JP5073224B2 - 分化細胞の調製方法および分化誘導用未分化細胞組成物 - Google Patents
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Description
以下に、本発明の実施形態に係る分化細胞の調製方法について詳細に説明する。
本発明の分化誘導用未分化細胞組成物は、未分化細胞とDMSOとを含む細胞保存用調製液をセラムチューブ中で凍結したものであって、上記凍結工程で得られるものである。分化誘導用未分化細胞組成物に使われる細胞保存用調製液としては、凍結保存する細胞に適した細胞増殖用培地を用い、これにDMSOを加え、凍結保存する未分化細胞を懸濁して使用するが、上記の細胞傷害を軽減できるものであれば、市販の細胞凍結保存用溶液(例えば、セルバンカー(十慈フィールド社))、血清、緩衝液等を細胞増殖用培地の代わりに用いてもよく、DMSO以外のその他の凍結保護剤(例えば、グリセロール)や血清等をさらに加えてもよい。
通常分化誘導処理細胞を得るための従来法に基づく分化細胞の調製方法は、以下の1)〜5)の5つの工程からなる。
まず、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI1640培地(大日本製薬株式会社)に凍結保護剤として一定量のDMSOを加えて細胞保存用調製液を調製し、対数増殖期にあるHL−60細胞を一定の細胞密度になるようにこの細胞保存用調製液に縣濁した。その後、細胞凍結保存用のセラムチューブに細胞を縣濁した上記細胞保存用調製液を1mLずつ分注し、このセラムチューブをBICELL(日本フリーザー社)に入れて−80℃で一晩保存した。これにより、細胞は、1℃/分ずつ段階的に冷却され、細胞の内外にできる氷結晶による物理的傷害を防ぐことができる。その後、凍結細胞の入ったセラムチューブを液体窒素式保存容器に移動し、液体窒素中で一定期間保存した。
その後、凍結工程で液体窒素中に保存した上記セラムチューブを液体窒素式保存容器から取り出し、すぐに37℃の湯浴槽に浸けて、セラムチューブを手で振とうしながらに急速に細胞保存用調製液を解凍した。
上記細胞保存用調製液を解凍した後は、そこに5mLの10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI1640培地を加えることによりDMSO濃度を希釈し、引き続いて遠心分離することによりDMSOを完全に取り除いた。
その翌日には、培地交換をして死滅細胞および残存したDMSOを取り除き、2週間継代培養を繰り返し、細胞の増殖速度をモニタリングすることにより対数増殖期に入ったことを確認した。
その後、対数増殖期に入った細胞を回収し、所定の細胞密度になるように新しい培地に播種し、最終濃度が1.25〜1.30体積%になるようにDMSOを添加した。引き続き、CO2インキュベータ内で4日間培養し、こうして得られた細胞を通常分化誘導処理細胞として実験に用いた。
凍結分化誘導処理細胞を得るための本発明の分化誘導細胞の調製方法は、以下の1)〜4)の4つの工程からなる。
凍結工程および解凍工程は、上記の通常分化誘導処理細胞の調製における凍結工程および解凍工程と同じである。
上記細胞保存用調製液を解凍した後は、その1mLに対して9mLの10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI1640培地を加えることによりDMSO濃度を希釈した。
その後、DMSOを取り除くことなく、そのままCO2インキュベータ内で4日間培養し、こうして得られた細胞を凍結分化誘導処理細胞として実験に用いた。
上記した通常分化誘導処理細胞と凍結分化誘導処理細胞との分化の程度を比較するために、両細胞を走化性刺激因子であるformyl−methionyl−leucyl−phenylalanine(以下、fMLP)とプロテインキナーゼC(PKC)を直接活性化するphorbol myristate acetate(以下、PMA)で刺激し、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇とスーパーオキシドの産生について調べた。未分化のヒト骨髄芽球系細胞であるHL−60細胞は、fMLPに反応せず、スーパーオキシド産生能も有していないが、好中球様細胞に分化すると、fMLPとPMAの刺激に対する反応性を獲得し、細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇し、スーパーオキシドの産生が認められるため、これらを調べることにより、両群の細胞の分化の程度(活性)を比較することができる。
図1は、通常分化誘導処理細胞と凍結分化誘導処理細胞をfMLPとPMAとで刺激した場合の細胞内カルシウムイオン濃度およびスーパーオキシド産生量の経時的変化の典型例を示したグラフである。ここに示される通常分化誘導処理細胞と凍結分化誘導処理細胞は、いずれも凍結保護剤として10体積%DMSOを加えた細胞保存用調製液に細胞密度が4.0×106細胞/mLになるようにして凍結保存したHL−60細胞を用いて、上記方法に基づいて分化誘導された細胞である。
次に、本発明の分化誘導細胞の調製方法の凍結工程における細胞密度の影響を調べるために、凍結保護剤として10体積%DMSOを加えた上記細胞保存用調製液に懸濁する細胞密度を1.1〜11.9×106細胞/mLの間の13種類の細胞密度に調製してHL−60細胞を凍結保存し、この凍結細胞から調製された凍結分化誘導処理細胞をfMLPとPMAで刺激した場合の細胞内カルシウムイオン濃度およびスーパーオキシド産生量を経時的に調べた。その際、fMLPとPMAで凍結分化誘導処理細胞に誘導される細胞内カルシウムイオン濃度の上昇およびスーパーオキシド産生に及ぼすEthylene glycol bis(beta−aminoethyl ether)−N,N,N’,N’−tetraacetic acid(以下、EGTA;カルシウムキレート剤)又は8−N,N−diethylamino−octyl−3,4,5−trimethoxybenzoate hydrochloride(以下、TMB−8;小胞体カルシウムチャネル阻害剤)の阻害作用を同時に調べ、分化細胞の薬剤感受性として評価した。
次に、本発明の分化誘導細胞の調製方法の凍結工程におけるDMSO濃度の影響を調べるために上記細胞保存用調製液に凍結保護剤として添加するDMSO濃度を5〜13.5体積%の間の7種類の濃度に調製し、HL−60細胞の細胞密度が3.6×106細胞/mLになるように懸濁して凍結保存し、この凍結細胞から調製された凍結分化誘導処理細胞をfMLPとPMAで刺激した場合の細胞内カルシウムイオン濃度およびスーパーオキシド産生量を経時的に調べた。その際、fMLPとPMAで凍結分化誘導処理細胞に誘導される細胞内カルシウムイオン濃度の上昇およびスーパーオキシド産生に及ぼすEGTA又はTMB−8の阻害作用を同時に調べ、分化細胞の薬剤感受性として評価した。
Claims (5)
- 分化細胞の調製方法であって、
未分化細胞と、ジメチルスルホキシド(DMSO)と、を含む細胞保存用調製液を凍結する凍結工程と、
凍結した前記細胞保存用調製液を解凍する解凍工程と、
解凍した前記細胞保存用調製液に培地を加えることによりジメチルスルホキシド(DMSO)濃度を希釈する希釈工程と、
希釈した前記細胞保存用調製液中の未分化細胞を、DMSOを取り除くことなく培養して分化細胞にする培養工程と、
を備える、調製方法。 - 前記細胞保存用調製液は、8〜9体積%のジメチルスルホキシド(DMSO)を含む、請求項1に記載の調製方法。
- 前記希釈工程において、ジメチルスルホキシド(DMSO)の最終濃度を0.8〜0.9体積%になるように希釈する、請求項1又は2のいずれか一項に記載の調製方法。
- 前記分化細胞は、好中球様細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製方法。
- 前記未分化細胞は、HL−60細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の調製方法。
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