CN105532643A - 精子冷冻保护剂及其制备方法 - Google Patents

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CN105532643A CN201511028340.6A CN201511028340A CN105532643A CN 105532643 A CN105532643 A CN 105532643A CN 201511028340 A CN201511028340 A CN 201511028340A CN 105532643 A CN105532643 A CN 105532643A
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human serum
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sperm
protecting agent
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CN201511028340.6A
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朱文兵
卢光琇
范立青
彭向杰
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Reproductive and Genetic Hospital of CITIC Xiangya Co Ltd
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

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Abstract

本发明涉及一种精子冷冻保护剂及其制备方法，所述每125mL精子冷冻保护剂含有下列成分：蔗糖，碳酸氢钠，甘油，人血白蛋白以及五蒸水。本发明所采用的新型的精子冷冻保护剂配方，不含卵黄，仅包含蔗糖、碳酸氢钠、甘油、20％(g/mL)人血白蛋白等几种常用的且化学成分明确的试剂，不存在动物源性致病菌感染的风险，而且所得到的冷冻效果与现有配方相仿，精子冷冻复苏率平均值在75％-80％左右。

Description

精子冷冻保护剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及辅助生殖技术精子冷冻保存领域，特别是涉及一种精子冷冻保护剂及其制备方法。
背景技术
人类精子的冷冻保存对于人类生殖健康有着重要的作用，而在冷冻过程中添加的冷冻保护剂为影响冷冻保存效果的关键因素之一。
目前各精子库和生殖中心所采用的精子冷冻保护剂多采用卵黄、甘油、蔗糖配方，由于必须添加卵黄，导致冷冻保护剂的成分相当复杂，存在动物源性致病菌感染的风险。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种精子冷冻保护剂及其制备方法，本发明精子冷冻保护剂不含卵黄，不存在动物源性致病菌感染的风险。
为实现上述技术目的，具体技术方案如下：
一种精子冷冻保护剂，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分：
蔗糖16±0.1g，碳酸氢钠0.5±0.05g，甘油36±0.5mL，人血白蛋白25±0.2mL，五蒸水余量。
在其中一些实施例中，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分：
蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，人血白蛋白25mL，五蒸水余量。
在其中一些实施例中，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白蛋白。
本发明还提供一种上述精子冷冻保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照上述成分配比称取所述蔗糖、碳酸氢钠、甘油、人血白蛋白以及五蒸水备用；
(2)依次放入所述五蒸水、蔗糖、甘油、碳酸氢钠，搅拌均匀；
(3)过滤，在滤过液中加入所述人血白蛋白，搅拌；
(4)分装，冷冻保存。
在其中一些实施例中，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白蛋白。
在其中一些实施例中，所述步骤(2)中的搅拌时间为14～16分钟。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中的搅拌时间为14～16分钟。
在其中一些实施例中，所述步骤(4)中的冷冻保存温度为-74～-76℃。
在其中一些实施例中，所述过滤为用孔径为0.45um的滤芯过滤。
本发明相较现有技术的优点以及有益效果为：
本发明所采用的新型的精子冷冻保护剂配方，不含卵黄，仅包含蔗糖、碳酸氢钠、甘油、20％(g/mL)人血白蛋白等几种常用的且化学成分明确的试剂，不存在动物源性致病菌感染的风险，而且所得到的冷冻效果与现有配方相仿，精子冷冻复苏率平均值在75％～80％。
本发明制备方法简单，整个制备过程可在1小时内完成，简单高效。
具体实施方式
实施例中所用原料均为市售常规原料。
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本发明实施例中所用的20％(g/mL)人血白蛋白购自瑞士杰特贝林生物制品有限公司。
实施例1
一种精子冷冻保护剂，其配方成分及含量如下：
蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，20％(g/mL)人血白蛋白25mL，五蒸水60mL。
上述精子冷冻保护剂的制备方法包括以下步骤：
1、电子天平称取蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g；
2、量筒量取甘油36mL，20％(g/mL)人血白蛋白25mL，及60mL五蒸水(按常规方法自制，将水反复蒸馏五次所得)备用；
3、先将60mL五蒸水加入250mL烧杯中，然后放入搅拌磁珠；
4、将烧杯放置于磁力搅拌器上，先将转速调至最低，打开电源，再将转速调至适当速度，以保持较大转速而烧杯中液体不飞溅出来；
5、依次加入蔗糖，甘油及碳酸氢钠，共搅拌15分钟使之充分溶解；
6、用孔径为0.45um的滤芯过滤，在滤过液中加入人血白蛋白，再次搅拌15分钟；
7、在无菌的环境下分装成25mL装小瓶，保存于-75℃备用。
以下通过实验来检测实施例的精子冷冻效果
检测方法：冷冻实验
1、选用市面上常用的含卵黄的精子冷冻保护剂(称为对比例1)和按本配方实施例1所配制的精子冷冻保护剂各10mL；
2、选取精子密度为40-80×106个/mL，活率为30-60％，体积为2-5mL的精液标本共25份，并登记其常规参数；
3、按照精子冷冻保护剂：精液＝1：3(体积比)的比例将精子冷冻保护剂与精液混合，即每管1mL的混合液体中，包含0.25mL的精子冷冻保护剂和0.75mL的精液，每份标本均各做两管不同精子冷冻保护剂的冷冻实验；充分混合均匀后，按程序冷冻仪预设的程序进行冷冻；
4、将混合液体降温至-196℃并达到稳定之后，从液氮中取出冷冻精液，在水浴摇床中解冻(37℃)；
5、解冻后，再次利用相差显微镜，对精子密度、活率等常规参数进行检验并登记为冻后；
6、冻后活率÷冻前活率×100％＝冷冻复苏率。
检测所用仪器
仪器 公司
相差显微镜 奥林巴斯2 -->
计数板 以色列赛飞
移液枪 吉尔森
水浴摇床 Julabo
程序冷冻仪 Thermo
液氮罐 CBS
具体实验数据请见下表：
数据检测方法：两组冷冻复苏率采用SPSS17.0进行配对T检验，p＝0.12，p>0.05，两者无统计学差异。
由上表可知，本发明所采用的新型的精子冷冻保护剂配方，不含卵黄，仅包含蔗糖、碳酸氢钠、甘油、20％(g/mL)人血白蛋白等几种常用的且化学成分明确的试剂，不存在动物源性致病菌感染的风险，而且所得到的冷冻效果与现有配方相仿，精子冷冻复苏率平均值在75％～80％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种精子冷冻保护剂，其特征在于，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分：
蔗糖16±0.1g，碳酸氢钠0.5±0.05g，甘油36±0.5mL，人血白蛋白25±0.2mL，五蒸水余量。
2.根据权利要求1所述的精子冷冻保护剂，其特征在于，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分：
蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，人血白蛋白25mL，五蒸水余量。
3.根据权利要求1或2所述的精子冷冻保护剂，其特征在于，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白蛋白。
4.一种权利要求1～3任一项所述的精子冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照权利要求1或2的成分配比称取所述蔗糖、碳酸氢钠、甘油、人血白蛋白以及五蒸水备用；
(2)依次放入所述五蒸水、蔗糖、甘油、碳酸氢钠，搅拌均匀；
(3)过滤，在滤过液中加入所述人血白蛋白，搅拌；
(4)分装，冷冻保存。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的搅拌时间为14～16分钟。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的搅拌时间为14～16分钟。
8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的冷冻保存温度为-74～-76℃。
9.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述过滤为用孔径为0.45um的滤芯过滤。
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