KR20190088461A

KR20190088461A - 세포 저온보존을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20190088461A
Application number: KR1020197009922A
Authority: KR
Inventors: 빈-루 쉬; 쿤-치 치앙; 쳉-이 린; 팅-유 후앙
Original assignee: 트랜스웰 바이오테크 컴패니 리미티드
Priority date: 2016-10-04
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2019-07-26
Also published as: US11485953B2; CA3036388A1; US10815456B2; JP7157050B2; KR20190090780A; CA3036391A1; EP3534705A1; TWI664412B; WO2018064976A1; EP3523419A4; CN109790514A; JP2019528765A; US20180094235A1; CN109843052A; TWI670371B; WO2018064975A1; US20180092348A1; EP3523419A1; KR102502294B1; JP2019528764A

Abstract

침투 저온보호제, 사카라이드 및 거대분자를 포함하는 저온보존 조성물이 개시된다. 저온보존 조성물은 세포 및 조직에 낮은 독성을 갖고, 저온보존 동안 생물학적 재료의 생존 및 생존능력의 보유를 촉진한다.

Description

세포 저온보존을 위한 조성물 및 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 미국 가출원 제62/405,447호(2016년 10월 7일자로 출원) 및 제62/404,170호(2016년 10월 4일자로 출원)(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다. 본 출원은 또한 발명의 명칭이 "Compositions and Methods for Maintaining Cell Viability"이고 2017년 10월 4일자로 출원된 국제 출원 제PCT/CN2017/105252호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 관한 것이다.

기술 분야

본 개시내용은 일반적으로 저온보존의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 생물학적 재료, 예컨대 세포 및 조직의 저온보존을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

0℃ 이하의 온도에서의 저온보존 기법은 생물학적 재료, 예컨대 동물 및 식물의 세포 및 조직(인간 세포 및 조직 포함)의 장기간 보존에 일상적으로 사용된다. Thompson et al., Cryopreservation and Thawing of Mammalian Cells, December 2014, eLS, John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. DOI: 10.1002/9780470015902.a0002561.pub2. 포유류 세포의 효과적인 장기간 저장은 임상 및 조사 도구로서 이러한 세포의 성공적인 분야에 중요하다. 예를 들어, 줄기세포는 세포 이식, 조직 조작 및 재생 의학에 사용될 수 있다. 저온보존된 난모세포, 정자 및 배아는 보조 재생 기술에서 사용될 수 있다. 이식 의학에서, 살아 있는 조직, 예컨대 피부, 각막, 췌장 소도 및 심장 판막은 저온보존될 필요가 있다.

세포내 얼음 형성 및 삼투 불균형이 동결 공정 동안 세포를 손상시킬 수 있다고 나타났다. Gao et al., Mechanisms of Cryoinjury in Living Cells, ILAR Journal, 2000, 41(4): 187-196. 이를 피하기 위해, 저온보호제(CPA)는 동결 동안 세포 및 조직의 생존능력을 보존하도록 사용된다. 저온보호제는 3개의 주요 화학 종으로 구분된다: 폴리올(예를 들어, 다이올, 글라이세롤), 아마이드 및 설폭사이드. 흔히 사용되는 저온보호제는 글라이세롤, 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함한다. 게다가, 몇몇 첨가제, 예컨대 거대분자 및 당은 저온보존 동안 세포 및 조직에 대한 손상을 추가로 감소시키도록 첨가될 수 있다.

이들 저온보호제 중에서, DMSO는 높은 세포 투과성을 갖고, 가장 효과적이고 빈번히 채택된다. 그러나, DMSO는 생리학적으로 독성이고, 세포가 수혜자에게 수혈될 때 고혈압, 구역 및 구토를 야기하는 것으로 공지되어 있다. 추가로, DMSO의 독성은 해동된 세포가 배양되거나 수혜자의 몸으로 수혈된 후 세포의 생존율 및/또는 기능을 약화시키는 경향이 있다.

저속 동결 및 유리화작용은 생물학적 재료의 저온보존에 대한 2개의 전통적인 접근법이다. 저속 동결 동안, 세포는 이의 평형 어는점의 약간 아래의 온도로 냉각되고, 얼음은 세포외 배지에서 시딩된다. 얼음이 세포외 용액에서 형성되면서, 외부 용질 농도가 점진적으로 증가한다. 그 결과, 세포는 탈수하고, 세포질의 융점은 저하하고, 세포내 얼음의 형성은 회피된다. 유리화작용은 결정화가 없다는 것을 제외하고는 고체와 같이 거동하기에 충분히 높은 값에 도달하는 샘플의 점도에 의해 정의된다. Principles of Cryopreservation, Methods in Molecular Biology, vol. 368: Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, Second Edition, Humana Press Inc. 이 유리질 상태는 냉각이 빨리 생기면 대부분 액체에서 유도될 수 있다. 저온보호제의 첨가는 필요한 높은 냉각 속도를 감소시킬 수 있다.

포유류 세포의 저온보존을 위한 종래의 기법은 일반적으로 임상 또는 조사 환경에서 세포의 잠재적 사용으로부터 손상시키는 단점과 연관된다. 따라서, 개선된 저온보존 배지 및 생물학적 재료를 저온보존하기 위한 방법의 수요가 존재한다.

본 개시내용은 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v)의 침투 저온보호제(permeating cryoprotectant); (2) 약 0.1M 내지 약 1M의 사카라이드; 및 (3) 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 거대분자를 포함하는 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 제공하고, 여기서 %(w/v)의 단위 및 M의 단위는 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)의 전체 용적을 기준으로 한다.

본 개시내용은 또한 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v)의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 1M의 사카라이드; (3) 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 거대분자; 및 (4) 용매(예를 들어, 물, 완충제, 식염수 용액, 배양 배지, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 다른 용매)를 포함하는(또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진) 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 제공한다.

(1) 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v)의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 0.5M의 사카라이드; 및 (3) 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 거대분자를 포함하는 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)이 본 개시내용에 의해 또한 포함된다.

본 개시내용은 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v)의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 0.5M의 사카라이드; (3) 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 거대분자; 및 (4) 용매(예를 들어, 물, 완충제, 식염수 용액, 배양 배지, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 다른 용매)를 포함하는(또는 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진) 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 제공한다.

소정의 실시형태에서, 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)은 실질적으로 DMSO를 함유하지 않는다.

소정의 실시형태에서, 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)은 아미노산, 사이토카인, 지질, 성장 인자, 항생제, 항진균제, 스테로이드 호르몬, 단백질 호르몬, 또는 이들의 조합물을 더 포함한다.

소정의 실시형태에서, 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)은 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)를 더 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)에 존재한다.

소정의 실시형태에서, 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)은 저온보존된 상태에 있다.

본 개시내용은 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)를 저온보존하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)를 저온보존 조성물과 접촉/혼합/배합하는 단계(예를 들어, 혼합물을 형성하거나 배합물을 형성하기 위해), 및 (b) 저온보존 조성물 및 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)의 혼합물 또는 배합물을 동결시키는 단계를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물 및 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)의 혼합물 또는 배합물은 약 -70℃ 내지 약 -200℃의 범위의 온도에서 동결된다.

소정의 실시형태에서, 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 혼합물에 존재한다.

소정의 실시형태에서, 상기 방법은 저온보존 조성물 및 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)의 동결된 혼합물 또는 배합물을 해동하는 단계 (c)를 더 포함한다.

소정의 실시형태에서, 세포는 적어도 70%, 또는 적어도 80%의 해동 후 생존능력을 갖는다.

소정의 실시형태에서, 침투 저온보호제는 글라이세롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 사카라이드는 수크로스, 소르비톨, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 거대분자는 약 65킬로달톤(kDa) 내지 약 200kDa의 범위의 분자량을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 거대분자는 알부민, 젤라틴, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이다. 소정의 실시형태에서, 세포는 인간, 돼지, 개, 말 또는 소 세포이다. 소정의 실시형태에서, 세포는 종양 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 섬유아세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 줄기세포를 포함한다.

본 개시내용은 본 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 포함하는 키트를 제공한다.

도 1은 상이한 저온보존 조성물 CPA-1 내지 CPA-9를 사용한 후 해동 후 세포 생존능력을 보여준다(실시예 1 참조). DMEM을 대조군으로서 사용하였다.

본 개시내용은 침투 저온보호제, 사카라이드(예를 들어, 당) 및 거대분자를 포함하는 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물, 예컨대 어는 용액)을 제공한다. 저온보존 조성물은 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 조직 또는 기관)에 낮은 독성을 갖고, 저온보존의 공정 동안에 및 저온보존된 상태에서 생물학적 재료의 생존 및 생존능력의 보유를 촉진한다.

이후, 생물학적 재료는 다양한 조사 및 임상 환경에서, 예를 들어 보조 생식 기술에서 세포 기반 치료제에 대해, 또는 화학치료 또는 방사선 치료를 겪는 환자에 대해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 저온보존 조성물의 낮은 독성으로 인해, 세포를 갖는 조성물은 해동 후 대상체에게 투여될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 실질적으로 함유하지 않거나, DMSO를 포함하지 않거나, DMSO 비함유이다. 소정의 실시형태에서, 본 조성물은 다이메틸 설폭사이드(DMSO)의 사용에 의한 것과 필적하는 우수한 저온보호성 효과를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 본 조성물은 DMSO의 사용에 의한 것과 비교하여 동등하거나 더 양호한 저온보호성 효과를 나타낸다.

본 조성물 및 방법은, 동결 및 동결건조를 포함하여, 저체온 보존 또는 저온보존에 사용될 수 있다.

본 개시내용은 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v)의 하나 이상의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 1M의 하나 이상의 사카라이드; 및 (3) 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 거대분자를 포함하는 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)(여기서, %(w/v)의 단위 및 M의 단위는 보존 조성물의 전체 용적을 기준으로 함)을 제공한다.

소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v)의 하나 이상의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 1M의 하나 이상의 사카라이드; (3) 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 거대분자; 및 (4) 용매를 포함하는(또는 이들로 이루어지거나, 본질적으로 이들로 이루어진) 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 용매는 물, 완충제, 식염수 용액, 배양 배지, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 다른 용매이다.

소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v)의 하나 이상의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 0.5M의 하나 이상의 사카라이드; 및 (3) 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 거대분자를 포함하는 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 제공한다.

소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 (1) 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v)의 하나 이상의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 0.5M의 하나 이상의 사카라이드; (3) 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 거대분자; 및 (4) 용매를 포함하는(또는 이들로 이루어지거나, 본질적으로 이들로 이루어진) 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 용매는 물, 완충제, 식염수 용액, 배양 배지, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 다른 용매이다.

소정의 실시형태에서, 침투 저온보호제는 글라이세롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 또는 이들의 조합을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 거대분자는 약 30킬로달톤(kDa) 내지 약 500kDa, 약 40kDa 내지 약 400kDa, 약 50kDa 내지 약 300kDa, 약 60kDa 내지 약 300kDa, 약 65kDa 내지 약 200kDa, 약 65kDa 내지 약 150kDa, 약 65kDa 내지 약 100kDa, 또는 약 30kDa 내지 약 100kDa의 범위의 분자량(또는 평균 분자량)을 갖는다.

소정의 실시형태에서, 거대분자는 알부민, 젤라틴, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 (보존 조성물의 전체 용적의) 약 0.5%(w/v) 내지 약 80%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 70%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 60%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 50%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 30%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v), 약 5%(w/v) 내지 약 40%(w/v), 약 10%(w/v) 내지 약 40%(w/v), 약 20%(w/v) 내지 약 40%(w/v), 약 10%(w/v) 내지 약 30%(w/v), 약 10%(w/v) 내지 약 20%(w/v), 약 20%(w/v) 내지 약 30%(w/v), 또는 약 5%(w/v) 내지 약 50%(w/v)의 범위의 농도로 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 이것 초과의 침투 저온보호제를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 약 0.05M 내지 약 2M, 약 0.08M 내지 약 1.5M, 약 0.1M 내지 약 1.2M, 약 0.1M 내지 약 1.1M, 약 0.1M 내지 약 1M, 약 0.1M 내지 약 0.9M, 약 0.1M 내지 약 0.8M, 약 0.1M 내지 약 0.7M, 약 0.1M 내지 약 0.6M, 약 0.1M 내지 약 0.5M, 약 0.1M 내지 약 0.4M, 약 0.1M 내지 약 0.3M, 약 0.2M 내지 약 1M, 약 0.3M 내지 약 1M, 약 0.4M 내지 약 1M, 약 0.5M 내지 약 1M, 약 0.6M 내지 약 1M, 약 0.1M 내지 약 0.8M, 약 0.1M 내지 약 0.6M, 약 0.1M 내지 약 0.5M, 약 0.1M 내지 약 0.4M, 또는 약 0.1M 내지 약 0.3M의 범위의 농도로 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 이것 초과의 사카라이드 또는 당을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 (보존 조성물의 전체 용적의) 약 0.5%(w/v) 내지 약 20%(w/v), 약 0.6%(w/v) 내지 약 18%(w/v), 약 0.8%(w/v) 내지 약 16%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 15%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 12%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 7%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 1.2%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 약 1.5%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 또는 약 5%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 범위의 농도로 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 이것 초과의 거대분자를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바대로, 백분율 "%(w/v)"는 퍼센트 중량 대 용적(그램의 w 및 밀리리터의 v)이고; 백분율 "%(v/v)"는 퍼센트 용적 대 용적이고; 백분율 "%(w/w)" 또는 "중량%"는 퍼센트 중량 대 중량이다.

소정의 실시형태에서, 조성물은 약 300㎎/ℓ 내지 약 8,000㎎/ℓ, 약 500㎎/ℓ 내지 약 7,000㎎/ℓ, 약 1000㎎/ℓ 내지 약 6000㎎/ℓ, 약 1000㎎/ℓ 내지 약 4500㎎/ℓ, 약 500㎎/ℓ 내지 약 2300㎎/ℓ, 약 1,000㎎/ℓ, 약 4,500㎎/ℓ, 약 500㎎/ℓ, 또는 약 2,300㎎/ℓ의 글루코스를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물(예를 들어, 저온보존 조성물)은 아미노산, 사이토카인, 지질, 성장 인자, 항생제, 항진균제, 스테로이드 호르몬, 단백질 호르몬, 또는 이들의 조합물을 더 포함한다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물은 생물학적 재료(하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)를 더 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 약 10⁴개의 세포/㎖ 내지 약 10⁸개의 세포/㎖, 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖, 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁸개의 세포/㎖, 약 10⁴개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖, 약 10⁵개의 세포/㎖, 약 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 저온보존 조성물에 존재한다. 보존 조성물 중의 세포의 농도는 10⁸개의 세포/㎖ 초과 또는 10⁴개의 세포/㎖ 미만일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 보존 조성물 중의 세포의 농도는 세포 유형에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 난모세포에 대해, 세포의 농도는 낮고, 예를 들어 1개 미만의 세포/㎖만큼 낮을 수 있다. 농도는 특정한 세포 유형에 대해 당업자에 의해 결정될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물은 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 조직 또는 기관)를 포함하지 않는다.

본 개시내용은 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직, 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)를 저온보존하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직, 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)를 저온보존 조성물과 접촉/혼합/배합하는 단계(예를 들어, 혼합물을 형성하거나 배합물을 형성하기 위해), 및 (b) 저온보존 조성물 및 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)의 혼합물 또는 배합물을 동결시키는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물 및 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)의 혼합물 또는 배합물은 약 -70℃ 및 -200℃의 범위의 온도에서 동결된다.

본 방법은 (c) 저온보존 조성물 및 생물학적 재료(예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직(들), 기관(들), 및/또는 바이러스 입자)의 동결된 혼합물 또는 배합물을 해동하는 단계를 더 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포는 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 해동 후 생존능력을 갖는다.

소정의 실시형태에서, 세포는 종양 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 섬유아세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 줄기세포를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간, 돼지, 개, 말 또는 소 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함한다.

본 방법은 대상체(예를 들어, 환자)에게 해동된 생물학적 재료를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 미국 특허 공보 제20090130756호.

본 개시내용은 생물학적 재료를 보존(예를 들어, 저온보존)하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 본 보존 조성물을 생물학적 재료와 배합/혼합/접촉시키는 단계; (b) 혼합물을 냉각 및/또는 동결시키는 단계; 및 (c) (예를 들어, 적절한 저장 조건에서) 생물학적 재료를 저장하는 단계를 포함할 수 있다.

생물학적 재료는 보존 조성물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 보존 조성물은 생물학적 재료에 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법의 단계 (a)에서, 생물학적 재료(예를 들어, 세포)는 보존 조성물 중에 현탁될 수 있다.

생물학적 재료를 동결 또는 저장하기에 적합한 온도(들)는 변할 수 있다. 예를 들어, 세포는 약 -70℃ 내지 약 -200℃의 범위의 온도에서 동결 또는 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 액체 질소의 비점 이상에서, 즉 약 -196℃ 이상에서 동결 또는 저장될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 보존 조성물은 저체온 보존 조성물(예를 들어, 저체온 보존 용액)이다. 소정의 실시형태에서, 보존 조성물은 저온보존 조성물(예를 들어, 저온보존 용액)이다. 이러한 경우에, 용액은 예를 들어 어는 용액(이 경우에, 생물학적 재료는 동결됨) 또는 동결건조 용액(이 경우에, 생물학적 재료는 동결건조됨)일 수 있다.

소정의 실시형태에서, (생물학적 재료를 갖거나 갖지 않는) 본 저온보존 조성물은 저온보존된 상태(또는 동결된 상태)에 있거나, 저온보존된 상태로부터 해동되었다. 소정의 실시형태에서, (생물학적 재료를 갖거나 갖지 않는) 본 저온보존 조성물은 저체온 상태에 또는 동결 건조된 상태에 있다.

저온보존된 상태의 (생물학적 재료를 또한 포함하는) 저온보존 조성물은 저속 동결 또는 유리화작용에 의해 얻어질 수 있다. 미국 특허 제9,458,424호.

본 보존 조성물은 액체 또는 고체일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 예컨대 건조 형태(예를 들어, 분말, 정제, 과립 또는 임의의 다른 적합한 물리적 형태)의 또는 예를 들어 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X 등의 스톡 용액으로서 액체 형태의 농축물 조성물이다. 스톡 용액은 예를 들어 배양 배지, 생리학적 용액, 완충제, 물 등에 의해 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X 등으로 희석될 수 있다. 보존 조성물의 건조 형태는 예를 들어 배양 배지, 생리학적 용액, 완충제, 물 등을 첨가함으로써 액체로 전환될 수 있다(예를 들어, 배양 배지, 생리학적 용액, 완충제, 물 등 중에 예를 들어 용해됨).

소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 성분의 농도는 본 보존 조성물의 스톡 용액 중의 성분의 농도이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 성분의 농도는 본 보존 조성물의 작업 용액 중의 성분의 농도이다.

본 보존 조성물은 용액일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 성분(예를 들어, 하나 이상의 침투 저온보호제, 하나 이상의 사카라이드 및 하나 이상의 거대분자)의 수성 용액이다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물을 제조할 때, 본 명세서에 기재된 성분(예를 들어, 하나 이상의 침투 저온보호제, 하나 이상의 사카라이드 및 하나 이상의 거대분자)은 균형화된 전해질 용액(예를 들어, 식염수 용액, 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지) 중에 용해된다. 소정의 실시형태에서, 보존 용액은 노르말 삼투질농도를 유지시키기 위해 전해질(예컨대, 나트륨, 칼륨, 및/또는 클로라이드 이온)의 적절한 농도를 갖는다. 일 실시형태에서, 식염수 용액은 인산염 완충 식염수 용액(PBS)이다. 일 실시형태에서, 식염수 용액은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 인산칼륨, 염화칼슘 및 중탄산나트륨.

본 보존 조성물은 완충제 시스템(예를 들어, 생리학적 완충제)을 포함할 수 있다. 본 보존 조성물은 균형 염 용액 또는 임의의 생리학적 용액을 포함할 수 있다.

완충제 시스템의 비제한적인 예는 인산 완충제(예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS)), BES, TES, 아세트아미도글라이신, 글라이신 아마이드, 글라이실글라이신, TRICINE, TALP, 트리스-에탄올아민, 베로날 및 HEPES를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물 중의 완충제의 농도는 약 1mM 내지 약 1000mM, 약 1mM 내지 약 200mM, 약 5mM 내지 약 200mM, 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 범위이다.

배양 배지의 비제한적인 예는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Media: DMEM), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium: MEM), 넉아웃-DMEM(KO-DMEM), 글래스고 최소 필수 배지(Glasgow Minimal Essential Medium: G-MEM), 이글스 기본 배지(Basal Medium Eagle: BME), DMEM/Ham F12, 어드밴스트 DMEM/Ham F12, 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지 및 최소 필수 배지(MEM), Ham F-10, Ham F-12, Medium 199, RPMI 1640 배지, 및 이들의 조합 및/또는 이들의 변형을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물은 실온 또는 상온(예를 들어, 25℃)에서 약 6.0 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8, 약 6.9 내지 약 7.5, 또는 약 7.2 내지 약 7.4의 범위의 pH를 갖는다.

소정의 실시형태에서, 보존 조성물은 단일 형태로 패키징된다. 일 실시형태에서, 저온보존 조성물은 10㎖, 50㎖, 100㎖, 500㎖ 또는 1ℓ의 용적으로 패키징된다. 소정의 실시형태에서, 보존 조성물은 1X, 5X, 10X 또는 20X 용액으로서 패키징된다.

본 조성물은 본 명세서에 기재된 성분을 혼합함으로써 고체 형태로 또는 물, 완충제, 용액, 배양 배지 등 중에 성분을 용해시킴으로써 수성 용액으로서 얻어질 수 있다.

정의

용어 "저온보존"은 이의 생물학적 활성이 상당히 감소하지만, 그럼에도 불구하고 이것이 생존 가능하게 있고, 보존 상태로부터 꺼내질 때 본질적으로 정상인 생물학적 활성을 재개할 수 있는, 조건 하에 생물학적 재료를 유지시키는 공정이다. 보존의 구체적인 예는 저온보존 및 저체온 보존이다.

용어 "보존 조성물"은 생물학적 재료가 이의 생존능력을 보유하도록 생물학적 재료의 보존을 허용하는 조성물(또는 희석 또는 용해될 때 조성물)에 관한 것이다. 보존 조성물의 구체적인 실시형태는 저온에서 생물학적 재료를 보존하기 위한 것이다. 소정의 실시형태에서, 보존 조성물은 보존 용액이다. 저체온 보존 조성물 및 저온보존 조성물은 보존 조성물의 예이다.

용어 "저온보존"은 생물학적 재료(또는 생물학적 재료 및 보존 조성물의 혼합물)의 동결 온도 초과인 온도로부터 그 동결 온도 미만인 온도로 생물학적 재료의 온도를 감소시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 공정을 의미한다. 저온보존은 동결, 유리화작용 및 동결건조를 포함한다. 용어 "세포의 저온보존"은 하위배양 없이 원하는 시간 기간에 걸쳐 세포를 유지시킬 목적을 위해 세포를 동결하고 보존시키는 것을 의미한다.

용어 "저온보존 조성물", "저온보존 배지" 또는 "동결 조성물"은 생물학적 재료가 저온보존 또는 동결 전에 액침된 조성물 또는 배지(또는 희석 또는 용해될 때 조성물), 또는 동결 전에 세포 또는 조직을 처리하기 위해 사용될 수 있는 조성물 또는 배지를 의미한다. 저온보존 조성물은 하나 이상의 저온보호제를 함유한다. 소정의 실시형태에서, 저온보존 용액은 어는 용액, 유리화작용 용액, 동결건조 용액 및/또는 이러한 용액의 혼합물일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물은 저온보존 용액이다. 소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물은 약 8℃ 이하, 약 4℃ 이하, 약 0℃ 이하, 약 -20℃ 이하, 약 -70℃ 이하, 약 -135℃ 이하, 약 -196℃ 이하의 온도에서, 또는 액체 질소 중에 생물학적 재료를 저장하거나 동결시키기 위한 조성물 또는 배지를 의미한다.

용어 "적절한 동결 조건" 또는 "적절한 저온보존 조건"은 생존가능 상태로 생물학적 재료를 유지시키는 동결 조건을 의미한다.

용어 "저체온 보존"은 생리학적 온도 미만이지만 동결 초과인 온도에서의 보존을 의미하고, 여기서 생물학적 과정은 느려져서 생물학적 재료의 연장된 저장(예를 들어, 8℃ 미만 및 0℃ 초과, 또는 4℃ 내지 8℃)을 허용한다.

용어 "저체온 보존 조성물"은 생물학적 재료가 8℃ 미만의 온도를 견디게 하는 성분 및 이러한 온도에서 이의 생존능력을 지속시키도록 필요한 대사물질을 포함하는 보존 조성물을 의미한다.

용어 "유리화작용"은 임의의 결정질 구조가 없는 유리 유사 비결정질 고체로 재료를 전환시키는 과정을 의미한다. 유리질 고화는 유리 전이 온도에서 생긴다.

용어 "비선형 냉각"은 설계에 의해 온도 대 시간이 단일 직선 또는 상이한 기울기를 갖는 2개 선분으로 이루어진 프로필이 아닌 저온보존의 공정을 의미한다. 일 실시형태에서, 비선형 냉각 저온보존 방법은 적어도 방법의 일부 동안 비일정한 냉각 속도에 의해 달성된다. 또 다른 실시형태에서, 비선형 저온보존 방법은 2단계 냉각 공정에 의해 달성되고, 여기서 세포 또는 조직은 일정한 또는 비일정한 속도에서 제1 온도로 냉각되고, 이후 후속하여 일정한 또는 비일정한 속도에서 제2 온도(예를 들어, 저장 온도)로 냉각된다.

"저장 온도"는 생물학적 재료가 저장되는 온도이다. 소정의 실시형태에서, 저장 온도는 약 8℃ 이하, 약 4℃ 이하, 약 0℃ 이하, 약 -20℃ 이하, 약 -60℃ 이하, 약 -70℃ 이하, 약 -135℃ 이하, 약 -196℃ 이하이거나, 액체 질소 중이다.

용어 물질이 "실질적으로 함유하지 않음"은 물질을 함유하지 않음, 또는 보존 조성물에 존재하는 물질의 임의의 양이 이것을 보존 조건에서 꺼낸 후 보존 공정, 보존 공정의 결과 또는 생물학적 재료의 특성(예를 들어, 살아 있는 물질의 생존능력, 예를 들어 세포(이것이 이러한 재료에 포함되면))에 어떠한 효과를 갖지 않도록 낮다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 소정의 실시형태에서, 용어 물질의 "실질적으로 함유하지 않음"은 물질이 약 5% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 4% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 3% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 2% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 1% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 0.5% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 0.2% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 0.1% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 0.05% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 약 0.02% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v), 또는 약 0.01% w/w 미만(또는 % w/v, 또는 % v/v)이라는 것을 의미한다.

숫자 값의 언급에서 용어 "약"은 기재된 숫자 값의 +10%를 의미한다. 다른 말로, 숫자 값은 기재된 값의 90% 내지 기재된 값의 110%의 범위일 수 있다.

저온보호제

용어 "저온보호제" 또는 "저온보호 물질"은 본 명세서에서 얼음 핵형성, 얼음-결정 성장, 얼음 형성, 또는 임의의 이들의 조합을 느리게 하거나 방지하는 화합물을 의미한다. 저온보호제는 저온보존 하에 생물학적 재료의 생존능력을 유지시키고 저온보존에서 생길 수 있는 손상으로부터 생물학적 재료를 막는 것을 돕는다.

저온보호제는 침투 저온보호제 및 비침투 저온보호제를 포함한다.

침투 저온보호제는 세포막을 침투하고 세포내 존재할 수 있는 저온보호제이다. 침투 저온보호제의 비제한적인 예는 글라이세롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜(1,2-프로판다이올, 프로판-1,2-다이올) 및 DMSO를 포함한다.

비침투 저온보호제는 세포막을 침투하지 않고 세포외 용액에 있는 저온보호제이다. 비침투 저온보호제의 비제한적인 예는 고분자량 분자, 예컨대 사카라이드(예를 들어, 수크로스, 트레할로스, 말토스), 당, 전분(예를 들어, 하이드록시에틸 전분), 단백질(예를 들어, 알부민, 예컨대 혈청 알부민), 퍼콜, 피콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐알코올(PVA), 혈청, 혈장 및 다른 거대분자를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 조성물은 약 342달톤(수크로스의 분자량임) 이상의 분자량을 갖는 비침투 저온보호제를 포함한다.

저온보호제의 비제한적인 예는 또한 메톡실화 화합물, 에탄올, 2-메톡시 에탄올, 1,2-다이메톡시에탄, 1-메톡시]-2-프로판올, 및 글라이세롤 유도체, 예컨대 3-메톡시-1,2-프로판다이올 또는 1,3-다이메톡시-2-프로판올을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 조성물은 저온보호제로서 하나 이상의 메톡실화 화합물을 포함하거나 이것이 없다. 소정의 실시형태에서, 본 조성물은 저온보호제로서 하나 이상의 다이올을 포함하거나 이것이 실질적으로 없다.

본 조성물은 하나 이상의 침투 저온보호제, 하나 이상의 비침투 저온보호제, 또는 하나 이상의 침투 저온보호제 및 하나 이상의 비침투 저온보호제의 조합을 포함할 수 있다.

사카라이드

사카라이드는 올리고당, 예컨대 단당류 및 이당류, 다당류 등을 포함한다. 사카라이드는 당을 포함한다.

사카라이드의 비제한적인 예는 수크로스, 소르비톨, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 트레할로스, 만노스, 라피노스, 스타키오스, 덱스트란, 자일로스, 아라비노스, 만니톨, 자일리톨, 미요-이노시톨, 락토스, 말토스, 셀로비오스, 락티톨, 말티톨, 메틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 글라이코겐, 아밀로스, 아밀로펙틴, 이눌린, 나트륨 알기네이트, 에틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 잔탄검, 글루코사민, 갈락토사민, 및 이들의 조합물을 포함한다. 미국 특허 제6,673,607호 및 제7,094,601호.

알부민

알부민의 비제한적인 예는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HSA), 혈장 알부민(예를 들어, 인간 혈장 알부민), 소 혈청 알부민, 및/또는 합성 혈청 알부민), 난알부민, 식물 알부민, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 알부민의 비제한적인 예는 또한 소 태아 혈청을 포함한다.

알부민은 (예를 들어, 천연 소스로부터 정제된) 천연 기원 또는 재조합 기원(재조합 알부민)일 수 있다. 일 실시형태에서, 알부민은 인간 기원의 생물학적 재료로부터의 정제에 의해 제조된다. 이것은 혈액으로부터 얻은 혈장의 분별화를 위한 종래의 기법(Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459 pp), 또는 문헌[J. Liautaud et al. (13th International IABS Conference, Budapest; A: "Purification of proteins. Development of biological standard", Karger (ed.), Bale, 27 (1973) 107 pp)]에 기재된 기법에 따라 인간 태반으로부터의 추출에 의해 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 재조합 알부민은 진핵생물 숙주에서 제조된다.

일 실시형태에서, 용어 "알부민"은 이 단백질의 다형으로부터 생긴 인간 알부민의 임의의 천연 변이체를 포함한다.

젤라틴

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물 중의 젤라틴은 약 15킬로달톤(kD) 내지 약 40kD, 약 25kD 내지 약 40kD, 약 25kD 내지 약 50kD, 약 25kD 내지 약 45kD, 약 40kD 내지 약 50kD, 약 10kD 내지 약 100kD, 약 40kD 내지 약 100kD, 약 50kD 내지 약 100kD, 약 100kD 내지 약 200kD, 약 100kD 내지 약 250kD, 약 80kD 내지 약 200kD, 약 150kD 내지 약 200kD, 약 100kD 내지 약 150kD, 또는 약 50kD 내지 약 200kD의 범위의 분자량(또는 중량 평균 분자 질량, 또는 평균 분자 질량)을 갖는다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴은 약 4.5 내지 약 9, 약 5 내지 약 9, 약 5 내지 약 7, 약 6 내지 약 7, 약 5 내지 약 6, 약 7 내지 약 9, 또는 약 4.7 내지 약 5.2의 범위의 등전점(pI)을 갖는다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴은 포유류 조직으로부터 유래된다. 소정의 실시형태에서, 젤라틴은 동물 콜라겐으로부터 얻어진다. 소정의 실시형태에서, 젤라틴은 동물, 예컨대 소, 닭, 돼지 및 어류의 가죽, 골, 연결 조직, 힘줄, 인대 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 원료로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 소 소스, 돼지 소스, 또는 이들의 조합 기원이다. 소정의 실시형태에서, 젤라틴은 소 골, 돼지 가죽, 소 가죽, 돼지고기, 소 생가죽, 및/또는 어피로부터 기원한다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 가죽 유래 젤라틴, 및/또는 소 유래 젤라틴이다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴은 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 제조된 단백질 및 펩타이드의 혼합물이다. 소정의 실시형태에서, 젤라틴은 콜라겐의 가수분해된 형태이다. 소정의 실시형태에서, 젤라틴은 변성된 콜라겐의 형태이다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴은 A형 젤라틴 또는 B형 젤라틴일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바대로, A형 젤라틴은 산 처리된 원료로부터 얻어진 젤라틴이고; B형 젤라틴은 알칼리 처리된 원료로부터 얻어진 젤라틴이다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴을 제조하기 위해, 콜라겐 가수분해는 화학 가수분해, 및/또는 열 가수분해에 의해 수행된다. 일 실시형태에서, 콜라겐은 젤라틴을 제조하기 위해 (예를 들어, 물 중에) 비등되거나 (광범위하게) 가열된다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴을 제조하기 위해, 콜라겐 가수분해는 산-가수분해, 알칼리-가수분해, 및/또는 효소 가수분해에 의해 수행된다.

소정의 실시형태에서, 젤라틴의 제조 공정은 3개의 주요 단계를 함유한다: 전처리, 주요 추출 단계, 및 정련 및 회수 처리. 전처리는 주요 추출 단계에 원료가 준비되게 하고, 최종 젤라틴 생성물의 물리화학 특성에 부정적인 효과를 가질 수 있는 불순물을 제거한다. 주요 추출 단계는 젤라틴으로 콜라겐을 가수분해하기 위해 다단계 추출로서 뜨거운 물 또는 희석 산 용액에 의해 수행될 수 있다. 정련 및 회수 처리는 젤라틴 용액으로부터 물을 제거하기 위해, 추출하고자 하는 젤라틴을 블렌딩하기 위해, 그리고/또는 건조되고 블렌딩되고 분쇄된 최종 생성물을 얻기 위해 여과, 청징, 증발, 살균, 건조, 러팅(rutting), 분쇄 및/또는 체질을 포함한다.

다른 성분

소정의 실시형태에서, 본 조성물은 아미노산, 사이토카인, 지질, 성장 인자, 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등), 항진균제, 스테로이드 호르몬, 단백질 호르몬, 혈청, 단백질, 염, 폼아마이드, 메톡실화 화합물, 및/또는 중합체(예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리비닐 알코올)를 더 포함할 수 있다.

아미노산

본 보존 조성물은 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.

아미노산은 광학 이성질체, 즉 D-이성질체 및 L-이성질체 둘 다를 포함한다. 아미노산은 알파-아미노산, 및 베타-아미노산, 감마-아미노산, 델타-아미노산, 및 비천연 아미노산을 포함한다. 아미노산의 비제한적인 예는 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴, 타이로신, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 및 이들의 조합물을 포함한다[Cryobiology, 41(4):257-279 (2000)].

아미노산 유도체는 본 조성물 및 방법에서 또한 사용될 수 있다. 아미노산 유도체의 비제한적인 예는 아미노산 염 및 아미노산 용매화물을 포함한다. 아미노산 염의 비제한적인 예는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 및 칼슘염; 할로겐산 염, 예컨대 하이드로플루오르산 염, 하이드로클로르산 염, 하이드로브롬산 염 및 하이드로요오드산 염; 무기산염, 예컨대 질산염, 과염소산염, 황산염 및 인산염; 및 유기산염, 예컨대 퓨마르산염, 석신산염, 시트르산염, 옥살산염, 말레산염, 아세트산염, 락톤염 및 아스코르브산염을 포함한다. 아미노산 용매화물의 비제한적인 예는 수화물, 알코올레이트(예를 들어, 메탄올레이트, 에탄올레이트) 및 에터레이트(예를 들어, 다이에틸 에터레이트)를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물 내의 아미노산 농도는 0.01 내지 10.0중량%, 또는 0.1 내지 1.0중량%이다.

DMSO

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 다이메틸 설폭사이드(DMSO)가 실질적으로 없거나, DMSO를 포함하지 않거나, DMSO 비함유이다.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물은 DMSO를 포함한다. 다양한 실시형태에서, DMSO의 농도는 약 4%(v/v) 이하, 약 3%(v/v) 이하, 약 2%(v/v) 이하, 약 1%(v/v) 이하, 약 0.5%(v/v) 이하, 약 0.1%(v/v) 이하, 약 0.05%(v/v) 이하, 약 0.02%(v/v) 이하, 또는 약 0.01%(v/v) 이하이다.

비타민

또 다른 실시형태에서, 보존 조성물은 하나 이상의 비타민을 더 포함한다. 비타민의 비제한적인 예는 D-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, 니아신아마이드, 피리독신 HCl, 티아민 HCl 및 리보플라빈을 포함한다.

염

소정의 실시형태에서, 본 조성물은 하나 이상의 염, 예를 들어 무기 염, 및/또는 유기 염을 더 포함한다. 무기 염의 비제한적인 예는 염화칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨 및 일염기성 인산나트륨, 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 중탄산칼륨, 칼륨 모노포스페이트, 및 이들의 조합물을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 조성물은 혈청을 포함하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 직접적인 인간 또는 동물 기원의 임의의 원료, 또는 인간 또는 동물 기원의 재료를 사용하여 제조된 재료를 포함하지 않는다.

일 실시형태에서, 본 조성물은 복수의 나노입자 마이크로입자, 나노관, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 나노입자, 마이크로입자 또는 나노관은 탄소 또는 귀금속(예를 들어, 금, 은, 티탄, 팔라듐, 백금 및 구리) 나노입자, 마이크로입자 또는 나노관을 포함한다. Choi et al., Applied Physics Letter 79: 2252-2254, 2001; Eastman et al., Applied Physics Letter 78: 718-720, 2001.

본 보존 조성물은 다른 선택적인 성분, 예를 들어 펩타이드, 다른 단백질, 당 알코올, 아미노 사카라이드, 당단백질, 및 알코올, pH 조절제, 보습제, 보존제, 점도 조절제, 또는 이들의 조합(이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 미국 특허 제9,055,739호.

저온보존

본 개시내용은 저온보존 조성물 및 생물학적 재료를 저온보존하기 위한 방법을 제공한다.

본 방법은 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 바이러스 입자)를 저온보존 조성물와 접촉/배합하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 이 접촉/배합/혼합 단계는 저온보존 조성물을 세포에 첨가하는 것 및 세포를 저온보존 조성물과 혼합하는 것을 수반한다. 본 방법의 이 단계(예를 들어, 단계 (a))는 배지 중의 현탁액 중의 세포의 혼합물(예를 들어, 액체 혼합물)의 수득을 발생시킬 수 있다.

본 개시내용은 저온보존 조성물에 세포를 배치하는 단계 및 저온보존 조성물 중에 있는 세포를 저온보존하는 단계를 포함하는 세포를 저온보존하는 방법을 제공한다.

소정의 실시형태에서, 세포가 저온보존을 위해 처리될 때, 세포가 액체 상태의 저온보존 조성물 중에 현탁된 후, 생성된 현탁액은 저온보존을 위한 조건 하에 이를 유지시킴으로써 동결된다. 세포가 필요할 때, 세포 및 저온보존 조성물의 동결된 혼합물은 해동 공정으로 처리되고, 이후 세포는 회수될 수 있다.

소정의 실시형태에서, (예를 들어, 세포 현탁액을 형성하기 위해) 기질로부터 부착성 또는 반부착성 세포를 탈착시키기 위해, 세포를 효소, 예컨대 단백분해효소(예를 들어, 트립신)에 의해 처리한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 기질로부터 헐거운 세포를 기계적으로 긁어냄으로써 배양 기질(예를 들어, 세포 배양 접시, 플라스크 등)로부터 탈착된다. 소정의 실시형태에서, (예를 들어, 세포 현탁액을 형성하기 위해) 기질로부터 부착성 또는 반부착성 세포를 탈착시키기 위해, 세포를 화학물질(예를 들어, 세제)에 의해 처리한다. 소정의 실시형태에서, 화학 또는 효소 처리의 경우에, 세포를 이후 원심분리하고 세척하여 효소 또는 세제를 제거한다.

세포 및 저온보존 조성물을 다수의 방법에 따라 물리적으로 배합할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포는 저온보존 조성물과의 배합 전에 세포 현탁액에 존재한다. 일 실시형태에서, 세포를 저온보존 조성물과 배합하는 단계는 세포 현탁액 중에 저온보존을 위한 세포를 제공하는 단계 및 저온보존 조성물을 (혼합에 의해 또는 혼합 없이) 세포 현탁액에 첨가하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포를 저온보존 조성물과 배합하는 단계는 세포 현탁액 중에 저온보존을 위한 세포를 제공하는 단계 및 저온보존 조성물을 (혼합에 의해 또는 혼합 없이) 세포 현탁액에 첨가하는 단계를 포함한다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 배지는 증가하는 농도의 단계별 증가로 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 바이러스 입자)에 첨가될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 전에, 세포 배양 배지는 저온보존에 필요한 모든 성분을 포함하도록 변형되고, 이후 세포는 배양 기질(예를 들어, 세포 배양 접시, 플라스크 등)로부터 제거된다.

소정의 실시형태에서, 생물학적 재료와 혼합/배합될 때 또는 이것 전에, 저온보존 조성물의 온도는 약 4℃ 내지 약 45℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 33℃ 내지 약 38℃의 범위, 또는 약 37℃이다.

소정의 실시형태에서, 세포 및 저온보존 배지의 혼합물은 혼합물을 동결시키기 전에 평형화된다. 예를 들어, 혼합물은 약 10초 내지 약 1시간, 약 20초 내지 약 50분, 약 20초 내지 약 40분, 약 30초 내지 약 30분, 약 30초 내지 약 20분, 약 30초 내지 약 10분, 약 30초 내지 약 5분, 약 30초 내지 약 2분, 약 30초 내지 약 1분, 약 1분 내지 약 40분, 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 10분의 범위의 시간 기간 동안 평형화된다.

소정의 실시형태에서, 혼합물을 동결시키기 전에, 세포 및 저온보존 배지의 혼합물을 약 4℃ 내지 약 45℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 33℃ 내지 약 38℃의 범위, 또는 약 37℃의 온도에서 평형화시킨다.

추가의 단계에서, 본 방법은 생물학적 재료 및 저온보존 조성물의 혼합물을 동결시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 생물학적 재료를 포함하는 혼합물을 동결 용기로 옮기고, 이것은 이후 영하 온도로 옮긴다. 적합한 용기는 Mr. Frosty(등록상표) 동결 용기(Thermo Scientific)를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 동결기에 배치될 때, 이러한 용기는 고정된 냉각 속도를 제공하는 것을 도울 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 방법은 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 바이러스 입자)를 본 보존 조성물과 배합하는 단계 및 배합된 생물학적 재료 및 본 보존 조성물을 저온보존 조건으로 처리하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "저온보존 조건"은 세포를 저온보존하기 위해 당해 분야에서 유용하다고 통상적으로 인식되는 조건의 임의의 세트를 의미한다. 일 실시형태에서, 저온보존 조건은 저온보존 온도, 또는 세포사를 발생시키는 세포 내의 생화학 반응(이것으로 제한되지는 않음)을 포함하는 세포 내의 생물학적 활성을 느리게 하거나 중지시키도록 충분히 0℃ 미만인 온도를 제공하는 환경을 의미할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 저온보존 온도는 약 0℃ 이하, 약 -20℃ 이하, 약 -50℃ 이하, 약 -60℃ 이하, 약 -70℃ 이하, 약 -80℃ 이하, 약 -90℃ 이하, 약 -100℃ 이하, 약 -110℃ 이하, 약 -120℃ 이하, 약 -135℃ 이하, 약 -196℃ 이하의, 또는 액체 질소 중의 온도를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "저온보존된 상태"는 저온보존된 온도에 있는 상태를 의미한다.

본 개시내용에 따른 동결 건조 및 저온보존은 생물학적 재료에 적합한 임의의 방법에서 수행될 수 있다. 본 개시내용의 상기 방법의 동결은 당해 분야에 공지된 임의의 방법 또는 장치에서 수행될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 방법은 생물학적 재료의 저속 동결을 포함한다. 일 실시형태에서, 저속 동결을 위해, 생물학적 재료는 처음에 -50℃ 미만, -70℃ 미만의 온도, 또는 -70℃ 내지 -100℃의 온도로 제어된 속도로 냉각되고; 선택적으로 예를 들어 액체 질소(N₂)로의 생물학적 재료의 이동에 의해 생물학적 재료가 더 냉각된다. 소정의 실시형태에서, 제어된 속도는 약 -0.1℃/분 내지 약 -10℃/분, 약 -0.2℃/분 내지 약 -5℃/분, 또는 약 1℃/분의 냉각 속도이다.

소정의 실시형태에서, 생물학적 재료를 갖는 저온보존 조성물을 갖는 동결 용기는 시간 기간 동안(예를 들어, 밤새) -70℃ 내지 -100℃, 또는 -80℃의 온도에 배치된다. 이후, 용기를 약 -196℃에서 액체 질소(N₂)로 옮길 수 있다.

소정의 실시형태에서, 생물학적 재료를 갖는 저온보존 조성물을 갖는 동결 용기는 시간 기간 동안(예를 들어, 밤새) -70℃ 내지 -100℃, 또는 -80℃의 온도에 있다. 이후, 용기를 약 -196℃에서 액체 질소(N₂)로 옮길 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 방법은 생물학적 재료의 유리화작용을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 이후 약 30,000 내지 약 100,000,000℃/분, 약 50,000℃/분 이상, 약 100,000℃/분 이상, 약 200,000℃/분 이상, 약 350,000℃/분 이상, 또는 약 1,000,000℃/분 이상의 속도로 냉각된다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 -80℃(예를 들어, 드라이 아이스) 이하, -100℃ 이하, -196℃(예를 들어, 액체 질소), 또는 -205℃(예를 들어, 액체 및 고체 질소의 혼합물인 슬러시 질소)의 온도에 노출된다.

소정의 실시형태에서, 연속 온도 제어는 저온보존 또는 소생 공정 동안 제공될 수 있다. 미국 특허 제9,485,984호.

일 실시형태에서, 본 방법은 세포를 제1 온도로 냉각시키는 것, 제1 시간 기간 동안 그 제1 온도에서 유지시키는 것, 이후 세포를 저장하기 위한 제2 온도로 세포를 냉각시키는 것을 포함하는 세포를 저온보존하는 단계별 방법을 포함한다.

일 실시형태에서, 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 바이러스 입자 등)는 저온보존 조성물 중에 현탁되고, 이렇게 제조된 현탁액은 동결 관(예를 들어, 저온관, 저온바이알 등)에 분배되고, 생성된 관은 생물학적 재료를 동결시키도록 (예를 들어, -80℃에서의) 극저온 동결기에 바로 배치된다. 일 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 -80℃에서의 동결기에서 바로 동결된다.

몇몇 실시형태에서, 동결 단계 및/또는 해동 단계의 매개변수는 온도 상승 및/또는 하강 속도가 생물학적 재료의 통합성을 파괴하지 않고, 해동 후 생물학적 재료의 생존능력 또는 기능에 부정적으로 영향을 미치지 않도록 최적화된다.

몇몇 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 선택된 온도 감소 속도를 갖는 온도 하강 단계에서 냉각된다. 몇몇 실시형태에서, 온도 하강 단계에서의 온도 감소의 속도는 분당 약 10℃, 분당 약 1℃, 분당 약 2℃, 분당 약 5℃, 분당 약 7℃, 분당 약 12℃, 분당 약 15℃, 분당 약 17℃, 분당 약 20℃, 또는 상기 값 내의 속도이다. 몇몇 실시형태에서, 온도 하강 단계는 10초당 대략 10℃, 20초당 10℃, 30초당 10℃, 40초당 10℃, 50초당 10℃, 60초당 10℃, 70초당 10℃, 80초당 10℃, 90초당 10℃, 100초당 10℃, 110초당 10℃, 120초당 10℃, 130초당 10℃, 140초당 10℃, 150초당 10℃, 160초당 10℃, 170초당 10℃, 180초당 10℃, 190초당 1℃, 또는 200초당 10℃의 속도로 생물학적 재료를 냉각시키는 것을 포함할 수 있다.

소정의 실시형태에서, 온도 하강 단계는 플래시 동결(예를 들어, 최대 온도 감소) 단계를 포함할 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 방법의 동결 단계는 비선형 냉각을 포함한다. 비선형 냉각 저온보존 프로토콜은 벌크 동결 유닛 또는 저온현미경검사 장치 또는 다른 적합한 장치, 예를 들어 미리 결정된 냉각 프로필에 따라 세포를 냉각시키도록 프로그래밍될 수 있는 프로그래밍 가능한 유전자증폭기를 갖는 것을 사용하여 수행될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 방법의 동결 단계는 생물학적 재료를 제1 시간 기간 동안 제1 온도로 냉각시키는 것, 이후 세포를 저장하기 위한 제2 온도로 세포를 냉각시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 약 -3℃ 내지 -30℃의 온도에서 냉각되고, 1분 내지 30분 동안 그 온도에서 유지되고, 이후 세포를 저장하기 위해 -60℃ 미만의 온도로 냉각된다. 미국 특허 제9,078,429호.

일 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 저온보존 조성물 중에 배치하는 단계 및 조성물이 4℃의 시작 온도를 달성하게 하는 단계를 포함한다. 세포를 포함하는 조성물이 시작 온도를 달성하면, 이는 약 15분 동안 그 온도에서 유지된다. 이후, 세포 조성물이 약 -3℃의 온도를 달성할 때까지 세포는 약 -1℃/분의 속도로 냉각된다.

일 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 저온보존 조성물 중에 배치하는 단계 및 조성물이 4℃의 시작 온도를 달성하게 하는 단계를 포함한다. 이후, 세포는 4℃ 내지 -45℃에서 1℃/분의 속도로 냉각된다. 이후, 조성물이 약 -45℃의 온도에 있으면, 세포 조성물이 약 -120℃의 저장 온도를 달성할 때까지 조성물은 더 냉각된다.

일 실시형태에서, 저온보존에서의 세포 현탁액은 저온관 또는 저온바이알 등에 분포되고, 이것은 이후 동결 용기에 배치된다. 동결 용기를 약 1시간 동안 4℃로 옮기고, 이후 적어도 12시간 또는 적어도 24시간 동안 약 -80℃에서 챔버에 배치한다. 이후, 저온관을 액체 질소에서 저장한다.

몇몇 실시형태에서, 생물학적 재료를 선택적으로 원하는 시간 기간 동안 중간 저장 온도로 처리한다. 중간 저장 온도는 약 0℃ 내지 약 -100℃, 약 -50℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -70℃, 약 -70℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -90℃, 약 -90℃ 내지 약 -100℃의 범위, 및 이의 중첩 범위일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 생물학적 재료는 더 장기간의 저장으로 옮겨지기 전에 시간 기간 동안 중간 저장 온도에서 저장된다. 예를 들어, 세포는 장기간 저장 동안 액체 질소로 옮겨지기 전에 밤새 또는 임의의 다른 적합한 시간 기간에 중간 저장 온도에서 유지될 수 있다. 다른 실시형태에서, 다른 온도(예를 들어, -20℃, -30℃, -40℃, -50℃, -60℃ 등에서의 저장)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 다수(2개, 3개, 4개, 5개 또는 이것 초과)의 중간 저장 온도를 갖는 다단계 "스텝다운" 절차를 이용한다.

저온보존 조성물 내의 생물학적 재료의 동결은 프로그래밍된 동결기를 사용하여 수행될 수 있다. 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료의 동결은 프로그래밍된 동결기를 사용하지 않고 수행될 수 있다.

동결은 방향성 동결, 정지상 동결 등일 수 있다.

동결 방법의 비제한적인 예는 방향성 동결 장치의 사용, 기계적 동결기의 사용, 단계별 동결 장치의 사용, 슬러시 동결, 극저온 유체에서의 동결, 제어된 속도 동결기에서의 동결, 액체 욕 동결기의 사용, 냉풍 동결기의 사용 등을 포함한다. 미국 특허 제5,827,741호 및 제6,723,497호.

저온보존된 상태를 유지시키기 위해 연장된 영하 온도를 제공할 수 있는 임의의 동결 장치를 사용할 수 있다. 동결 및 저장은 동일한 장치에서 수행될 수 있거나, 제1 동결 장치는 동결된 샘플의 장기간 저장 장치로의 이동 전에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 액체 질소 저장 용기를 사용한다. 소정의 실시형태에서, 더 복잡한 냉각 장치, 예컨대 프로그램 가능한, 속도 제어된 플레이너(Planer) 동결기(Planer Products)를 수반하는 수동 동결 방법을 이용한다. 미국 특허 제8,512,941호.

저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 필요할 때까지 임의의 시간 기간 동안 저온보존된 상태에서 저장될 수 있다. 세포가 저장 온도에 있을 때, 이것은 원하는 기간, 예컨대 약 1시간 내지 5시간, 약 5시간 내지 12시간, 약 12시간 내지 24시간, 약 24시간 내지 48시간, 약 48시간, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 또는 이것 초과 동안 저장될 수 있다. 미국 특허 공보 제20170202212호.

해동

생물학적 재료를 보존하기 위한 적절한 저장 조건은 생물학적 재료 생존가능을 유지시키는 임의의 이러한 조건을 포함할 수 있다. 이러한 조건은 약 0℃ 이하, 약 -20℃ 이하, 약 -50℃ 이하, 약 -60℃ 이하, 약 -70℃ 이하, 약 -80℃ 이하, 약 -90℃ 이하, 약 -100℃ 이하, 약 -110℃ 이하, 약 -120℃ 이하, 약 -135℃ 이하, 약 -196℃ 이하의, 또는 액체 질소 중의 저온보존 온도를 포함할 수 있다. 저체온 보존을 위해, 온도는 8℃ 내지 0℃일 수 있다. 동결건조된 샘플의 경우에, 온도는, 재료가 습도로부터 멀리 있는 한, 0℃ 초과(예를 들어, 실온, 상온 등) 또는 0℃ 미만의 임의의 온도일 수 있다.

생물학적 재료는 생물학적 재료가 필요할 때까지 일, 주, 개월 또는 년의 기간 동안 보존된 상태(예를 들어, 저온보존된 상태)에 있을 수 있다. 필요할 때, 저온보존된 생물학적 재료는 회수되고 해동된다.

소정의 실시형태에서, 본 방법은 더 특히 세포 생존능력을 유지시키는 조건 하에 동결된 조성물을 해동하는 단계를 더 포함한다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 약 42℃ 이하, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 실온, 또는 약 37℃의 온도에서 (예를 들어, 물 욕 내에 저온관 또는 저온바이알을 배치함으로써) 물 욕 내에 해동된다.

일 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 생물학적 재료는 약 37℃에서 물 욕 내에 해동된다. 선택적으로, 이것은 더 낮은 온도, 예컨대 4℃로 또는 얼음에서 이후 이동될 것이다.

소정의 실시형태에서, 증가 가열 속도(또는 온도 상승 가열 속도)를 갖는 "증가(step up)" 해동 공정을 사용한다. 예를 들어, 저온바이알은 대략 신체 온도인 온도로 이동되기 전에 증가 온도를 갖는 순차적인 저장 환경, 예를 들어 대략 37℃의 온도, 또는 임의의 다른 적합한 온도를 갖는 물 욕에 배치될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 저온보존 조성물 내의 저온보존된 생물학적 재료는 약 5℃/분 내지 약 80℃/분, 약 10℃/분 내지 약 70℃/분, 약 10℃/분 내지 약 60℃/분, 약 10℃/분 내지 약 50℃/분, 약 10℃/분 내지 약 40℃/분, 약 10℃/분 내지 약 30℃/분, 약 10℃/분 내지 약 20℃/분, 약 20℃/분 내지 약 40℃/분의 범위, 약 20℃/분 초과, 약 25℃/분 초과, 약 30℃/분 초과, 약 35℃/분 초과, 약 40℃/분 초과, 또는 약 30℃/분 초과의 가온 속도로 해동된다.

소정의 실시형태에서, 해동 후, 생물학적 재료를 세척하고, 적절한 배지 중에 현탁시키고, 조사 또는 임상 분야에서 사용하기에 필요한 바대로 처리한다.

소정의 실시형태에서, 해동 후, 세포를 재배양을 위해 배양 접시로 옮긴다. 세포는 조사 또는 임상 분야 전에 약 30분, 약 1시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 86시간, 약 110시간, 약 1주, 약 2주, 또는 3주 초과의 기간 동안 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 미국 특허 공보 제20170196221호.

소정의 실시형태에서, 소생된 부착성 세포 또는 반부착성 세포는 해동 시 즉시 재배양된다. 소생된 세포는 따라서 예를 들어 저온보존 전 배양으로부터 제거 동안에 가해진 손상을 극복하기 위한 회복 시간이 제공된다.

소정의 실시형태에서, 해동 후, 생물학적 재료는 배양 단계를 개재함이 없이 생체내 사용된다.

소정의 실시형태에서, 해동 후, 세포는 의도된 용도에 적합한 유체 또는 다른 배지 중에 재현탁될 수 있다. 예를 들어, 세포는 임의의 삼투압 지지 용액 중에 재현탁될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기재된 생리학적 상용성 완충제, 예컨대 완충 용액 중에 재현탁될 수 있다. 바람직하게는, 생체내 편리한 전달을 위한 조성물을 제공하는 임의의 생리학적 상용성 재료는 세포를 재현탁시키도록 사용될 수 있다.

저온보존된 세포의 생존능력

본 조성물 및 방법은 세포의 보존(예를 들어, 저온보존)을 허용할 수 있고, 여기서 세포는 회수 후 양호한 생존능력을 유지시킨다. 보존은 생물학적 재료의 온도의 상승, 동결건조된 생물학적 재료의 수화 및/또는 용질의 제거를 포함하는 생물학적 재료의 성질 및 보존의 방법에 맞도록 선택될 수 있는 많은 상이한 공정을 이용하여 중단될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "생존능력"은 생존가능 생물학적 재료의 백분율(예컨대, 예를 들어 DNA 및/또는 온전한 세포막 시스템의 존재에 기초한 세포, 또는 생존가능 바이러스)을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 생존가능 생물학적 재료는 보존 상태로부터의 이의 방출 후 대사상 활성이거나 대사상 활성이 되는 몇몇 생존가능 세포 또는 세포의 분획을 포함하는 생물학적 재료를 의미한다.

소정의 실시형태에서, 생물학적 재료(예를 들어, 세포 또는 바이러스)의 해동 후 생존능력은 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%이다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물 및 방법은 세포가 해동 후 괴사 및 아폽토시스의 제한된 양 또는 최소를 나타내는 것을 보장한다. 소정의 실시형태에서, 괴사 및/또는 아폽토시스는 세포의 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만 또는 약 1% 미만에서 관찰된다.

생존능력은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 생존능력은 트리판 블루 내재화 시험을 이용하여 또는 프로피듐 요오다이드 흡수를 측정함으로써 측정된다. 소정의 실시형태에서, 생존능력은 세포가 효율적으로 부착하는 능력을 평가함으로써(예를 들어, 부착 검정) 측정된다. 소정의 실시형태에서, 증식 검정은 부착된 세포가 저온보존 후 예상된 바대로 증식할 수 있는지를 결정하도록 이용될 수 있다. 부착 및 증식 효율은 저온보존을 겪지 않은 대조군 세포와 비교될 수 있다.

세포의 생존능력 및 기능을 결정하기 위해 당해 분야에 다양한 시험이 공지되어 있다. 소정의 실시형태에서, 이 시험은 세포 유형 및 세포의 원하는 사용에 따라 달라진다.

줄기세포 또는 선구체 세포를 위해, 본 명세서에 기재된 방법은 세포가 이의 다능성을 유지시키는 것을 추가로 보장할 수 있다. 이것은 계통 특이적 마커의 발현의 결정에 의해 확립될 수 있다. 예를 들어, 간엽성 줄기세포의 기능성 규명은 지방생성, 골원성 및 연골성 분화 가능성을 나타내는 mRNA의 계통 특이적 발현을 검출하기 위해 상업적으로 이용 가능한 분화 키트 및 RT-PCR을 이용하여 시험관내 지방생성, 골원성 및 연골성 분화의 유도를 포함할 수 있다. 유사하게, 비분화된 줄기세포의 품질은 mRNA의 단리 및 세포 특이적 마커에 대한 시험에 의해 시험될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 기재된 계통의 세포로 분화하는 능력은 유지되고, 즉 비처리된 세포와 유의미하게 다르지 않다. 배아 줄기(ES) 세포의 다능성은 예를 들어 Oct4-GFP 발현, 알칼리 포스파타제 발현의 상승 및 SSEA-1 표면 당단백질 발현을 포함하는 분야 공지된 방법을 이용하여 시험될 수 있다. 몇몇 시험관내 방법은 실험 치료 후 줄기세포 회복을 평가하도록 적용될 수 있다. 이 평가는 막 통합성, 대사 및 다른 기능 검정 및/또는 배양에서의 콜로니 성장, 및 형광성 검정, 예컨대 SYTO/EB를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 분화 시험, 면역표현형 규명, 및/또는 형태의 검사는 줄기세포 및/또는 선구체 세포를 평가하도록 사용될 수 있다.

접합자의 저온보존에 대해, 난할 속도는 저온보존 공정 동안에 어떠한 세포 손상이 있는지를 결정하기 위해 저온보존 후 결정되고 대조군과 비교될 수 있다. 난모세포의 생존능력은 저온보존 이후의 세포의 형태학적 특징의 검사에 의해 결정될 수 있다. 형태학적으로 생존가능 난모세포는 온전한 투명대 및 혈장 막 및 굴절성 세포질을 나타내는 한편, 비생존가능 난모세포는 광 현미경 하에 가시화될 때 퇴행하는 것으로 보인다. 난모세포 생존능력 및 기능에 대한 궁극적인 기준은 시험관내 및 생체내 건강한 정자가 수정하는 이의 역량, 이어서 난할, 배반포, 및/또는 태아의 부화 또는 발생이다. 미국 특허 제9,538,745호.

소정의 실시형태에서, 본 보존 조성물 및 방법, 및 본 보존 조성물 및 방법을 사용하여 보존으로부터 회수된 생물학적 재료는 조사 및/또는 임상 분야(예를 들어, 세포 기반 치료, 이식, 재생 의학, 진단학 및 유전자 시험, 감시, 독성 시험 및 시험관내 수정을 위한, 세포/조직 뱅킹)에 사용될 수 있다.

생물학적 재료

용어 "생물학적 재료"는 세포, 세포 응집체, 조직, 기관, 생물학적 유체, 바이러스 입자, 및 임의의 다른 막성 집합체, 예컨대 리포솜(천연 또는 합성)을 의미한다.

세포 또는 조직의 임의의 유형은 본 조성물 및 방법을 이용하여 보존될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포, 쥣과 세포, 돼지과 세포, 개과 세포, 말과 세포 및 소과 세포(이들로 제한되지는 않음)이다. 세포는 멸종에 처하거나 멸종 위기인 종인 포유류 유래일 수 있다. 세포는 인간 또는 비인간 포유류, 예를 들어 세르코피테코이데아(Cercopithecoidea) 과, 호미노이데아(Hominoidea) 상과, 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris), 펠리스 카투스(Felis catus), 크리세티다에 종(Cricetidae spp.), 에쿠스 종(Equus spp.)(예를 들어, 에쿠스 카발루스(Equus caballus), 에쿠스 아시누스(Equus assinus)), 에퀴다에(Equidae) 과, 보스 타우루스(Bos taurus), 보스 인디쿠스(Bos indicus), 보비다에(Bovidae) 과, 카멜리다에(Camelidae) 과, 부발루스 부발리스(Bubalus bubalis), 카프라 아에가그루스 히르쿠스(Capra aegagrus hircus), 세르비다에(Cervidae) 과, 세르비나에(Cervinae) 과, 오비스 아리에스(Ovis aries), 오비스 카나덴시스(Ovis canadensis), 카프라 히르쿠스(Capra hircus), 수스 스크로파 도메스티카(Sus scrofa domestica), 메소크리세투스 종(Mesocricetus spp.), 무스텔라 비손(Mustela vison), 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus), 메리오네스 웅귀쿨라투스(Meriones unguiculatus), 친칠라 라니게르(Chinchilla laniger), 래터스 노르베지커스(Rattus norvegicus), 래터스 종(Rattus spp.), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 레오포리다에(Leporidae) 과, 오릭톨라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus), 코부스 종(Kobus spp.), 갈루스 종(Gallus spp.), 멜레아그리아 갈로파보(Meleagria gallopavo), 아나티다에 종(Anatidae spp.), 무스텔라 푸토리우스(Mustela putorius), 콜룸바 도메스티카(Columba domestica), 콜룸바 리비아(Columba livia), 누미다 멜레아그리스(Numida meleagris), 오르니토르힌쿠스 아나티누스(Ornithorhynchus anatinus), 파보 크리스타투스(Pavo cristatus), 비손 종(Bison spp.), 스트루티오 종(Struthio spp.), 라마 글라마(Lama glama), 레아 종(Rhea spp.), 드로미세이우스 종(Dromiceius spp.), 라마 파코스(Lama pacos), 란기페르 타란두스(Rangifer tarandus), 보스 그루니엔스(Bos grunniens), 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus), 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius), 및 임의의 멸종에 처하거나 멸종 위기인 종 유래일 수 있다.

본 조성물 및 방법은 미생물, 박테리아, 비포유류 동물 세포(예를 들어, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포 등), 또는 식물 세포를 보존하도록 사용될 수 있다.

세포의 비제한적인 예는 줄기세포, 선구체 세포, 배아, 정자, 난모세포, 생식모세포 및 접합자를 포함한다.

세포는 종양 세포 또는 비종양 세포일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 섬유아세포이다.

생물학적 재료는, 제한 없이, 하기 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 섬유아세포, 줄기세포, 선구체 세포, 전혈 또는 이의 분획, 적혈구, 백혈구, 제대혈 또는 이의 분획, 제대혈 세포, 골수, 난모세포, 정자, 난자, 배아, 연골, 난소, 심장, 피부, 신장, 간, 폐. 또한, 이러한 생물학적 재료는 세포 유기체를 포함할 수 있고, 이는 진핵생물 또는 원핵생물, 예를 들어 박테리아 및 효모 등일 수 있다. 추가적으로, 생물학적 재료는 또한 저온보존 생존할 수 있는 완전 다세포 유기체, 예컨대 선충을 포함할 수 있다. 혈액의 분획은 혈액 세포(백혈구 및/또는 적혈구)를 포함하는 혈액, 혈장 및/또는 용질 및/또는 세포 이하 성분(예를 들어, 세포의 분획, 예컨대 혈소판, 분해된 세포의 성분 등), 단백질, 지질, 항체 등의 임의의 분획을 포함할 수 있다.

본 조성물 및 방법은 췌장 소도 세포, 연골세포, 신경 기원의 세포, 간 기원의 세포, 안과학적 기원의 세포, 정형외과 기원의 세포, 연결 조직으로부터의 세포 및 생식 기원의 세포, 및 심장 및 심혈관 기원의 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 조직 및 기관으로부터 유래된 세포 재료(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 세포의 임의의 유형을 보존하기 위해 사용될 수 있다.

줄기세포는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포, 유도 다능성 줄기세포(iPSC), 말초 혈액 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 간엽성 줄기세포, 조직 및 기관 또는 다른 소스, 예를 들어 태아 및/또는 배아 소스, 및 줄기세포와 다른 세포의 혼합물 및 상이한 소스로부터 유래된 줄기세포를 포함한다. 성체 줄기세포는 골수 줄기세포, 조혈 줄기세포, 피부 줄기세포, 눈 줄기세포, 신경 줄기세포, 심장 줄기세포 등을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 내배엽 기원의 줄기세포는 폐 상피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 췌장 줄기세포 또는 간 타원형 세포 및/또는 이의 선구체 세포이다. 특정한 실시형태에서, 비뇨생식기 기원의 세포는 유방 및 전립샘 줄기세포 또는 난소 및 고환 줄기세포 및/또는 이의 선구체 세포로서 분류된다. 특정한 실시형태에서, 중배엽 기원의 세포는 골수 세포, 조혈 줄기세포, 기질 줄기세포 또는 심장 줄기세포 및/또는 이의 선구체 세포이다. 특정한 실시형태에서, 외배엽 기원의 세포는 신경 줄기세포, 피부 줄기세포 또는 눈 줄기세포 및/또는 이의 선구체 세포이다.

본 개시내용의 조성물 및 방법을 이용하여 저온보존될 수 있는 세포 유형은 예를 들어 분화 세포, 예컨대 섬유아세포, 상피 세포, 심장근육세포, 간세포, 신경 세포, 표피 세포, 케라틴세포, 조혈 세포, 멜라닌세포, 연골세포, B 세포, T 세포, 적혈구, 대식세포, 단핵구 또는 근육 세포; 및 미분화 세포, 예컨대 배아, 간엽성 또는 성체 줄기세포를 포함한다. 세포는 반수체, 이배체 또는 사배체일 수 있다. 다른 세포는 방광, 뇌, 식도, 나팔관, 심장, 장, 쓸개, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 요관, 요도 또는 자궁으로부터의 세포를 포함한다.

추가의 특정한 실시형태에서, 세포는 성인 뇌, 골수, 혈관, 골격근, 피부, 치아, 심장, 장, 간 또는 다른 성인 조직으로부터 얻어진다. 특정한 실시형태에서, 세포는 내배엽, 비뇨생식기, 중배엽 또는 외배엽 기원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

조직은 각막, 연골, 골, 피부, 심장 판막, 랑게르한스섬, 인간, 동물, 어류, 조개류 및 식물로부터의 배아, 및 인간 및 동물로부터의 난소 조직을 포함한다. 본 조성물 및 방법은 또한 조작된 조직 및 조직 작제물을 보존할 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 조성물 및 방법은 보조 생식 기술에서, 또는 화학치료 또는 방사선 치료를 겪은 환자에 대해 난모세포 또는 정자를 보존하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 줄기세포의 보존에 사용될 수 있고, 이는 이후 줄기세포 기반 치료, 세포 이식, 조직 조작 및 재생 의학의 기본으로서 사용될 수 있다. 상기 방법은 종의 보존을 위해 보조 생식 기술에서 미래의 사용을 위해 멸종될 위험에 있거나 희귀한 동물로부터의 난모세포 또는 정자를 보존하기 위해 또한 사용될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 동물, 예컨대 소, 돼지 및 양으로부터의 배아 줄기세포, 생식모세포, 난모세포 또는 정자의 보존을 위한 동물 농사 목적(예를 들어, 동물의 교배 및 사육)을 위해 추가로 사용될 수 있다.

저온보존된 세포는 다양한 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 눈 세포는 연령 관련 황반 변성(습성 또는 건성), 당뇨병성 황반 부종, 특발성 맥락막 혈관신생 또는 고도근시 황반 변성(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 눈 질환을 치료하기 위해 사용된다. 몇몇 눈 실시형태에서, RPE 세포를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 심장 줄기세포는 심혈관 장애, 예컨대 심근경색, 허혈성 심장 조직 손상, 울혈성 심부전, 동맥류, 죽상동맥경화증 유도된 사건, 뇌혈관 사건(뇌졸중) 및 관상동맥 동맥 질환을 치료하기 위해 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 간 줄기세포는 간 질환, 예컨대 간염, 간경변, 암 등을 치료하기 위해 사용된다. 무엇보다도 다른 조직, 예컨대 신장, 폐, 췌장, 장, 골 및/또는 연골, 및 신경 조직에서의 질환은 본 명세서에 개시된 방법 및 장치에 의해 치료될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 수확된 골수 줄기세포는 백혈병, 암, 또는 혈액 세포 수를 감소시키는 치료로 인해 감소된 조혈 세포를 증식시키도록 사용될 수 있다.

본 개시내용은 또한 치료의 다양한 방법에서 유용하다. 세포성 치료, 또는 세포 치료는 일반적으로 손상된 조직 및/또는 세포를 대체하거나 보수하기 위한 인간 또는 동물 세포의 이식을 포함할 수 있다. 세포 치료는 관절에서의 손상된 연골을 재구축하고, 척수 손상을 보수하고, 약해진 면역계를 강화시키고, 자가면역 질환을 치료하고, 신경학적 장애, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 뇌전증을 갖는 환자를 돕도록 사용된다. 추가의 용도는 넓은 범위의 만성 병태, 예컨대 동맥경화증, 선천성 결손 및 성 기능장애의 치료를 포함한다.

세포 치료는 통상적으로 이종성, 동종이계(또 다른 인간 도너로부터의), 또는 자가(여기서, 세포는 동일한 환자로부터 추출되고 이 환자로 다시 이식됨)인 전체 세포 또는 세포 추출물의 주사를 수반한다.

본 조성물 및 방법은 차후의 세포 치료에서 사용하기 위한 시간의 기간 동안 세포를 저장하는 것이 유용한 분야에서 사용될 수 있다. 이것은 차후의 이식을 위한 환자 자체의 세포의 저장 및 총칭적 세포주(예를 들어, 조사 또는 치료에서 사용하기 위한 배아 줄기세포주)의 저장을 포함할 수 있다.

바이러스 또는 바이러스 입자는 임의의 바이러스일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 또는 바이러스 입자는 아데노바이러스, 아데노 연관된 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 등을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 또는 바이러스 입자는 유전자 치료에서 사용될 수 있는 것이다.

키트

본 개시내용은 또한 (본 명세서에 기재된 바와 같은 고체 또는 액체 형태의) 본 보존 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본 보존 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 생물학적 재료를 포함하는 본 보존 조성물을 포함한다. 일 실시형태에서, 키트는 보존(예를 들어, 저온보존)을 위한 생물학적 재료를 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 보존 조성물 및 방법을 이용한 생물학적 재료의 보존을 위한 설명서를 포함한다. 키트는 대상체가 치료를 요하는지를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 대상체를 선택하는 것의 설명을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 설명서는 치료를 요하는 대상체에게 저온보존 후 해동된 생물학적 재료를 투여하는 것의 설명을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 키트에 제공된 설명서는 라벨 또는 패키지 인서트 상의 서면 설명서이다. 라벨 또는 패키지 인서트는 생물학적 재료의 임상 및/또는 조사 분야를 또한 나타낼 수 있다.

키트의 부품은 동시에 또는 연대순으로 시차를 두어, 즉 키트의 임의의 성분에 대해 상이한 시점에 및 동일한 또는 상이한 시간 간격에 의해 사용될 수 있다. 시간 간격은 원하는 효과를 얻도록 선택될 수 있다.

본 명세서에 제공된 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알(예를 들어, 저온바이알), 병, 앰플, 관(예를 들어, 저온관), 백, 플라스크, 단지, 가요성 패키징 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 장치, 예컨대 동결 용기, 저온바이알 및/또는 저온관과 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다.

키트는 선택적으로 추가적인 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 보통, 키트는 용기 및 용기에서의 또는 이와 연관된 라벨 또는 패키지 인서트(들)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

하기는 본 발명의 예이고, 제한으로서 해석되지 않는다.

실시예 1

어는 용액 제제

어는 용액의 9개의 스톡 샘플을 준비하였다(표 1). 알부민은 Kedrion으로부터 구입한 HSA였다. 젤라틴을 Gelita(젤라틴은 소 생가죽으로부터 제조됨; 배취 L600217호) 또는 Nippi(젤라틴은 소, 돼지 및/또는 어류 등으로부터 제조됨; 로트 S150806호)로부터 구입하였다. 트레할로스를 Hayashibara로부터 구입하였다. 수크로스를 J.T. Baker로부터 구입하였다. 글라이세롤을 Spectrum으로부터 구입하였다. PEG를 SIGMA로부터 구입하였다. 실시예의 표에서의 다양한 성분의 백분율은 %(w/v)이다.

이 실험에서, 원하는 작업 농도의 2배인 농도에서 DMEM 중에 원하는 물질을 용해시킴으로써 스톡 어는 용액을 제제화하였다. 따라서, 1:1 용적비로 세포 현탁액과 혼합한 후, 원하는 작업 농도를 얻을 수 있다. 마찬가지로, 원하는 작업 농도의 3배, 4배 또는 5배 농도를 갖는 스톡 어는 용액은 필요한 경우 또한 제조될 수 있다.

세포의 동결

섬유아세포 세포를 배양하고, 5일 동안 증식시켰다. 세포가 약 80% 내지 90%의 포화상태에 도달한 후, 세포를 트립신화하고, DMEM 중에 현탁시켰다. 500㎕의 세포 현탁액(10⁶개의 세포/㎖)을 저온관에서 500㎕의 2X 스톡 어는 용액과 혼합하였다. CPA-1 내지 CPA-9(상이한 샘플)에서, 어는 용액의 각각의 성분의 최종 농도(작업 농도)는 표 2에 기재되어 있다. 대조군 샘플은 DMEM을 함유한다.

이후, 저온관을 아이소프로판올(예를 들어, Nalgene(등록상표) Mr. Frosty)을 함유하는 동결 용기로 옮기고, 1일 내지 2일 동안 -80℃ 동결기에서 저장하였다. 후속하여, 이 저온관을 장기간 저장을 위해 -80℃ 동결기로부터 액체 질소 저장 탱크로 옮겼다.

세포 생존능력 시험

저온관을 2분 내지 3분 동안 37℃ 물에 배치하여 저온보존된 세포를 해동시켰다. 해동된 세포 현탁액을 혼화하게 혼합하고, 세포의 생존능력을 ADAM-MC Automatic Cell Counter(Digital Bio)에 의해 분석하였다.

결과

다양한 세포 어는 용액 중의 섬유아세포 세포의 생존능력은 표 3 및 도 1에 기재되어 있다. 거대분자, 당 및 침투 저온보호제를 함유하는 저온보존 조성물에서 저온보존된 세포는 DMEM 단독에서보다 더 높은 생존능력을 유지하였다.

실시예 2

세포 생존능력에 대한 저온보존 용액의 다양한 성분의 효과를 시험하기 위해, 상이한 샘플을 표 4에 따라 제조하였다.

9개의 I군 저온보존 조성물, 9개의 II군 저온보존 조성물 및 9개의 III군 저온보존 조성물을 포함하는 27개의 저온보존 조성물을 표 7에 따라 준비하였다.

저온보존 전의 세포의 증식

태아 피부 섬유아세포 세포인 FE002-SK2 세포(계대배양 9; P9)의 2개의 관을 하기 생존능력에 의해 해동하였다(표 5).

2개의 관으로부터의 세포를 합하고, 5개의 T150 세포 배양 플라스크(약 4,666개의 세포/㎠)로 균등하게 분포시켰다. 20㎖의 세포 배양 배지를 세포 배양 플라스크에 첨가하여 세포를 배양하였다.

세포의 수확

시딩 후 약 7일에, 세포를 하기 생존능력에 의해 수확하였다(표 6).

5배 희석 전에, 원래의 세포 농도는 1.08 x 10⁶ x 5 = 5.4 x 10⁶개의 세포/㎖이었다. 전체 세포 현탁액은 5.8㎖이었다. 2㎖의 세포 배양 배지를 세포에 첨가하였다. 따라서, 세포 농도는 4 x 10⁶개의 세포/㎖로 희석되었다. 전체 세포 현탁액은 7.8㎖이었다.

200㎕의 세포 현탁액을 저온관에서 200㎕의 각각의 2X 저온보존 조성물에 첨가하였다(표 7). 세포 농도는 2x10⁶개의 세포/0.4㎖이었다.

저온보존 조성물 및 세포 혼합물을 갖는 저온관을 Mr. Frosty(등록상표) 동결 용기에 배치하고, 이것을 이후 밤새 -80℃ 동결기에 배치하였다. 저온관을 장기간 저장을 위해 액체 질소 탱크로 옮겼다.

해동 후 세포 생존능력

저온관을 37℃ 물 욕에 배치하여 세포를 해동하였다. 세포의 생존능력을 ADAM-MC Automatic Cell Counter(Digital Bio)에 의해 분석하였다. 간단히, 1개의 저온관을 매회 해동하고, 혼합물을 5회 피페팅하여 혼합하였다. 20㎕의 혼합물을 20㎕의 염색 용액과 혼합하고, 세포 계수기를 사용하여 계수하였다.

실시예에서, "Complete-CPA", "Complete-1" 또는 "Complete-2"는 침투 저온보호제(예를 들어, 글라이세롤), 사카라이드(예를 들어, 트레할로스) 및 거대분자(예를 들어, HSA)를 함유하는 저온보존 조성물을 의미한다. 이들은 본 저온보존 조성물의 실시형태이다. "SD"는 표준 편차를 의미한다. "Avg."는 평균 값을 의미한다.

실험의 원시 데이터는 표 8에 제시된다.

CPA-1 내지 CPA-27은 상이한 샘플이다. 대조군 샘플은 DMSO-1, DMSO-2, Complete-1 및 Complete-2이다.

토의

결과는 본 저온보존 조성물(Complete-CPA, Complete-1 및 Complete-2)의 실시형태를 이용하여 저온보존된 세포의 해동 후 생존능력이 DMSO(DMSO-CPA, DMSO-1 및 DMSO-2)를 함유하는 저온보존 조성물의 것에 필적하는 80% 초과라는 것을 보여준다.

결과는 저온보존 조성물로부터의 임의의 3종의 성분(거대분자, 당 및 침투 저온보호제)의 제거 또는 비최적 농도에서의 성분의 사용이 해동 후 세포 생존능력을 감소시킬 것이라는 것을 추가로 보여준다.

예시적인 시스템 및 방법은 하기 항목에 기재되어 있다:

항목 1. (1) 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v)의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 1M의 사카라이드; 및 (3) 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 거대분자를 포함하는 저온보존 조성물로서, %(w/v)의 단위 및 M의 단위는 저온보존 조성물의 전체 용적을 기준으로 한, 저온보존 조성물.

항목 2. 항목 1에 있어서, 침투 저온보호제는 글라이세롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 3. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드는 수크로스, 소르비톨, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 4. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 5. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 거대분자는 약 65kDa 내지 약 200kDa의 범위의 분자량을 갖는, 저온보존 조성물.

항목 6. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 거대분자는 알부민, 젤라틴, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 7. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, DMSO를 실질적으로 함유하지 않는, 저온보존 조성물.

항목 8. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 아미노산, 사이토카인, 지질, 성장 인자, 항생제, 항진균제, 스테로이드 호르몬, 단백질 호르몬, 또는 이들의 조합물을 더 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 9. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 10. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 저온보존된 상태인, 저온보존 조성물.

항목 11. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 존재하는, 저온보존 조성물.

항목 12. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, (1) 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v)의 침투 저온보호제; (2) 약 0.1M 내지 약 0.5M의 사카라이드; 및 (3) 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 거대분자를 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 13. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 저온보존 조성물.

항목 14. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 저온보존된 상태인, 저온보존 조성물.

항목 15. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 존재하는, 저온보존 조성물.

항목 16. 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 세포를 저온보존 조성물과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 및 (b) 혼합물을 동결시키는 단계를 포함하되, 저온보존 조성물은 (1) 2 내지 40%(w/v)의 침투 저온보호제; (2) 0.1 내지 1M의 사카라이드; 및 (3) 1 내지 10%(w/v)의 거대분자를 포함하는, 방법.

항목 17. 항목 16에 있어서, 세포는 포유류 세포인, 방법.

항목 18. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 인간, 돼지, 개, 말 또는 소 세포인, 방법.

항목 19. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 종양 세포를 포함하는, 방법.

항목 20. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 섬유아세포를 포함하는, 방법.

항목 21. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 줄기세포를 포함하는, 방법.

항목 22. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 혼합물은 약 -70℃ 내지 약 -200℃의 범위의 온도에서 동결된, 방법.

항목 23. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 혼합물에 존재하는, 방법.

항목 24. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 저온보존 조성물은 DMSO를 실질적으로 함유하지 않는, 방법.

항목 25. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 동결된 혼합물을 해동하는 단계 (c)를 더 포함하는, 방법.

항목 26. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 적어도 70%의 해동 후 생존능력을 갖는, 방법.

항목 27. 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 세포는 적어도 80%의 해동 후 생존능력을 갖는, 방법.

항목 28. 항목 1 내지 15 중 어느 하나의 저온보존 조성물을 포함하는 키트.

본 발명의 범위는 상기 구체적으로 도시되고 기재된 것에 의해 제한되지 않는다. 당업자는 재료, 구성, 건축 및 치수의 도시된 예의 적합한 대안이 있다는 것을 인식할 것이다. 특허 및 다양한 공보를 포함하는 많은 참고문헌은 본 발명의 설명에서 인용되고 기재되어 있다. 이러한 참고문헌의 인용 및 토의는 단지 본 발명의 설명을 명확히 하도록 제공되고, 어떤 참고문헌이 본 명세서에 기재된 발명의 선행 기술이라는 인정이 아니다. 본 명세서에 인용되고 기재된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기재된 것의 변경, 변형 및 다른 실행은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본 발명의 소정의 실시형태가 도시되고 기재되어 있지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 상시 설명에 기재된 대상은 제한으로서가 아니라 오직 예시로서 제공된다.

Claims

저온보존 조성물로서,
(1) 약 2%(w/v) 내지 약 40%(w/v)의 침투 저온보호제(permeating cryoprotectant);
(2) 약 0.1M 내지 약 1M의 사카라이드; 및
(3) 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 거대분자를 포함하되,
%(w/v)의 단위 및 M의 단위는 상기 저온보존 조성물의 전체 용적을 기준으로 한, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 상기 침투 저온보호제는 글라이세롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 상기 사카라이드는 수크로스, 소르비톨, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 상기 사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 상기 거대분자는 약 65kDa 내지 약 200kDa의 범위의 분자량을 갖는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 상기 거대분자는 알부민, 젤라틴, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, DMSO를 실질적으로 함유하지 않는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 아미노산, 사이토카인, 지질, 성장 인자, 항생제, 항진균제, 스테로이드 호르몬, 단백질 호르몬, 또는 이들의 조합물을 더 포함하는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서, 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 저온보존 조성물.
제9항에 있어서, 저온보존된 상태인, 저온보존 조성물.
제9항에 있어서, 상기 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 존재하는, 저온보존 조성물.
제1항에 있어서,
(1) 약 2%(w/v) 내지 약 20%(w/v)의 침투 저온보호제;
(2) 약 0.1M 내지 약 0.5M의 사카라이드; 및
(3) 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 거대분자를 포함하는, 저온보존 조성물.
제12항에 있어서, 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 저온보존 조성물.
제13항에 있어서, 저온보존된 상태인, 저온보존 조성물.
제12항에 있어서, 상기 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 존재하는, 저온보존 조성물.
하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 세포를 저온보존 조성물과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 및
(b) 상기 혼합물을 동결시키는 단계를 포함하되,
상기 저온보존 조성물은
(1) 2 내지 40%(w/v)의 침투 저온보호제;
(2) 0.1 내지 1M의 사카라이드; 및
(3) 1 내지 10%(w/v)의 거대분자를 포함하는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 인간, 돼지, 개, 말 또는 소 세포인, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포를 포함하는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포를 포함하는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포를 포함하는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 혼합물은 약 -70℃ 내지 약 -200℃의 범위의 온도에서 동결된, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 약 10⁵개의 세포/㎖ 내지 약 10⁷개의 세포/㎖의 범위의 농도로 상기 혼합물 중에 존재하는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 저온보존 조성물은 DMSO를 실질적으로 함유하지 않는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 동결된 혼합물을 해동하는 단계 (c)를 더 포함하는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 세포는 적어도 70%의 해동 후 생존능력을 갖는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 세포는 적어도 80%의 해동 후 생존능력을 갖는, 하나 이상의 세포를 저온보존하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 저온보존 조성물을 포함하는 키트.