于DMEM中。将500μl细胞悬浮液(106个细胞/ml)与500μl2倍冷冻储液在冷冻管中混合。在CPA-1至CPA-9(不同样品)中，冷冻溶液的各组分的最终浓度(工作浓度)示于表2中。对照样品含有DMEM。
表2：冷冻溶液组分的工作浓度
然后将冷冻管转移到含有异丙醇的冷冻容器(例如，Mr.Frosty)中，并在-80℃冷冻机中储存1-2天。随后，将这些冷冻管从-80℃冷冻机转移至液氮储罐长期储存。
细胞存活率测试
将冷冻管置于37℃水浴中2-3分钟以解冻冷冻保存的细胞。将解冻的细胞悬浮液轻轻混合，并通过ADAM-MC自动细胞计数器(Digital Bio)分析细胞的存活率。
结果
各种细胞冷冻溶液中成纤维细胞的存活率示于表3和图1中。在含有大分子、糖和渗透性冷冻保护剂的冷冻保存组合物中冷冻保存的细胞比在单独的DMEM中保持更高的存活率。
表3细胞解冻后的存活率
实施例2
为了测试冷冻保存溶液的各种组分对细胞存活率的影响，根据表4制备不同的样品。
表4
根据表7制备27种冷冻保存组合物，包括9种第一组冷冻保存组合物、9种第二组冷冻保存组合物和9种第三组冷冻保存组合物。
在冷冻保存之前扩增细胞
将两管FE002-SK2细胞(第9代；P9)(胎儿皮肤成纤维细胞)解冻，其具有以下存活率(表5)。
表5
将来自两个管的细胞合并，并均匀分布到五个T150细胞培养瓶(约4,666个细胞/cm2)中。将20mL细胞培养基加入细胞培养瓶中以培养细胞。
收取细胞
接种后约7天，收取细胞，其具有以下存活率(表6)。
表6
在5倍稀释之前，原始细胞浓度为1.08×106×5＝5.4×106个细胞/ml。总细胞悬浮液为5.8mL。向细胞中加入2mL细胞培养基。因此，将细胞浓度稀释至4×106个细胞/ml。总细胞悬浮液为7.8mL。
在冷冻管中将200μL细胞悬浮液加入到各200μL的2倍冷冻保存组合物(表7)中。细胞浓度为2×106细胞/0.4mL。
将具有冷冻保存组合物和细胞混合物的冷冻管置于Mr.冷冻容器中，然后将其置于-80℃冷冻机中过夜。将冷冻管转移到液氮罐中以长期储存。
解冻后的细胞存活率
将冷冻管置于37℃水浴中以解冻细胞。通过ADAM-MC自动细胞计数器(DigitalBio)分析细胞的存活率。简而言之，每次解冻一个冷冻管，并将混合物移液五次以混合。将20μL混合物与20μL染色溶液混合，并使用细胞计数器计数。
表7冷冻保存组合物和解冻后细胞存活率
在实施例中，“完全-CPA”、“完全-1”或“完全-2”是指含有渗透性冷冻保护剂(例如甘油)、糖类(例如海藻糖)和大分子(例如，HSA)的冷冻保存组合物。它们是本发明的冷冻保存组合物的实施方案。“SD”指标准偏差。“平均值”是指平均数值。
实验的原始数据列于表8中。
表8
CPA-1至CPA-27是不同的样品。对照样品是DMSO-1、DMSO-2、完全-1和完全-2。
讨论
结果显示，使用本发明的冷冻保存组合物(完全-CPA、完全-1和完全-2)的实施方案冷冻保存的细胞的解冻后存活率高于80％，这与含有DMSO(DMSO-CPA、DMSO-1和DMSO-2)的冷冻保存组合物相当。。
结果进一步表明，从冷冻保存组合物中除去任何三种组分(大分子、糖和渗透性冷冻保护剂)，或使用非最佳浓度的组分，将降低解冻后的细胞存活率。
示例性系统和方法在以下条目中列出：
条目1.一种冷冻保存组合物，其包含：(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约1M的糖类；和(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子，其中单位％(w/v)和单位M是基于所述冷冻保存组合物的总体积。
条目2.根据条目1所述的冷冻保存组合物，其中所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、聚乙二醇或其组合。
条目3.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其中所述糖类包括蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖或其组合。
条目4.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其中所述糖类包括蔗糖、海藻糖或其组合。
条目5.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其中所述大分子的分子量为约65kDa至约200kDa。
条目6.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其中所述大分子包括白蛋白、明胶或其组合。
条目7.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其基本上不含DMSO。
条目8.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其还包含氨基酸、细胞因子、脂质、生长因子、抗生素、抗真菌剂、类固醇激素、蛋白质激素或其组合。
条目9.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其还包含一个或多个细胞。
条目10.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其处于冷冻保存状态。
条目11.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其中所述细胞的浓度范围为约105个细胞/ml至约107个细胞/ml。
条目12.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其包含：(1)约2％(w/v)至约20％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约0.5M的糖类；和(3)约1％(w/v)至约5％(w/v)的大分子。
条目13.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其还包含一个或多个细胞。
条目14.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其处于冷冻保存状态。
条目15.根据前述条目中任一项所述的冷冻保存组合物，其中所述细胞以约105个细胞/ml至约107个细胞/ml的浓度存在。
条目16.一种冷冻保存一个或多个细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)将所述一个或多个细胞与冷冻保存组合物混合以形成混合物，和(b)冷冻所述混合物，其中所述冷冻保存组合物包含：(1)2至40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)0.1至1M的糖类；和(3)1至10％(w/v)的大分子。
条目17.根据条目16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
条目18.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞是人、猪、犬、马或牛细胞。
条目19.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞包含肿瘤细胞。
条目20.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞包含成纤维细胞。
条目21.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞包括干细胞。
条目22.根据前述条目中任一项所述的方法，其中将所述混合物在约-70℃至约-200℃的温度冷冻。
条目23.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞以约105个细胞/ml至约107个细胞/ml的浓度存在于所述混合物中。
条目24.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存组合物基本上不含DMSO。
条目25.根据前述条目中任一项所述的方法，其还包括步骤(c)：解冻所述冷冻的混合物。
条目26.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞具有至少70％的解冻后存活率。
条目27.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述细胞的解冻后存活率为至少80％。
条目28.一种试剂盒，其包含条目1-15中任一项的冷冻保存组合物。
本发明的范围不受上文具体示出和描述的内容的限制。本领域技术人员将认识到，对于所描述的材料、构造、结构和尺寸的示例存在合适的替代方案。在本发明的描述中引用和讨论了许多参考文献，包括专利和各种出版物。提供这些参考文献的引用和讨论仅仅是为了阐明本发明的描述，而不是承认任何参考文献是本发明所述发明的现有技术。本说明书中引用和讨论的所有参考文献都通过引用整体并入本发明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员将想到本发明所述内容的变化、修改和其他实施方式。虽然已经示出和描述了本发明的一些实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行改变和修改。在前面的描述中阐述的内容仅作为说明而不是作为限制。

Claims (28)

1.一种冷冻保存组合物，其包含：
(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；
(2)约0.1M至约1M的糖类；和
(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子，
其中单位％(w/v)和单位M是基于所述冷冻保存组合物的总体积。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其中所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、聚乙二醇或其组合。
3.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其中所述糖类包括蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖或其组合。
4.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其中所述糖类包括蔗糖、海藻糖或其组合。
5.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其中所述大分子的分子量为约65kDa至约200kDa。
6.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其中所述大分子包括白蛋白、明胶或其组合。
7.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其基本上不含DMSO。
8.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其还包含氨基酸、细胞因子、脂质、生长因子、抗生素、抗真菌剂、类固醇激素、蛋白质激素或其组合。
9.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其还包含一个或多个细胞。
10.根据权利要求9所述的冷冻保存组合物，其处于冷冻保存状态。
11.根据权利要求9所述的冷冻保存组合物，其中所述细胞的浓度范围为约105个细胞/ml至约107个细胞/ml。
12.根据权利要求1所述的冷冻保存组合物，其包含：
(1)约2％(w/v)至约20％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；
(2)约0.1M至约0.5M的糖类；和
(3)约1％(w/v)至约5％(w/v)的大分子。
13.根据权利要求12所述的冷冻保存组合物，其还包含一个或多个细胞。
14.根据权利要求13所述的冷冻保存组合物，其处于冷冻保存状态。
15.根据权利要求12所述的冷冻保存组合物，其中所述细胞以约105个细胞/ml至约107个细胞/ml的浓度存在。
16.一种冷冻保存一个或多个细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将所述一个或多个细胞与冷冻保存组合物混合以形成混合物，和
(b)冷冻所述混合物，
其中所述冷冻保存组合物包含：
(1)2至40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；
(2)0.1至1M的糖类；和
(3)1至10％(w/v)的大分子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是人、猪、犬、马或牛的细胞。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞包含肿瘤细胞。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞包含成纤维细胞。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞包括干细胞。
22.根据权利要求16所述的方法，其中将所述混合物在约-70℃至约-200℃的温度冷冻。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞以约105个细胞/ml至约107个细胞/ml的浓度存在于所述混合物中。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述冷冻保存组合物基本上不含DMSO。
25.根据权利要求16所述的方法，其还包括步骤(c)：解冻所述冷冻的混合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞具有至少70％的解冻后存活率。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞的解冻后存活率为至少80％。
28.一种试剂盒，其包含权利要求1-15中任一项的冷冻保存组合物。
CN201780061611.9A 2016-10-04 2017-10-04 用于细胞冷冻保存的组合物和方法 Pending CN109843052A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662404170P 2016-10-04 2016-10-04
US62/404,170 2016-10-04
US201662405447P 2016-10-07 2016-10-07
US62/405,447 2016-10-07
PCT/CN2017/105253 WO2018064976A1 (en) 2016-10-04 2017-10-04 Compositions and methods for cell cryopreservation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109843052A true CN109843052A (zh) 2019-06-04

Family

ID=61756821

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780061611.9A Pending CN109843052A (zh) 2016-10-04 2017-10-04 用于细胞冷冻保存的组合物和方法
CN201780061605.3A Pending CN109790514A (zh) 2016-10-04 2017-10-04 维持细胞存活率的组合物和方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780061605.3A Pending CN109790514A (zh) 2016-10-04 2017-10-04 维持细胞存活率的组合物和方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11485953B2 (zh)
EP (2) EP3534705A4 (zh)
JP (2) JP2019528765A (zh)
KR (2) KR102502294B1 (zh)
CN (2) CN109843052A (zh)
CA (2) CA3036391A1 (zh)
TW (2) TWI670371B (zh)
WO (2) WO2018064975A1 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111066776A (zh) * 2019-11-09 2020-04-28 无锡市人民医院 一种卵子冷冻保护剂及其应用
CN111979172A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种让细胞保持较长时间活性的输注液及其制备方法
CN112167243A (zh) * 2020-10-14 2021-01-05 中国科学技术大学 红细胞冻存液及快速冻存方法
CN112438252A (zh) * 2020-11-20 2021-03-05 上海欧易生物医学科技有限公司 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法
CN112616827A (zh) * 2020-11-30 2021-04-09 中国科学技术大学 红细胞冻存方法及冻存的红细胞
CN112649268A (zh) * 2020-12-14 2021-04-13 四川农业大学 精子质膜保护剂hepes/bsa及染色液和染色方法
CN114073249A (zh) * 2021-10-29 2022-02-22 上海原天生物科技有限公司 一种人t淋巴细胞的慢速冻存方法
CN114158549A (zh) * 2020-09-10 2022-03-11 上海原天生物科技有限公司 一种免疫细胞的置核冻存方法
CN114375944A (zh) * 2021-12-31 2022-04-22 四川大学华西医院 一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法
CN114642200A (zh) * 2022-03-01 2022-06-21 长春科技学院 一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法
CN114667999A (zh) * 2022-05-27 2022-06-28 广东先康达生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法
WO2022134434A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种外泌体冻存保护液及其制备方法
WO2023185487A1 (zh) * 2022-03-29 2023-10-05 中国科学技术大学 卵泡的冷冻保存和复苏方法

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11485953B2 (en) * 2016-10-04 2022-11-01 Transwell Biotech Co., Ltd. Compositions and methods for maintaining cell viability
US20220125042A1 (en) * 2017-05-17 2022-04-28 Universidade Nova De Lisboa Cryoprotectant and/or cryopreservant composition, methods and uses thereof
JP7000212B2 (ja) * 2018-03-14 2022-01-19 旭化成株式会社 幹細胞の凍結保存液
CN108552158A (zh) * 2018-04-09 2018-09-21 广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院） 一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法
CN108728408B (zh) * 2018-05-28 2021-08-24 天津博雅秀岩生物技术有限公司 犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基
AU2019310587A1 (en) * 2018-07-27 2021-02-18 Cellphire, Inc. Cryopreserved platelet compositions and methods for making
WO2020113090A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Cellphire, Inc. Platelets as delivery agents
WO2020112963A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Cellphire, Inc. Platelets as delivery agents
WO2020168340A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Doody Michael C In vitro fertilization media with antiviral medicine
CN109792985A (zh) * 2019-02-20 2019-05-24 华东理工大学 细胞冻存液
JP2022528772A (ja) * 2019-04-09 2022-06-15 北京大学第三医院（北京大学第三臨床医学院） Ｄｍｓｏフリーの凍結保存液及びその調製方法と応用
CN113728089A (zh) * 2019-04-26 2021-11-30 株式会社大塚制药工场 含海藻糖的哺乳动物细胞保存用液
JP2022536588A (ja) * 2019-04-30 2022-08-18 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 細胞の凍結保存のための組成物および方法
SG11202112054WA (en) 2019-05-03 2021-11-29 Cellphire Inc Materials and methods for producing blood products
KR102487903B1 (ko) * 2019-06-02 2023-01-12 (주)카스 인 바이오 연질 생체 조직을 미립자화하는 방법 및 이의 방법으로 제조된 연질 생체 조직 미립자 이식편
CA3147618A1 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 Cellphire, Inc. Use of platelets in treating infections
AU2020334903B2 (en) 2019-08-16 2023-12-21 Cellphire, Inc. Thrombosomes as an antiplatelet agent reversal agent
US20220380731A1 (en) * 2019-11-08 2022-12-01 Kansas State University Research Foundation Isolation, preservation, and expansion of canine umbilical cord mesenchymal stromal cells
WO2021108806A1 (en) * 2019-11-29 2021-06-03 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions, kits and methods for storage of blood products and methods of use thereof
CN110934132A (zh) * 2019-12-30 2020-03-31 苏州君欣生物科技有限公司 一种无血清无dmso细胞冻存液及其制备方法
KR102542183B1 (ko) * 2019-12-31 2023-06-14 (주)두다 치아 유래 줄기세포의 분리를 위한 치아의 보존 방법
EP4093195A1 (en) * 2020-01-21 2022-11-30 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions and methods of cryopreserving cells
CA3170198A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Cellphire, Inc Methods of treating acquired hemophilia with anti-fibrinolytic loaded platelets
GB202007905D0 (en) * 2020-05-27 2020-07-08 Univ Edinburgh Cryopressing macrophages
WO2022038607A1 (en) * 2020-08-18 2022-02-24 Ichilov Tech Ltd Device and a method for organ preservation
WO2022091822A1 (ja) * 2020-10-29 2022-05-05 国立大学法人大阪大学 細胞構造体の凍結方法
US20220211029A1 (en) * 2020-11-10 2022-07-07 Cellphire, Inc. Freeze-dried peripheral blood mononuclear cell compositions and methods
JP7266892B2 (ja) * 2020-11-16 2023-05-01 株式会社アビー 細胞凍結保存液、凍結細胞保存方法、及び細胞凍結方法
WO2022158097A1 (ja) * 2021-01-19 2022-07-28 新田ゼラチン株式会社 ウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物
WO2023180635A1 (fr) * 2022-03-22 2023-09-28 Sorbonne Universite Methode de conservation de cellules
CN117481109B (zh) * 2023-12-26 2024-03-12 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 一种细胞储存介质及储存方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060101539A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-11 Ainley William M Cryopreservation of cells
CN101220346A (zh) * 2008-02-03 2008-07-16 西北农林科技大学 一种生物细胞冷冻抗冻剂
US20090197331A1 (en) * 2004-09-24 2009-08-06 Yoichi Kato Compositions for cryopreservation of cells
WO2009115581A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Cryo-Save Ag Improved cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells
CN102771472A (zh) * 2012-04-25 2012-11-14 余文莉 一种用于保存胚胎的冷冻液、其制备方法及应用
EP2885969A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-24 FertiPro N.V. Cryopreservation tools and methods
CN105517434A (zh) * 2013-07-02 2016-04-20 奥斯特利亚诺瓦新加坡私人有限公司 一种冷冻干燥包囊细胞的方法、冻干的包囊细胞、含有冻干的包囊细胞的组合物及这种细胞和组合物的用途
WO2016063208A1 (en) * 2014-10-20 2016-04-28 Stempeutics Research Pvt. Ltd. A cryopreservation composition and methods thereof
CN105532643A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司 精子冷冻保护剂及其制备方法
CN105961374A (zh) * 2016-07-04 2016-09-28 深圳市合康生物科技股份有限公司 细胞冻存液

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876754A (en) 1992-01-17 1999-03-02 Alfatec-Pharma Gmbh Solid bodies containing active substances and a structure consisting of hydrophilic macromolecules, plus a method of producing such bodies
US6231881B1 (en) 1992-02-24 2001-05-15 Anton-Lewis Usala Medium and matrix for long-term proliferation of cells
JPH06234659A (ja) 1992-05-05 1994-08-23 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai 安定化生ワクチン
AU2088992A (en) 1992-05-05 1993-11-11 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The Stabilized live vaccine
FR2746109B1 (fr) 1996-03-12 1998-04-17 Rhone Poulenc Rorer Sa Milieu pour la conservation de materiel biologique
US5827741A (en) 1996-11-19 1998-10-27 The Regents Of The University Of California Cryopreservation of human adult and fetal pancreatic cells and human platelets
US6632666B2 (en) 2000-01-14 2003-10-14 Biolife Solutions, Inc. Normothermic, hypothermic and cryopreservation maintenance and storage of cells, tissues and organs in gel-based media
EP1255439A4 (en) 2000-02-10 2007-01-03 Univ California THERAPEUTIC PLATES AND METHOD
US7094601B2 (en) 2000-05-16 2006-08-22 The General Hospital Corporation Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells
US20020045156A1 (en) 2000-05-16 2002-04-18 Mehmet Toner Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells
JP2002034552A (ja) 2000-07-18 2002-02-05 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞付細胞培養器の製造方法
US20080176205A1 (en) * 2003-12-04 2008-07-24 University Of Utah Research Foundation Process and Formulation to Improve Viability of Stored Cells and Tissue
WO2005072523A2 (en) 2004-02-02 2005-08-11 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Biological material and methods and solutions for preservation thereof
US20070009880A1 (en) * 2005-07-11 2007-01-11 Toledo Luis H Methods And Solutions For Storing Donor Organs
US9538745B2 (en) 2006-04-14 2017-01-10 The General Hospital Corporation Methods for the cryopreservation of cells
JP5073224B2 (ja) 2006-04-24 2012-11-14 浜松ホトニクス株式会社 分化細胞の調製方法および分化誘導用未分化細胞組成物
WO2007146344A2 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 The Jackson Laboratory Sperm cryoprotective media
DE102007047040A1 (de) 2007-10-01 2009-04-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Transparentes Kältegel
EP3338549A1 (en) 2007-11-20 2018-06-27 Pioneer Surgical Orthobiologics, Inc. Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles
EP2702135B1 (en) 2011-04-29 2019-04-17 University of Southern California Method of cryopreservation of stem cell-derived retinal pigment epithelial cells on polymeric substrate
JP5867912B2 (ja) 2011-05-11 2016-02-24 国立大学法人福井大学 細胞の凍結保存液および凍結保存方法
US9977012B2 (en) * 2014-10-24 2018-05-22 Lifeline Scientific, Inc. Select on of extracellular matrix components and or matricellular proteins for improved post-cryopreservation cell viability and retention
CN104630132B (zh) 2015-01-30 2017-11-14 肇庆大华农生物药品有限公司 一种培养Marc‑145细胞用的培养基及其制备方法
SG11201805533QA (en) 2016-01-14 2018-07-30 Depuy Synthes Products Inc Composition and methods for cryopreservation of hutc
US11485953B2 (en) * 2016-10-04 2022-11-01 Transwell Biotech Co., Ltd. Compositions and methods for maintaining cell viability

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090197331A1 (en) * 2004-09-24 2009-08-06 Yoichi Kato Compositions for cryopreservation of cells
US20060101539A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-11 Ainley William M Cryopreservation of cells
CN101220346A (zh) * 2008-02-03 2008-07-16 西北农林科技大学 一种生物细胞冷冻抗冻剂
WO2009115581A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Cryo-Save Ag Improved cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells
CN102771472A (zh) * 2012-04-25 2012-11-14 余文莉 一种用于保存胚胎的冷冻液、其制备方法及应用
CN105517434A (zh) * 2013-07-02 2016-04-20 奥斯特利亚诺瓦新加坡私人有限公司 一种冷冻干燥包囊细胞的方法、冻干的包囊细胞、含有冻干的包囊细胞的组合物及这种细胞和组合物的用途
EP2885969A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-24 FertiPro N.V. Cryopreservation tools and methods
WO2016063208A1 (en) * 2014-10-20 2016-04-28 Stempeutics Research Pvt. Ltd. A cryopreservation composition and methods thereof
CN105532643A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司 精子冷冻保护剂及其制备方法
CN105961374A (zh) * 2016-07-04 2016-09-28 深圳市合康生物科技股份有限公司 细胞冻存液

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
伍津津 等: "《皮肤组织工程学》", 30 June 2009, 人民军医出版社 *
刘建福 等: "《细胞工程》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 *
方亮 主编: "《药用高分子材料学》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111066776A (zh) * 2019-11-09 2020-04-28 无锡市人民医院 一种卵子冷冻保护剂及其应用
CN111979172A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种让细胞保持较长时间活性的输注液及其制备方法
CN114158549A (zh) * 2020-09-10 2022-03-11 上海原天生物科技有限公司 一种免疫细胞的置核冻存方法
CN114158549B (zh) * 2020-09-10 2023-10-03 上海原天生物科技有限公司 一种免疫细胞的置核冻存方法
CN112167243A (zh) * 2020-10-14 2021-01-05 中国科学技术大学 红细胞冻存液及快速冻存方法
CN112167243B (zh) * 2020-10-14 2023-03-10 中国科学技术大学 红细胞冻存液及快速冻存方法
CN112438252A (zh) * 2020-11-20 2021-03-05 上海欧易生物医学科技有限公司 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法
CN112438252B (zh) * 2020-11-20 2021-06-08 上海欧易生物医学科技有限公司 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法
CN112616827A (zh) * 2020-11-30 2021-04-09 中国科学技术大学 红细胞冻存方法及冻存的红细胞
CN112616827B (zh) * 2020-11-30 2022-05-13 中国科学技术大学 红细胞冻存方法及冻存的红细胞
CN112649268A (zh) * 2020-12-14 2021-04-13 四川农业大学 精子质膜保护剂hepes/bsa及染色液和染色方法
WO2022134434A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种外泌体冻存保护液及其制备方法
CN114073249A (zh) * 2021-10-29 2022-02-22 上海原天生物科技有限公司 一种人t淋巴细胞的慢速冻存方法
CN114073249B (zh) * 2021-10-29 2024-01-02 上海原天生物科技有限公司 一种人t淋巴细胞的慢速冻存方法
CN114375944A (zh) * 2021-12-31 2022-04-22 四川大学华西医院 一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法
CN114642200A (zh) * 2022-03-01 2022-06-21 长春科技学院 一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法
CN114642200B (zh) * 2022-03-01 2023-03-03 长春科技学院 一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法
WO2023185487A1 (zh) * 2022-03-29 2023-10-05 中国科学技术大学 卵泡的冷冻保存和复苏方法
CN114667999A (zh) * 2022-05-27 2022-06-28 广东先康达生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11485953B2 (en) 2022-11-01
CA3036388A1 (en) 2018-04-12
US10815456B2 (en) 2020-10-27
JP7157050B2 (ja) 2022-10-19
KR20190090780A (ko) 2019-08-02
CA3036391A1 (en) 2018-04-12
EP3534705A1 (en) 2019-09-11
TWI664412B (zh) 2019-07-01
WO2018064976A1 (en) 2018-04-12
EP3523419A4 (en) 2020-04-15
CN109790514A (zh) 2019-05-21
JP2019528765A (ja) 2019-10-17
US20180094235A1 (en) 2018-04-05
TWI670371B (zh) 2019-09-01
WO2018064975A1 (en) 2018-04-12
KR20190088461A (ko) 2019-07-26
US20180092348A1 (en) 2018-04-05
EP3523419A1 (en) 2019-08-14
KR102502294B1 (ko) 2023-02-21
JP2019528764A (ja) 2019-10-17
EP3534705A4 (en) 2020-04-22
TW201816107A (zh) 2018-05-01
TW201831876A (zh) 2018-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109843052A (zh) 用于细胞冷冻保存的组合物和方法
US10472606B2 (en) Cell preservation method for pluripotent stem cells
Mazur Freezing of living cells: mechanisms and implications
JP4031044B2 (ja) 細胞凍結保存培地中のアラビノガラクタンの使用
Ma et al. Advanced biomaterials in cell preservation: Hypothermic preservation and cryopreservation
CN109090100A (zh) 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法与使用方法
Rajan et al. Development and application of cryoprotectants
JP6561173B2 (ja) 哺乳動物細胞投与用液
CN108617638A (zh) 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用
KR20210052451A (ko) 세포 및/또는 조직의 수송 및/또는 동결 보존을 위한 조성물
Siddiqui et al. Effect of slow and rapid freezing method on the viability of cryopreserved vero cells
Deller The investigation and application of ice recrystallization inhibitors as cryoprotectants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190604