WO2006033429A1

WO2006033429A1 - 細胞凍結保存用組成物

Info

Publication number: WO2006033429A1
Application number: PCT/JP2005/017577
Authority: WO
Inventors: Yoichi Kato; Masahiro Sasaki; Hideyuki Yamada
Original assignee: Seiren Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2005-09-26
Publication date: 2006-03-30
Also published as: US9055739B2; EP1820847A4; EP1820847B1; US20090197331A1; EP1820847A1

Abstract

　本発明による細胞凍結保存用組成物は、セリシンと、アミノ酸および糖類からなる群より選択される１種以上の成分とを少なくとも含んでなる。また本発明による細胞の凍結保存方法は、前記細胞凍結保存用組成物中に目的細胞を入れ、これを凍結保存することを含んでなる。本発明の細胞凍結保存用組成物によれば、血清および血清由来の成分を使用することなく、長期にわたって細胞を凍結しておくことが可能である。

Description

明細書

細胞凍結保存用組成物

関連出願の参照

[0001] 本願は、先行する日本国特許出願である特願 2004— 276951号（出願日：2004 年 9月 24日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。

発明の背景

[0002] 発明の分野

本発明は、良好な細胞生存率を得られる細胞凍結保存用組成物に関する。

[0003] 昔景桉術

培養細胞の凍結保存は、継代による細胞変質の防止、継代に伴う雑菌による汚染の防止、および継代維持の煩雑さの解消を目的として行われている。例えば、動物細胞の場合では、従来、動物細胞の凍結保存技術は、 5〜 15%ジメチルスルホキシド (DMSO)やグリセリンを含む培養液、または牛血清に細胞を懸濁してこれを凍結チューブやアンプルに封入し、プログラムフリーザーを用いて 1°CZ分前後の速度で冷却して、最終的に液体窒素中（一 196°C)において保存する方法が一般的に行われていた。

[0004] し力しながら、凍結保存の際に培養液を用いると、凍結細胞の生存率が低くなり、凍結融解した際に、目的とする細胞数まで増殖させるのに時間が力かることが多い。一方、凍結保存の際に血清を用いると、血清が極めて高価であるため、多種類の細胞株を大量に凍結する際の保存コストが上昇することになる。また、血清には、各種サイト力イン、増殖因子、ホルモンおよびイオン等のような本来細胞保存に不必要な成分を多く含むため、保存細胞の性質を変質させるおそれがある。さらに血清を使用する場合、さら〖こは、血清もしくは血漿を精製したアルブミンを使用する場合であっても、ウィルス感染の危険性等の問題は依然として存在して、る。

さらに、プログラムフリーザーを使用する場合、その細胞凍結の手順自体が煩雑とならざるを得ず、また時間の経過と共に凍結した細胞の生存率が低下するという問題もあった。

[0005] プログラムフリーザーの使用を必要としない凍結保存液としては、例えば、日本国特許公開公報特開平 6— 46840号公報に、プログラムフリーザー使用の必要性がなぐ氷中から直接一 80°Cへ移すことができる凍結保存液が提案されている。しかしながら、この凍結保存液は血清成分を含むものであった。

[0006] このため、プログラムフリーザーの使用を必要とすることなぐ氷中から直接 80°C フリーザーに移すことができ、かつ、長期にわたって細胞を凍結しておくことが可能な細胞凍結保存液であって、培養液や、血清および血清由来の成分を必要としないものが望まれていた。

[0007] 従来、細胞凍結保存液に使用される成分としては、アミノ酸、タンパク質、糖類、ァルコール類等が知られている。例えば、 Shinozaki.K. et al: FEBS Let t.， 461(3), 20 5, (1999)および Takagi'H. et al.: Appl Environ Microbial, 69(11), 6527 (2003)には、アミノ酸の一つのプロリンが凍結保護効果を有することにつ、て報告して、る。また、日本国特許公開公報特開 2002— 233356号公報には、糖類 (特にグルコース）を使用した細胞凍結保存液が開示されて!ヽる。

し力しながら、これら成分の成分単独の凍結保護効果は、本発明者らの知る限り、血清成分に比べて充分なものではな力つた。

[0008] 一方、絹タンパク質であるセリシンについては、日本国特許公開公報特開 2002 — 101869号公報において、その細胞凍結保護効果があることが確認されている。発明の概要

[0009] 本発明者らは今般、絹タンパク質であるセリシンと、アミノ酸および Zまたは糖類とを組み合わせて使用すると、血清由来成分を使用することなしに、血清由来成分を使用する場合と同等の優れた細胞凍結保護効果を示しうることを見出した。この効果は

、セリシンと、アミノ酸および Zまたは糖類とを、特定量でかつ特定種類のものを選択して使用することによって、より顕著となった。本発明はこれら知見に基づくものであるよって本発明は、血清および血清由来の成分を使用することなぐ長期にわたって細胞を凍結しておくことが可能な細胞凍結保存液の提供をその目的とする。本発明による細胞凍結保存用組成物は、セリシンと、アミノ酸および糖類力もなる群より選択される 1種以上の成分とを少なくとも含んでなるものである。

本発明による細胞の凍結保存方法は、前記細胞凍結保存用組成物中に目的細胞を入れ、これを凍結保存することを含んでなる。

[0011] 本発明による細胞凍結保存用組成物は、セリシン単独の場合に比べて、優れた凍結保護効果を示すものであり、また、血清由来成分を使用する場合と比べてもそれと同等力またはそれ以上の凍結保護効果を示すものである。また、本発明の細胞凍結保存用組成物は、血清または血清由来成分を含まないため、保存している細胞の性質を変える可能性が低く未知ウィルス混入の危険性が殆どな、ものである。本発明の組成物は、その組成が明瞭であるため、安全性が高ぐ品質の安定性を保ち、安定供給する上でも有利である。さらに、本発明の組成物によれば、細胞を凍結チューブやアンプルなどにつめた後、プログラムフリーザーを用いることなく直接 80°Cフリーザ一で凍結可能であるため、一般的な細胞凍結保存液と比べて、凍結時の操作を簡略ィ匕することができる。また、本発明の組成物によれば、長期にわたって目的とする細胞を凍結保存しておくことが可能であり、凍結保存後も高い細胞の生存率を達成することができる。これにより、目的とする細胞数まで増殖させるのに要する時間を短縮することができる。

発明の具体的説明

0012] m ^mi

本発明による細胞凍結保存用組成物は、前記したように、セリシンと、アミノ酸および糖類力なる群より選択される 1種以上の成分とを少なくとも含んでなるものである。したがって、前記成分を含む限りにおいて、本発明による組成物は、他の細胞凍結保護成分、緩衝剤成分、他の任意成分をさらに含んでいてもよい。本発明による細胞凍結保存用組成物は、通常、水を加えて水溶液状態である凍結保存液として使用される。したがって、ここでいう細胞凍結保存用組成物には、固体状態の場合の他、液体状態となって!、る場合も包含される。

[0013] ここで、「細胞凍結保存」とは、継代培養することなしに細胞を長期間維持する目的で、細胞を凍結させて保存することをいい、凍結方法および保存方法は特に限定されない。したがって、例えば、プログラムフリーザーを使用することなく直接細胞をフリ一ザ一に投入して凍結させ保存する場合の他、細胞をプログラムフリーザーを用いて凍結させ保存する場合も包含される。

[0014] 本発明にお、て「細胞」は、凍結保存に付されることがある細胞であれば特に限定されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞のいずれであっても良い。本発明においては、「細胞」は動物細胞であることが好ましい。ここでいう動物には、ヒトを含む哺乳類、魚類、鳥類、昆虫類等が包含される。本発明における「動物細胞」としては、培養細胞として株化された細胞、生物組織力得られる株化されて、な、正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、 V、ずれの形式のものであってちょい。

[0015] セリシン

本発明において、セリシンは、天然物由来のものであっても、慣用の化学的および

Zまたは遺伝子工学的手法により人工的に合成されたものであってもよぐいずれのものであっても包含される。したがって、例えば、セリシンとして、家蚕や野蚕等が生産したセリシンを用いることができる。好ましくは、セリシンは、高純度に精製され、不純物を実質的に含まないものである。

[0016] 本発明におけるセリシンには、セリシン、およびその加水分解物が包含される。ここで、セリシンの加水分解物とは、セリシンの非加水分解物を、慣用の手段、例えば、アルカリ、または酵素等を利用することにより、加水分解を施して得ることができるものである。

[0017] 本発明において、セリシンは、慣用の抽出方法により繭または生糸等力も抽出して得ることができる。具体的には、例えば、セリシンは、繭、生糸、または絹織物を原料として、これを熱水、または酸、アルカリ、酵素等によって部分的に加水分解し抽出する方法などによって得ることができる。得られたセリシンは、必要に応じて、特許第 30 11759号公報に記載の方法等により高純度 (例えば、セリシン固体の総窒素量 13% 以上）に精製され、粉体等の固体形態に調製される。本発明においては、この固体形態のセリシンを、細胞凍結保存用組成物にそのまま配合することができるが、必要に応じて、固体形態のセリシンを、水や緩衝液に溶解または懸濁させた溶液状態として、細胞凍結保存用組成物に配合してもよい。

[0018] 本発明において、セリシンの平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは、 3, 0 00〜300, 000であり、より好まし <は 5, 000〜風 000であり、さらに好まし <は 1 0, 000〜50, 000である。セリシンの平均分子量力 300, 000以下であると、 0. 5重量％程度の濃度において水溶液がゲルィ匕することを防止することができ、使用形態が限定されることを防ぐことができる。また、セリシンの平均分子量が 3, 000以上であることは、細胞凍結保護効果を発揮する上で有利である。

[0019] 本発明において、細胞凍結保存用組成物中におけるセリシンの含有量は、特に限定されないが、最終濃度が 0. 01〜10. 0重量％となるようにセリシンが含まれていることが好ましぐより好ましくは最終濃度が 0. 1〜1重量％となるようにセリシンが含まれる。セリシンの最終濃度が 0. 01重量％以上であることは、充分な凍結保護効果を発揮する上で有利であり、 10. 0重量％以下であることは、保存コストの上昇を抑える上で有利である。

[0020] なおここで、細胞凍結保存用組成物が、最終濃度が 0. 01〜： L0. 0重量％となるようにセリシンを含むとは、細胞凍結保存用組成物を、細胞凍結処理に使用するために実際に保存液とした場合に、その液中におけるセリシン濃度力 0. 01〜： L0. 0重量％であることを意味する。このことは、アミノ酸および糖類の場合についても同様である。

[0021] アミノ酸

本発明において、アミノ酸は、光学異性体、すなわち D体および L体のいずれをも包含する。また、ここでいうアミノ酸には、天然のタンパク質を構成する 20種の α—Ύ ミノ酸のみならず、それら以外の α—アミノ酸、ならびに j8—、 γ —、 δ —アミノ酸および非天然のアミノ酸等が包含されてもよい。したがって、例えば、アミノ酸は、ァラ- ン、ノリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、メチォニン、グリシン、セリン、スレ才ニン、システィン、グルタミン、ァスパラギン、チロシン、リシン、アルギニン、ァスパラギン酸、および、グルタミン酸力もなる群より選択される 1 種以上のものであることができる。好ましくは、アミノ酸は、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、グリシン、およびァラニン力もなる群より選択される 1種以上のものであり、より好ましくは、アミノ酸は、プロリン、およびグルタミン力なる群より選択される 1種以上のものである。

[0022] また本発明において、アミノ酸というときには、アミノ酸そのものの他に、アミノ酸の誘導体も包含する意味で用いられる。ここでアミノ酸の誘導体には、アミノ酸の塩、またはアミノ酸の溶媒和物が挙げられる。ここで、アミノ酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、フマル酸、コハク酸塩、クェン酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、ァスコルビン酸塩のような有機酸塩などが挙げられる。またアミノ酸の溶媒和物としては、水和物、アルコール和物（例えば、メタノール和物、エタノール和物）、およびエーテル和物（例えば、ジェチルエーテル和物）が挙げられる。

[0023] 本発明において、細胞凍結保存用組成物中におけるアミノ酸の含有量は、特に限定されないが、最終濃度が 0. 01〜： LO. 0重量％となるようにアミノ酸が含まれていることが好ましぐより好ましくは最終濃度が 0. 1〜1. 0重量％となるようにアミノ酸が含まれる。アミノ酸の最終濃度が前記範囲内であることは、充分な凍結保護効果を発揮する上で有利である。

[0024] 腿

本発明において、糖類には、単糖類、二糖類のようなオリゴ糖類、多糖類等のいずれのものも包含される。したがって、糖類としては、例えば、グルコース、キシロース、ァラビノース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、キシリトーノレ、 myo—イノシトーノレ、トレノヽロース、スクロース、ラタトース、マノレトース、セ口ビオース、ラクチトーノレ、マノレチトーノレ、メチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレ口ース、デキストラン、グリコーゲン、アミロース、アミロぺクチン、ィヌリン、アルギン酸ナトリウム、ェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ラフイノース、スタキオース、キサンタンガム、ダルコサミン、および、ガラクトサミン力もなる群より選択される 1種以上のものが挙げられる。好ましくは、糖類は、マルトース型ニ糖類である。ここでマルトース型ニ糖類には、例えば、マルトース，セロビオース、ラタトース等が包含される。より好ましくは、糖類はマルトースである。

[0025] 本発明において、細胞凍結保存用組成物中における糖類の含有量は、特に限定されないが、最終濃度が 0. 01〜： LO. 0重量％となるように糖類が含まれていることが好ましぐより好ましくは最終濃度が 0. 1〜1. 0重量％となるように糖類が含まれる。糖類の最終濃度が前記範囲内であることは、充分な凍結保護効果を発揮する上で有利である。

[0026] 本発明の一つの好まし、態様によれば、本発明による細胞凍結保存用組成物は、セリシンと、アミノ酸と、糖類とを少なくとも含んでなる。このとき、細胞凍結保存用組成物中におけるこれら成分の配合比（重量比）は、セリシン：アミノ酸：糖類の重量比として、典型的に ίま、 1 : 0. 01〜： LO. 0 : 0. 01〜： LO. 0であり、より好ましく ίま 1 : 0. 1〜1. 0 : 0. 1〜1. 0、最も好ましくは 1 : 0. 4〜0. 8 : 0. 3〜0. 7である。

[0027] 他の H q 保讒分

本発明による細胞凍結保存用組成物は、他の細胞凍結保護成分をさらに含んでなることができる。ここで、他の細胞凍結保護成分とは、例えば、ジメチルスルホキシド（ DMSO)、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロールからなる群より選択されるものである。これらは 2以上を組み合わせて使用してもよい。

[0028] 本発明による細胞凍結保存用組成物中における他の細胞凍結保護成分の含有量は、使用する成分の種類により適宜変更することが可能であるが、好ましくは、最終濃度が 1. 0-40. 0重量％となるような量であり、より好ましくは 5. 0-20. 0重量％となるような量である。他の細胞凍結保護成分の含有量が、 1. 0重量％以上であると、充分な凍結保護効果を得る上で有利であり、 40. 0重量％以下であると、細胞に対する毒性が低くなり好ま、。

[0029] 他の細胞凍結保護成分がジメチルスルホキシドである場合には、細胞凍結保存用組成物中におけるジメチルスルホキシドの含有量は、好ましくは 5. 0-15. 0重量％である。また他の細胞凍結保護成分がグリセロールである場合には、細胞凍結保存用組成物中におけるグリセロールの含有量は、好ましくは 5. 0-20. 0重量％である。なお、細胞凍結保護効果の観点からは、グリセロールよりもジメチルスルホキシドの方が望ましい。 [0030] 緩衝剤成分

本発明による細胞凍結保存用組成物は、緩衝剤成分をさらに含んでなることができる。緩衝剤成分は、細胞凍結保存用組成物を溶液状態である凍結保存液とした場合に、その保存液の ρΗが室温（例えば 25°C)において 6. 0〜8. 5、好ましくは 7. 0〜 7. 5となるように選択されることが望ましい。 pHの範囲が前記範囲内であることは、細胞の成育へ影響を少なくできる点で有利である。

[0031] 本発明にお、て、緩衝剤成分の種類は、上記 pHの条件を満たすものであれば、いずれのものであってもよい。緩衝剤成分の具体例としては、リン酸系（例えば PBS) 、 BES、 TES、ァセトアミドグリシン、グリシンアミド、グリシルグリシン、 TRICINE、トリスエタノールァミン、ベロナール、および HEPESなどが挙げられる。好ましくは、緩衝剤成分は、 PBS、 TRICINE、および HEPESからなる群から選択され、より好ましくは HEPESである。

[0032] 細胞凍結保存用組成物を溶液状態である凍結保存液とした場合、そこに含まれうる緩衝剤成分の濃度は、 1〜： LOOOmMであることが好ましぐより好ましくは 1〜200 mM、さらに好ましくは 5〜200mM、さらにより好ましくは 5〜50mMである。緩衝剤成分の濃度が前記範囲内であると、凍結保存液にぉ、て緩衝効果を得ることができると同時に、細胞への影響を抑えることができる。

[0033] 他の仵意成分

本発明による細胞凍結保存用組成物は、他の任意成分をさらに含んでなることができる。

ここで他の任意成分としては、例えば、ペプチド、他のタンパク質、糖アルコール、ァミノ糖、糖タンパク質、アルコール等の追加成分や、 _PH調整剤、保湿剤、防腐剤、粘度調整剤等が挙げられる。これらは 2種以上を併用しても良い。他の任意成分は、凍結保存する細胞の種類、凍結方法、凍結期間等を考慮して、その種類および使用量を適宜選択することができる。

本発明による細胞凍結保存用組成物は、慣用の培養液や、血清由来成分を実質的にふくまないことが望ましいが、必要であれば、これらの全部または一部を使用することを否定するものではな、。 [0034] 本発明の一つの好ましい態様によれば、細胞凍結保存用組成物は下記の量で成分 (a)〜（d)を含んでなる：

(a) セリシン 0. 01〜： L0. 0重量⁰ /₀ ;

(b) アミノ酸、および糖類からなる群より選択される 1種以上の成分

0. 01〜： L0. 0重量％;

(c) ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセロール力なる群より選択される、追加の細胞凍結保護成分

1. 0〜40. 0重量⁰ /₀ ;

(d) 緩衝剤成分 1〜： L000mM。

[0035] 本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、細胞凍結保存用組成物は下記の量で成分 (a)〜（d)を含んでなる：

(a) セリシン 0. 01〜： L0. 0重量⁰ /₀ ;

(bl) アミノ酸 0. 01〜： L0. 0重量％;

(b2) 糖類 0. 01〜： L0. 0重量％;

1. 0〜40. 0重量⁰ /₀ ;

(d) 緩衝剤成分 1〜： L000mM。

[0036] 本発明による細胞凍結保存用組成物は、前記構成成分を混合してそのまま固体状態とするか、または、必要に応じて、水に溶解させて水溶液状態として得ることができる。

[0037] 細胞の凍結保存

本発明による細胞凍結保存用組成物は、細胞の凍結保存処理にお!、て使用される。すなわち、細胞の凍結保存処理を行う際に、目的とする細胞を、溶液状態とした本発明による組成物中に入れて懸濁し、これを凍結保存する条件下に保持して凍結させる。細胞が必要となったときに、凍結した細胞および本発明による組成物を解凍処理した後、そこ力細胞を回収することができる。

[0038] したがって、本発明によれば、本発明による細胞凍結保存用組成物中に目的細胞を入れ、これを凍結保存することを含んでなる、細胞の凍結保存方法が提供される。ここで、細胞凍結保存用組成物中に目的細胞を入る際、その細胞濃度は、 1万〜 1 000万 cells/mlであることが望まし!/、。

[0039] 本発明にお、て、細胞の凍結方法は特に制限されな、。例えば、本発明による溶液状態の細胞凍結保存用組成物に目的細胞を入れて懸濁させたものを、凍結チューブに入れ、これを直接 80°Cの超低温フリーザーに入れることにより、細胞を凍結させることができる。あるいは凍結チューブを、プログラムフリーザーに入れ細胞を緩慢凍結させてもよい。凍結した細胞の保存は、例えば、凍結させた温度 (例えば— 80 °C)にそのまま保持することにより行うことができる。

また細胞を解凍する方法も特に制限はされず、例えば、凍結保存された凍結チューブを、 37°Cの水浴中に入れることによって融解させ、細胞を解凍しても良い。

[0040] 本発明の別の態様によれば、細胞の凍結保存における細胞生存率を高めるための、セリシンと、アミノ酸、および糖類力なる群より選択される 1種以上の成分との組み合わせの使用が提供される。ここでは、成分の組み合わせが、セリシンと、アミノ酸と、糖類とを少なくとも含んでなることが好ま、。

実施例

[0041] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力これらは本発明の範囲を限定するものではない。

[0042] セリシンの調製

家蚕 (Bombvx mori)が生産した繭糸を十分に洗浄した後、繭糸 100gを、抽出溶媒として 0. 2%炭酸水素ナトリウム水溶液 2L中において、 96°Cの条件下において 2時間加熱処理を施して加水分解し、セリシン加水分解物を抽出した。得られたセリシン加水分解物の抽出液を平均孔径 0. 2 mのフィルターを用いて濾過し、凝集物を除去した後、濾液を逆浸透膜により脱塩し、濃度 0. 2%の無色透明のセリシン水溶液を得た。

次いで、この水溶液をエバポレーターを用いてセリシン濃度が約 2%になるまで濃縮させた後、凍結乾燥処理を行って、純度 90%以上で、平均分子量約 30, 000のセリシンの粉体を得た。なお、得られたセリシンの平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー法 (測定機器として、 LC 9A (株式会社島津製作所製）、カラムとして、 Superdex 75HR 10/30 (ファルマシア社製)を用いた）により測定した。

[0043] 繭糸からセリシンを抽出する際に使用する抽出溶媒を、蒸留水とした以外は、前記と同様にしてセリシン粉体を得た。この場合、得られたセリシンの平均分子量は約 10 0, 000であった。

繭糸からセリシンを抽出する際に使用する抽出溶媒を、 0. 5%炭酸水素ナトリウム水溶液とした以外は、前記と同様にしてセリシン粉体を得た。この場合、得られたセリシンの平均分子量は約 10, 000であった。

抽出溶媒の種類と、得られたセリシンの平均分子量との関係は下記表 1のとおりでめつに。

[0044] [表 1]

[0045] 例 1 : 成分の枪討 a (糖街)

糸田 ) ¾糸且の

下記表 2に示した組成に従って、溶液状態の細胞凍結保存用組成物（以下において「凍結保存液」または単に「保存液」ヽぅことがある）を調製し、それぞれ凍結保存液 al〜a9とした。

ここでセリシンは、前記で得られた平均分子量約 30, 000のセリシンを使用した。緩衝剤成分としては、 PBS (リン酸濃度 9. 5mM)を使用した。

血清成分としては、牛胎児血清 (以下、 FBS) (GIBCO社より入手)を使用した。

[0046] [表 2] 保存液糖類セリシン PBS FBS DMSO 種類使用量

al ― ―

a2 ― ― 1. 0 90. 0 ―

a3 スクロース 0, 5 1. 0 ― 10. 0 a4 マノレト一ス 0. 5 1. 0 ―

a5 トレノヽ口一ス 0. 5 1 0

a6 マノレチ卜ーノレ 0. 5 1. 0 ―

a7 デキストラン 0. 5 1. 0 ―

a8 メチノレセノレロース 0. 5 1. 0 ―

a9 ― 90. 0 ―

[0047] 凍結保存試験

試験には、 FBSを 10. 0%含む RPMI 1640培地 (旭テクノグラス株式会社製）を用〇〇

〇

いて培養したマウスミエローマ P3U1細胞 (財団法人ヒュー〇〇〇 O

〇 Oマンサイエンス振興財団より入手)を使用した。

〇

各凍結保存液に、細胞濃度が約 1. 0 X 10⁶cells/mlとなるように細胞〇を懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ (旭テクノグラス株式会社製）に lmlずつ添加した。次いで、凍結チューブを、—80°Cフリーザーを用いて 30日間凍結保存した後、 37°C水〇〇 d ο 〇浴に

〇〇〇〇〇 ο ο チューブを漬けて解凍した。〇解凍した保存液中の生細胞密度を、トリパンブルー色素排除法により算出し、各凍結保存液にっ、ての生存率を求めた。

結果は、表 3に示したとおりであった。

マルトースを添カ卩した保存液 a4は、セリシンのみ (保存液 a2)や他の糖類を添加した保存液と比較して、優れた凍結保護効果を示した。

[0048] [表 3]

[0049] 例 2: 成分の檢討 b (アミノ酸)

下記表 4に示した組成に従った以外は、例 1と同様にして、凍結保存液 bl〜b9を調製した。

[0050] [表 4]

(単位： g) [0051] 凍結保存試験も、凍結保存液として保存液 bl〜b9を使用した以外は、例 1と同様にして行った。

結果は、表 5に示されるとおりであった。

プロリンおよびグルタミンを 0. 3%ずつ添カ卩した保存液 b7は、セリシンのみやアミノ酸を単独で添加した保存液に比べて優れた凍結保護効果を示した。また、保存液 b 7の凍結保護効果は血清を使用したもの (保存液 bl)と同程度であった。

[0052] [表 5]

( N = 3 )

[0053] 例 3 : 成分の枪討 c (他の細朐凍結保讒成分)

下記表 6に示した組成に従った以外は、例 1と同様にして、凍結保存液 cl〜c6を調製した。

[0054] [表 6] 保存液他の細胞凍結保護成分セリシン PBS FBS マルスプロリングルタミン種類

cl ジメチノレスノレ

ホキシド一 ― 一

c2 ジメチルスル 1. 0 一 0. 5 0. 3 0. 3 ホキシド

c3 エチレングリコ 1. 0 — 0. 5 0. 3 0. 3 ール

c4 プロピレンダリ ¹ I 1—〇 d

〇0. 0 1. 0 0. 5 0. 3 0. 3 コール〇〇〇 ―

c5 グリセロール 1. 0 ― 0. 5 0. 3 0. 3 c6 ― 1. 0 100， 0 0. 5 0. 3 0. 3

(単位： g )

6〇〇 6

〇〇

凍結保存試験も、凍結保存液として保存液〇〇

[0055] cl〜c6を使用した以外は、例 1と同様にして行った。

ο

結果は、表 7に示されるとおりであった。

ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロールを添加した保存液 (保存液 c2〜c5)は優れた凍結保護効果を示した。

[0056] [表 7]

( N = 3 )

[0057] 例 4 : 5fe >の討 _d (緩衝剤成分)

下記表 8に示した組成に従った以外は、例 1と同様にして、凍結保存液 dl〜d6を調製した。 [0058] [表 8]

(単位： g)

[0059] 凍結保存試験も、凍結保存液として保存液 dl d6を使用した以外は、例 1と同様にして行った。

結果は、表 9に示されるとおりであった。

PBS HEPES,および TRICINEを添カ卩した保存液（d2 d6)は優れた凍結保護効果を示した。また、測定したいずれの緩衝剤成分濃度 (d4 d6)においても優れた凍結保護効果を示した。

[0060] [表 9]

(Ν=3)

[0061] 例 5: 成分の檢討 e (セリシンの平均分子畺)

平均分子量の異なるセリシンを用意して、下記表 10に示した糸且成に従つた以外は、例 1と同様にして、凍結保存液 el e6を調製した。

ここは、前記した「セリシンの調製」の項において得られた平均分子量約 10, 000 約 30, 000および約 100, 000のセジシンをそれぞれ使用した。

[0062] [表 10]

(単位： g )

[0063] 凍結保存試験も、凍結保存液として保存液 el e6を使用した以外は、例 1と同様にして行った。

結果は、表 11に示されるとおりであった。

平均分子量 3万のセリシンを添加した凍結保存液 (保存液 e3)は、より低分子量のセリシンおよびより高分子量のセリシンを添加した場合に比べて、優れた凍結保護効果を示した。

[0064] [表 11]

[0065] 例 6 : 他の細朐糠の凍結保存件能

使用する細胞を他の細胞種に変え、凍結保存液を例 5における凍結保存液 el、 e3 および e6とした以外は、例 1の凍結保存試験と同様にして試験を行った。

ここで使用した他の細胞種としては、正常ヒト皮膚繊維芽細胞 (NHDF) (Bio Whitt aker社より入手)、ラット副腎髄質褐色株化細胞 (PC— 12) (財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より入手）、 SDodoDera frugiDerda由来昆虫細朐（Sf— 9) (GIBCO社より入手）、 CHO (Chinese Hamster ovary)細胞（理化学研究所より入手）、 HepG2 細胞（理化学研究所より入手）、ハイプリドーマ細胞（Cytotechnology 10, 15-23, 199 2)、ヒト表皮角化細胞（HEK) (Cell APPLICATIONSJNC.より入手）およびゥサギ角膜初代細胞 (RC4) (理ィ匕学研究所より入手)を使用した。 NHDFは創傷治療や細胞毒性の研究などに使用されている。ハイプリドーマ細胞はモノクローナル抗体を産生し、 CHO細胞や Sf— 9細胞は遺伝子工学的手法により形質転換され生理活性物質を産生する等、これら細胞はタンパク質製造手段として工業的に利用されている。さらに HepG2細胞は人工肝臓のモデルとして、 PC— 12細胞は神経細胞への分ィ匕過程を調査する材料として有用な細胞である。 HEK細胞は皮膚刺激性試験、 RC4細胞は化粧品や農薬などの眼毒性試験に使用されている。

また、ハイプリドーマ細胞については、通常の凍結'解凍操作の後、再び凍結'解凍操作を繰り返し行った後、生存率を測定した。

結果は、表 12に示されるとおりであった。

本発明による凍結保存液 (保存液 e3)は、由来の違う各細胞において、血清を使用した場合 (保存液 el)と同程度の生存率を示した。

[0066] [表 12] 細胞の種類生存率（％)

保存液 el 保存液 e3 保存液 e6

NHDF 38.0 5.3

PC— 12 78.2

Sf-9 44.3 10, 1

CHO 71.2 31.1

HepG2 56.8

マウスハイブリドーマ 66, 7

(凍結 2回）

HEK 寸' 97.0

RC4 ω

(N=3)

寸卜

Claims

請求の範囲

[I] セリシンと、

アミノ酸、および糖類からなる群より選択される 1種以上の成分と

を少なくとも含んでなる、細胞凍結保存用組成物。

[2] セリシンと、アミノ酸と、糖類とを少なくとも含んでなる、請求項 1に記載の細胞凍結保存用組成物。

[3] セリシンの平均分子量が、 3, 000-300, 000である、請求項 1または 2に記載の細胞凍結保存用組成物。

[4] セリシンを、最終濃度が 0. 01〜10. 0重量％となるように含んでなる、請求項 1〜3 のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[5] アミノ酸が、プロリン、およびグルタミン力もなる群より選択される 1種以上のものである、請求項 1〜4の！、ずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[6] アミノ酸を、最終濃度が 0. 01〜： L0. 0重量％となるように含んでなる、請求項 1〜5 のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[7] 糖類が、マルトース型ニ糖類力も選択されるものである、請求項 1〜6のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[8] 糖類を、最終濃度が 0. 01〜： L0. 0重量％となるように含んでなる、請求項 1〜7の

V、ずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[9] ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロールカもなる群より選択される、追加の細胞凍結保護成分をさらに含んでなる、請求項

1〜8のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[10] 水溶液である、請求項 1〜9のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[II] 溶液としたときのその pHが室温で 6. 0〜8. 5となるように、緩衝剤成分をさらに含んでなる、請求項 1〜： L0の、ずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物。

[12] 下記の量で成分 (a)〜（d)を含んでなる、請求項 1〜： L 1のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物：

(a) セリシン 0. 01〜： L0. 0重量⁰ /₀ ;

0. 01〜： LO. 0重量％;

1. 0〜40. 0重量⁰ /₀ ;

(d) 緩衝剤成分 1〜： L000mM。

[13] 下記の量で成分 (a)〜（d)を含んでなる、請求項 1〜： L 1のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物：

(a) セリシン 0. 01〜： L0. 0重量⁰ /₀ ;

(bl) アミノ酸 0. 01〜： L0. 0重量％;

(b2) 糖類 0. 01〜： L0. 0重量％;

1. 0〜40. 0重量⁰ /₀ ;

(d) 緩衝剤成分 1〜： L000mM。

[14] 請求項 1〜13のいずれか一項に記載の細胞凍結保存用組成物中に目的細胞を入れ、これを凍結保存することを含んでなる、細胞の凍結保存方法。

[15] 細胞の凍結保存における細胞生存率を高めるための、セリシンと、アミノ酸、および糖類力なる群より選択される 1種以上の成分との組み合わせの使用。

[16] 成分の組み合わせが、セリシンと、アミノ酸と、糖類とを少なくとも含んでなる、請求項 15に記載の使用。