CN110476951A - 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 - Google Patents

肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110476951A
CN110476951A CN201910644652.1A CN201910644652A CN110476951A CN 110476951 A CN110476951 A CN 110476951A CN 201910644652 A CN201910644652 A CN 201910644652A CN 110476951 A CN110476951 A CN 110476951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
liquid
dilution
goat
freezen protective
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910644652.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110476951B (zh
Inventor
李广
王建刚
安小鹏
张磊
张效川
郭丹
补琪琪
杨少华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN201910644652.1A priority Critical patent/CN110476951B/zh
Publication of CN110476951A publication Critical patent/CN110476951A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110476951B publication Critical patent/CN110476951B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了一种肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法，本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子起到保护作用，减少损伤，明显提高了山羊冷冻精液的精子活力和顶体的完整率。

Description

肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备 方法
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，涉及动物繁殖技术，尤其涉及肝素钠用 于制备山羊精液保存用稀释液的应用及制备方法。
背景技术
精液冷冻保存是动物生物技术体系中的关键环节之一，主要解决精液长 期稳定保存的问题。通过精液的人工采集和长期保存，实现动物生产的精液 能够跨时间、跨地域、多种方式的被利用，从而极大提高了雄性动物在实际 生产和科学研究领域中的使用价值。例如在动物育种领域，对于育种值估计、 种质资源保护、品种改良、新品种育成、实现工厂化规模化养殖等方面，以 及降低生产成本和提高经济效益具有重要意义。
研究表明，精子在降温和冷冻保存的过程中，很容易产生各种损伤，包 括物理性的、化学性的和生物性的损伤。与新鲜精液相比较，经冷冻/解冻 处理的精液，其精子的成活率、精子活力、顶体完整率、线粒体活性和受胎 率显著下降，而山羊的精液更是如此，这对于生产实践和科学研究来说是极 其不利的因素。尽管山羊精液的冷冻保存技术已经有了长足的发展，但目前 仍然存在精液经冷冻-解冻处理后精子活力不高的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷或者不足，本发明提供了一种肝素钠用于制备山羊 精子保存用稀释液的应用及制备方法。
本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所提供的山羊精 子冷冻保存用稀释液用于保存山羊精子，包括肝素钠。
具体的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用 稀释液包括肝素钠、营养物质以及抗菌物质。
优选的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用 稀释液包括肝素钠、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。
更优选的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、果糖、柠檬 酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉 素。
此外，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
本发明所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5 g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，乙二 醇6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解， 调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.002-0.008g，加入C液50mL溶解后定容至100mL， 即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
更具体的，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL 无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL， 加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH 至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.005g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得 到山羊精子冷冻保存用稀释液。本发明的有益效果是：
本发明的山羊精液冷冻保存用稀释液，精液经冷冻-解冻处理后，精液 的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到45.39±1.91％，53.68±1.87％ 和48.67±2.32％，与对比例不添加肝素钠的山羊精液冷冻保存用稀释液相 比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
肝素钠(Heparin sodium)是一种硫酸氨基葡萄糖钠盐，已有的临床研究 表明，肝素钠能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作 用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合而增强后者对活化的 凝血因子的抑制作用，其后果涉及阻止血小板凝集和破坏、妨碍凝血激活酶 的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白，从 而发挥抗凝作用。
然而，经发明人的偶然发现，山羊精液冷冻保存用稀释液中偶然加入肝 素钠后，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子会起到一定的保护作用， 但是初期的研究没有获得较高的保护效果。分析可能是由于肝素钠的添加量 或者稀释液中其他成分的相互作用导致保护效果并不好。经不断的实验研 究，发现目前的配方条件下，包括配方中的组分以及组分的含量范围，能到 有效减少损伤，明显提高了山羊冷冻精液的精子活力和顶体的完整率。
后期经过一系列的研究，能够证明山羊精液在冷冻过程中，肝素钠对精 子起到保护作用，但是具体的保护机理目前还不明确，还处在进一步探究中。
另外，为保证效果，本发明的用于山羊精液冷冻保存的稀释液，应现用 现配。本发明的山羊精液保存用稀释液，包括柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢 钠(三者共同起到维持渗透压以及酸碱调节作用)、果糖(作为能源，主要 作用是补充精子能量，也是一种简单的稀释剂)、卵磷脂(具有类似卵黄中 具有抗低温打击保护能力的主要功能性成份)、二甲基亚砜、乙二醇(均作 为冷冻保护剂)青霉素、链霉素(均作为抑菌物质)和肝素钠。
为了说明上述各实施例中山羊精子冷冻保存用稀释液对山羊精液的保存 效果，发明人对精子的活率、顶体完整率和质膜完整率进行了观测，随机抽 取10支细管冻精，37℃水浴20s解冻。取10μL精液，置于全自动精子质 量分析仪的样品池中，观测精子的活率、顶体完整率和质膜完整率。同时， 为了确定肝素钠以及与肝素钠配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释 液中的最适添加浓度，实施例共设置5组，每组中肝素钠以及与肝素钠配比 的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的添加浓度均不同。同时，为进 一步说明肝素钠的在山羊精子冷冻保存用稀释液所起到的有益效果，特与各 对比例的效果加以对比。
实施例1：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取肝素钠0.008g，加入C液50mL 充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，D液即是添加肝素钠的山羊精子 冷冻保存精液稀释液。
山羊精液的制备：
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精:
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封 口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置 于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长 期保存。
对比例1：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例2：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取肝素钠0.002g，加入C液50mL充分溶解， 定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释 液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例2：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或 者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平准确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例3：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取肝素钠0.002g，加入C液50mL 充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保 存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封 口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置 于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长 期保存。
对比例3：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下 检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8 的精液定为合格精液。
取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min 离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左 右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平 衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例4：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液5 0mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取肝素钠0.008g，加入C液50mL 充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保 存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例4：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液5 0mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下 检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8 的精液定为合格精液。
取(4)检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000 转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万 /mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在 17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例5：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g， 准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取肝素钠0.005g，加入C液50mL充分溶解， 定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释 液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例5：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g， 准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下 检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8 的精液定为合格精液。
取(4)检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000 转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万 /mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在 17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例与对比例的试验效果如下：
实施例1效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是43.23±1.82％，51.12±1.78％ 和46.35±2.21％。统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活 率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活 率比对比例组提高了34.59±1.31％，顶体完整率提高了11.79±1.04％，质 膜完整率提高了21.14±1.16％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊 精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例2效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是38.91±1.64％，46.01±1.60％ 和41.72±1.99％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活 率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活 率比对比例组提高了36.27±1.18％，顶体完整率提高了13.18±0.94％，质 膜完整率提高了22.66±1.05％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊 精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例3效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是35.02±1.47％，41.40±1.44％ 和37.54±1.79％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活 率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活 率比对比例组提高了33.79±1.06％，顶体完整率提高了11.13±0.84％，质 膜完整率提高了20.43±0.94％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊 精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例4效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是39.12±1.64％，46.26±1.61％ 和41.95±2.00％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活 率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活 率比对比例组提高了34.23±1.19％，顶体完整率提高了11.49±0.94％，质 膜完整率提高了20.82±1.05％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊 精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例5效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是45.39±1.91％，53.68±1.87％ 和48.67±2.32％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活 率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活 率比对比例组提高了36.24±1.38％，顶体完整率提高了12.35±1.09％，质 膜完整率提高了22.15±1.22％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊 精子的冷冻保存，具有良好的效果。
如各实施例和不添加肝素钠的各对比例所示，实施例组与对比例组相比 精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，由此表明，本 发明添加肝素钠的的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
如实施例1和实施例4所示，具有同样含量肝素钠的山羊精子冷冻保存 用稀释液，均能显著提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，但是实施 例1的效果优于实施例5，说明肝素钠的添加量并不是越多越好，其与山羊 精子冷冻保存用稀释液中的其他成分有一个最佳的适配范围，只有配方中各 组分处在适配范围，才能起到最大效果。
通过以上结果可以得出，本发明稀释粉配方中添加0.002-0.008g的肝 素钠能显著延长精子有效保存时间，提高精子的活率、顶体完整率和质膜完 整率，其中添加0.005g的肝素钠效果更好，精液经冷冻-解冻处理后，精 液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到45.39±1.91％，53.68± 1.87％和48.67±2.32％，与对比例不添加肝素钠的山羊精液冷冻保存用稀释 液相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
进一步，为了说明本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山 羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，特设置了实施例6：
实施例6：
本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段 精液冷冻保存均具有良好的效果，试验已经对不同年龄段的陕西关中奶山 羊、不同年龄段的黑山羊以及黄羊的精液冷冻保存效果均进行了验证，试验 方法同上(不做详述)，结果表明：本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液， 能有效提高解冻后精液的精子活率、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶 山羊冻精生产效率冻精品质。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发 明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要 求所涵盖。

Claims (7)

1.肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用。
2.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、营养物质以及抗菌物质。
3.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。
4.如权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
5.如权利要求4所述的山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
6.权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，乙二醇6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.002-0.008g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
7.权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.005g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
CN201910644652.1A 2019-07-17 2019-07-17 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 Expired - Fee Related CN110476951B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910644652.1A CN110476951B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910644652.1A CN110476951B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110476951A true CN110476951A (zh) 2019-11-22
CN110476951B CN110476951B (zh) 2022-01-04

Family

ID=68547223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910644652.1A Expired - Fee Related CN110476951B (zh) 2019-07-17 2019-07-17 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110476951B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115005200A (zh) * 2022-07-26 2022-09-06 吉林大学 一种用于畜禽的精液稀释液及其制备方法
CN115251046A (zh) * 2022-08-18 2022-11-01 西安市畜牧技术推广中心 一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2323702C2 (ru) * 2006-05-31 2008-05-10 ФГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела (ВНИИплем) Синтетическая среда для разбавления и криоконсервации спермы баранов
CN106520680A (zh) * 2016-10-11 2017-03-22 河南科技大学 一种牛精子获能液及精子体外获能方法
CN107034180A (zh) * 2017-05-24 2017-08-11 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种精子洗涤液及其制备方法
CN107988149A (zh) * 2017-11-22 2018-05-04 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种精子活力液及其制备方法
CN108094409A (zh) * 2018-01-12 2018-06-01 刘铮铸 绵羊精液冷冻稀释液的制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2323702C2 (ru) * 2006-05-31 2008-05-10 ФГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела (ВНИИплем) Синтетическая среда для разбавления и криоконсервации спермы баранов
CN106520680A (zh) * 2016-10-11 2017-03-22 河南科技大学 一种牛精子获能液及精子体外获能方法
CN107034180A (zh) * 2017-05-24 2017-08-11 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种精子洗涤液及其制备方法
CN107988149A (zh) * 2017-11-22 2018-05-04 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种精子活力液及其制备方法
CN108094409A (zh) * 2018-01-12 2018-06-01 刘铮铸 绵羊精液冷冻稀释液的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘灵 等: "奶山羊精子体外获能与体外受精试验", 《农业科学集刊》 *
李焕德等: "《临床基本药物手册 第二版》", 31 January 2018, 湖南科学技术出版社 *
桑润滋 等: "《动物高效繁殖理论与实践》", 30 June 2011, 中国农业大学出版社 *
桑润滋等: "《肉羊快繁新技术》", 31 December 2003, 中国农业大学出版社 *
焦万田: "《新编简明药物手册》", 31 January 2017, 河南科学技术出版社 *
邓晓惠: "《生殖医学技术及其彩色图谱》", 31 October 2004, 山东科学技术出版社 *
金水仙 等: "鸭精子体外获能及获能后测定方法的研究", 《浙江畜牧兽医》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115005200A (zh) * 2022-07-26 2022-09-06 吉林大学 一种用于畜禽的精液稀释液及其制备方法
CN115251046A (zh) * 2022-08-18 2022-11-01 西安市畜牧技术推广中心 一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110476951B (zh) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ren et al. Lycium barbarum and Laminaria japonica polysaccharides improve Cashmere goat sperm quality and fertility rate after cryopreservation
CN110447635A (zh) 多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法
KR102328832B1 (ko) 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법
CN110476951A (zh) 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法
Zeng et al. Survival of boar spermatozoa frozen in diluents of varying osmolality
CN106538510A (zh) 番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用
CN109997844A (zh) 灵芝多糖在家畜精液冷冻长期保存中的应用
CN102986647B (zh) 无动物源冻精稀释液
CN114903032A (zh) 东佛里生奶绵羊冷冻精液制备方法
CN109907038B (zh) 一种无动物源成分牛冻精稀释液
Fabbrocini et al. Effect of differential addition of glycerol and pyruvate to extender on cryopreservation of Mediterranean buffalo (B. bubalis) spermatozoa
CN107027741B (zh) 一种不含卵黄的人精子冷冻保护液及保存方法
CN1475109A (zh) 布尔山羊细管精液冷冻方法
CN110432258A (zh) 虫草素用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法
Asr et al. The evaluations of Tris-citrate acid or Bioxcell extenders on the post-thawed buffalo sperm parameters
CN105519521B (zh) 一种马精液冷冻保存液及其配制方法
CN115517242B (zh) 一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用
Bamba et al. Freezing rabbit semen by the use of BF5 diluent
CN110583624B (zh) 一种黄鳝精子高效使用方法
CN106259307B (zh) 一种马精子低温及冷冻保存稀释液
CN109122666A (zh) 一种复苏即用型红细胞冷冻保护剂及使用方法
CN115251046A (zh) 一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用
Ali et al. Freezability of water buffalo spermatozoa is improved with the addition of catalase in cryodiluent
CN110234750A (zh) 细胞的冻存组合物和冻存方法
Rahman et al. Effect of bovine serum albumin in extender on post-thaw quality and in vivo fertility of buffalo bull semen

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220104