CN110234750A - 细胞的冻存组合物和冻存方法 - Google Patents

细胞的冻存组合物和冻存方法 Download PDF

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Abstract

冻存细胞时，简便地进行添加来提高细胞的存活率。一种组合物，含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂，从即将冻存细胞到冻存细胞6小时前的期间，添加该组合物并使该组合物达到1容量％后保存细胞。该组合物会减少细胞遭受的冻害，由此可提高冻存时的细胞存活率，从而能够在不使用DMSO和血清的情况下保存细胞。并且，冻存细胞时也不需要对冻结速率进行精细的控制，是一种简便低廉的保存方法。

Description

细胞的冻存组合物和冻存方法
技术领域
本发明涉及一种用于冻存细胞的冻存组合物和使用了该冻存组合物的冻存方法。
背景技术
在防止传代导致的细胞转化、防止随传代产生的杂菌造成汚染、输送细胞等方面，细胞冻存是一种必需技术，其已得到广泛利用。但是，已知：在冻结细胞的过程中细胞内外的水分会形成冰结晶而对细胞造成损害(非专利文献1)。因此，期望：保护细胞在冻结、融化时不受损害，而且在维持细胞性质的状态下进行冻存。
就普通的冻存而言，为了保护细胞不受由冰结晶引发的损害，一般采用下述做法：使细胞悬浮于添加有抗冻剂的含有牛血清等的培养液中，然后装入Cryo Tube(低温保存管)冻存管等中进行冷却，最终在－80℃或－196℃的极低温度下进行冻存。抗冻剂采用5～20％的二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)等(专利文献1、2)。其中效果最高、最常用的是DMSO(非专利文献2)，但其并不能使细胞的保存率达到令人满意的结果，对冰结晶的抑制效果也不一定称得上充分。
此外，有通过添加聚醚来增强DMSO的效果的方式(专利文献3)、通过使用果聚糖(Fructan)来提高细胞保护效果的方式(专利文献4)、通过配合羧化多聚赖氨酸开提高干细胞的保存效果的方式(专利文献5)，但冰结晶生成抑制效果都称不上充分。而且，聚醚的残留带来的细胞毒性令人担忧，需要有一种毒性更低的保存液。此外，果聚糖由于添加浓度高达30％而存在经济方面的问题、保存后难以除去的问题，羧化多聚赖氨酸的细胞保存仅着眼于干细胞，因此通用性差，且由于是多肽，对细胞的功能性的影响令人担忧，等等，出于上述原因，上述做法对细胞的保存效果并不一定令人满意。因此，需要一种能够保存任何细胞的低毒性的保存液。
专利文献1：日本专利第5940975号
专利文献2：日本公开专利公报特开2001－247401号
专利文献3：日本公开专利公报特表平10－511402号
专利文献4：日本公开专利公报特开2012－235728号
专利文献5：日本专利第5630979号
专利文献6：日本公开专利公报特开2016－160244号
非专利文献1：Mazur，Am.J.Physiol.，247：C125－142，1984
非专利文献2：Kovelock JE and Bioshop MWH，Nature 183：1394－1395，1959
发明内容
－发明要解决的技术问题－
就现有的冻存法而言，对冰结晶的生成抑制效果不充分，保护细胞不受冻害影响的效果不充分，因此需要开发一种毒性较低的新型冻存剂。
－用以解决技术问题的技术方案－
本发明的发明人为解决上述问题而进行了潜心研究。其结果是，发现了：槐糖脂(SL)具有抑制冰结晶生成的效果，能够简便地抑制冻害对细胞的损害。利用这一点，发现了：通过向冻存前的细胞培养液中添加0.01重量％到20重量％的SL，能提高细胞的保存效率。还发现了：冻结细胞时，若添加0.01重量％到20重量％的SL，则能缓和DMSO的毒性。而且发现了：通过向0.01重量％到20重量％的SL中添加1重量％到50重量％的多元醇，能在不添加DMSO的情况下提高保存后的细胞存活率。即，本发明提供以下技术方案。
[1]一种组合物，其中，含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂(sophorolipid)，且用于提高冻存后的细胞存活率。
[2]根据[1]所述的组合物，其中，含有5重量％到10重量％的二甲基亚砜(DMSO，Dimethyl sulfoxide)。
[3]根据[1]或[2]所述的组合物，其中，含有1重量％到50重量％的多元醇。
[4]根据[3]所述的组合物，其中，作为多元醇，包括甘油、乙二醇、丙二醇中的至少一者。
[5]一种冻存细胞的方法，其中，从即将冻存细胞到冻存细胞6小时前的期间，向细胞培养基中添加[1]所述的组合物并使该组合物达到1容量％，来冻存细胞。
[6]一种冻存细胞的方法，其中，在冻存细胞时，向细胞培养基中添加[2]到[4]所述的组合物并使该组合物达到10容量％到99容量％，来冻存细胞。
－发明的效果－
通过添加SL，能够减少细胞遭受的冻害。其结果是，不依赖DMSO和血清的效果就能够实现一定水准以上的细胞存活率。
附图说明
图1是冰晶形成抑制情况的显微镜图片，其中，(A)为超纯水，(B)为10重量％SL，(C)为0.1重量％SL，(D)为10重量％DMSO，(E)为10重量％Gly，(F)为10重量％PG，(G)为10重量％EG，(H)为10重量％APG。
图2示出细胞标记的表达情况。
图3是细胞形态的显微镜图片，其中，(A)为0.2重量％SL+30重量％Gly，(B)为0.2重量％SL+20重量％Gly，(C)为0.2重量％SL+15重量％Gly，(D)为0.1重量％SL+30重量％Gly，(E)为0.1重量％SL+20重量％Gly，(F)为0.1重量％SL+15重量％Gly，(G)为0.05重量％SL+30重量％Gly，(H)为0.05重量％SL+20重量％Gly，(I)为0.05重量％SL+15重量％Gly，(J)为30重量％Gly，(K)为20重量％DMSO。
具体实施方式
SL是低毒性的糖脂类生物表面活性剂，是通过酵母发酵得到的发酵产物。可认为：通过在冻结细胞前添加SL(事先添加)，SL就会被摄入细胞内，能发挥抑制细胞内的冰形成结晶的效果，通过在冻结时添加SL能发挥抑制细胞外的冰形成结晶的效果。在下述实验例、实施例中使用的SL是按照日本公开专利公报特开2016－160244号公报的记载调配而成的。需要说明的是，作为SL，使用了将pH调节为6～8而成的物质。pH调节剂例如有碱剂、酸等。
多元醇有甘油、乙二醇、丙二醇等，优选为丙二醇。
细胞保存液的细胞是动植物细胞。例如有体细胞、癌细胞、株化细胞、干细胞等。
此外，同样还适用于由细胞构成的组织、器官、动植物等的个体。在植物性食品和植物性食品的鲜度保持方面很有前景。
使用了本发明的冻结、融化方法没有特别限定，冻结时不用进行精细的温度控制，通过普通的缓慢冻结、快速融化也能够实现。
[实验例冰结晶抑制组合物和冰晶生成抑制效果]
在细胞保存时最通用的培养基即Dublecco改良培养基(DMEM)中，将表1的组合物以7∶3的容量比混合。取各试样15mL并分别加入离心管(Thermo Scientific BioLite)，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却，以-80℃冷却10分钟后，目视观察了试样的外观。
[表1]
组成 冰结晶抑制效果
实验例1 33重量％SL ○
实验例2 0.033重量％SL ○
实验例3 33重量％APG ○
实验例4 0.033重量％APG ○
实验例5 蒸馏水或超纯水 ×
实验例6 33重量％DMSO △
○：未观察到冰的结晶
△：观察到较小的冰的结晶
×：观察到较大的冰的结晶
APG：烷基聚糖苷*
(*PLANTACARE 2000UP，Basf Japan Ltd.)
根据表1的结果，与实验例5、6相比，实验例1～4的冰结晶生成抑制效果更佳。
以达到表2的组成的方式，用超纯水进行了调配。将各试样在扫描探针显微镜(AFM5000/AFM5300，Hitachi High-Tech Science Corporation)的冷却台上冻结后，用光学显微镜进行观察。本试验是在大阪大学纳米技术设备供用据点的协助下实施的。并且，用图像解析软件(OLYMPUS cellSens Standard)解析观察到的图像，测量出每个冰的结晶的面积。
[表2]
※SL：槐糖脂
Gly：甘油
EG：乙二醇
PG：丙二醇
APG：烷基聚糖苷
图1是冰晶形成抑制情况的显微镜图片，其中，(A)为超纯水，(B)为10重量％SL，(C)为0.1重量％SL，(D)为10重量％DMSO，(E)为10重量％Gly，(F)为10重量％PG，(G)为10重量％EG，(H)为10重量％APG。如图1(B)和(C)所示，组成是SL时，不管是10重量％还是0.1重量％，都具有冰晶形成抑制效果。如图1(A)、(D)、(E)、(F)以及(G)所示，组成是SL以外的物质时，冰晶形成抑制效果不充分，不过如图1(H)所示，组成是与SL同为糖脂类表面活性剂的APG时，可观察到冰晶形成抑制效果。
实施例
[1冻存预培养时添加SL的效果(人正常成纤维细胞，含血清培养基)]
将人正常成纤维细胞(KURABO INDUSTRIES LTD.)种植到6孔板上并使细胞密度达到3.2×104cells/ml，培养48小时。培养后，除去培养基，用含有胎牛血清的DMEM稀释5重量％SL水溶液以使其达到0.05容量％后添加于所培养的成纤维细胞。培养规定时间后，通过台盼蓝染色测量活细胞数(冻结前的活细胞数)。使剩余的细胞在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中悬浮于10％DMSO/含有胎牛血清的DMEM(1mL)，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，通过台盼蓝染色测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。将剩余的细胞悬浮液种植到6孔板上并培养72小时。通过台盼蓝染色测量培养后的活细胞数(培养后的活细胞数)。
通过下列式子分别计算出解冻时的存活率和增殖率。
解冻时的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/解冻后的总细胞数×100
增殖率(％)＝培养后的活细胞数/解冻后的活细胞数×100
[表3]
试样 解冻时的存活率(％) 增殖率(％)
比较例1 未添加 86.7 467.8
实施例1 在回收细胞1小时前添加 91.4 570.5
实施例2 在回收细胞4小时前添加 90.1 753.5
实施例3 在回收细胞6小时前添加 94.9 741..6
由表3的结果可知，与未添加SL的情况相比，在冻存细胞的1小时到6小时前添加SL后培养细胞的情况下，细胞解冻时的存活率和细胞增殖率提高。
并且，除了解冻时的存活率以外，还对冻结前后的存活率进行了研究。即，将人正常成纤维细胞(KURABO)种植到10mm培养皿中并使细胞密度达到4.0×104cells/ml，培养72小时。培养后，添加5重量％SL水溶液并使其浓度达到0.05容量％。培养规定时间后，种植到96孔板上并使细胞密度达到2.0×104cells/ml，培养6小时或72小时，利用CellcountingKit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(未冻结的吸光度)。用剩余的细胞调配细胞悬浮液并使细胞密度达到4.0×105cells/ml，在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中与20％DMSO以1∶1的容量比混合。装入冻结处理容器BICELL(Nihon Freezer Co.，Ltd.)，并在-80℃的条件下冷却。保存一晚后，以37℃迅速解冻，取100μL种植到96孔板上并培养6小时或72小时，利用Cellcounting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(冻存后的吸光度)。
通过下列式子计算出冻结前后的存活率和增殖率。
冻结前后的存活率(％)＝冻存后的吸光度(培养6小时)/未冻结的吸光度(培养6小时)
增殖率(％)＝冻存后的吸光度(培养72小时)/未冻结的吸光度(培养72小时)
[表4]
试样 存活率(％) 增殖率(％)
比较例 未添加 60.7 93.4
实施例27 在回收细胞1小时前添加 77.4 102.0
实施例28 在回收细胞4小时前添加 79.2 98.8
实施例29 在回收细胞6小时前添加 82.7 96.4
由表4的结果可知，与未添加SL的情况相比，在冻存细胞的1小时到6小时前添加SL后培养细胞的情况下，细胞冻结前后的存活率和细胞增殖率提高。
[2冻存预培养时添加SL的效果(人正常成纤维细胞，无血清培养基)]
将人正常成纤维细胞(KURABO INDUSTRIES LTD.)种植到6孔板上并使细胞密度达到3.2×104cells/ml，培养48小时。培养后，除去培养基，用DMEM培养基稀释5重量％SL水溶液以使其达到0.05容量％后进行添加。培养6小时后，通过台盼蓝染色测量活细胞数(冻结前的活细胞数)。使剩余的细胞在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中悬浮于10％DMSO/DMEM(1mL)，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，通过台盼蓝染色测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子计算出冻结前后的存活率。
冻结前后的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/冻结前的活细胞数×100
[表5]
试样 冻结前后的存活率(％)
比较例2 未添加 74.3
实施例4 在回收细胞6小时前添加 97.0
由表5的结果可知，与未添加SL的情况相比，在冻存细胞的6小时前添加SL后培养细胞的情况下，冻结前后的细胞的存活率提高。
[3冻存预培养时添加SL的效果(间充质干细胞，无血清培养基)]
将间充质干细胞(Lonza)种植到6孔板上并使细胞密度达到3.2×104cells/ml，培养48小时。培养后，除去培养基，用MSCGM-CD培养基稀释5重量％SL水溶液以使其达到0.05容量％后进行添加。培养6小时后，通过台盼蓝染色测量活细胞数(冻结前的活细胞数)。使剩余的细胞在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中悬浮于10％DMSO/MSCGM-CD培养基(1mL)，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，通过台盼蓝染色测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子计算出冻结前后的存活率。
冻结前后的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/冻结前的活细胞数×100
[表6]
试样 冻结前后的存活率(％)
比较例3 未添加 84.3
实施例5 在回收细胞6小时前添加 94.5
由表6的结果可知，与未添加SL的情况相比，在冻存细胞的6小时前添加SL后培养细胞的情况下，细胞的冻结前后的存活率提高。
[4未进行冻存预培养时添加SL的效果(人正常成纤维细胞，含血清培养基)]
通过台盼蓝染色测量人正常成纤维细胞(KURABO)的活细胞数(冻结前的活细胞数)。使细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM。在CRYOGENICVIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表7、8的各试样与细胞悬浮液以3：7的容量比混合，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，通过台盼蓝染色测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。将剩余的细胞悬浮液种植到6孔板上并培养72小时。通过台盼蓝染色测量培养后的活细胞数(培养后的活细胞数)。
通过下列式子分别计算出冻结前后的存活率和增殖率。
冻结前后的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/冻结前的活细胞数×100
增殖率(％)＝培养后的活细胞数/解冻后的活细胞数×100
[表7]
浓度和成分 冻结前后的存活率(％)
实施例7 0.033重量％SL+3.3重量％Gly 5.9
实施例8 0.033重量％SL+16.5重量％Gly 39.8
实施例9 0.033重量％SL+33重量％Gly 73.9
实施例10 0.033重量％SL 5.4
实施例11 0.033重量％SL+3.3重量％PG 7.1
实施例12 0.033重量％SL+16.5重量％PG 71.4
实施例13 0.033重量％SL+33重量％PG 100.0
比较例4 33重量％DMSO 84.8
比较例5 33重量％Gly 68.9
比较例6 33重量％PG 54.9
Gly：甘油(浓甘油，ACIDCHEM INTERNATIONAL公司制造)
PG：丙二醇(ADEKA CORPORATION制造)
根据表7的结果，实施例12、13的细胞存活率较高，实施例13的存活率高于比较例4～6的存活率。
[表8]
浓度和成分 增殖率(％)
比较例7 2.2％羧化多聚赖氨酸* 69.2
实施例14 0.033重量％SL+16.5重量％PG 484.6
(*：CryoScarless DMSO-Free，BioVerde，Inc.制造)
实施例14的增殖率高于比较例7的增殖率。
将人正常成纤维细胞种植到96孔板上并使细胞密度达到2.0×104cells/ml，培养6小时或72小时后，利用Cellcounting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(未冻结的吸光度)。使剩余的细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM且使细胞密度达到4.0×105cells/ml。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表9的各组合物与细胞悬浮液以1∶1的容量比混合，装入冻结处理容器BICELL(Nihon Freezer Co.，Ltd.)，在-80℃的条件下冷却。保存一晩后，以37℃迅速解冻，取100μL种植到96孔板上并培养6小时或72小时，利用Cellcounting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(冻存后的吸光度)。
通过下列式子计算出存活率和增殖率。
存活率(％)＝冻存后的吸光度(培养6小时)/未冻结的吸光度(培养6小时)
增殖率(％)＝冻存后的吸光度(培养72小时)/未冻结的吸光度(培养72小时)
[表9]
＊1STEM－CELLBANKER DMSO Free GMP Grade(厂商：Zenoaq Resource Co.,Ltd.，用途：人iPS/ES细胞)
＊2ReproCryo DMSO Free RM(厂商：ReproCELL Inc.，用途：人iPS/ES细胞)
＊3CryoScarless DMSO Free(厂商：BioVerde,Inc.，用途：未指定)
＊4BAMBANKER(厂商：LYMPHOTEC Inc.，用途：人源细胞)
＊5CP-5E(厂商：KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIALCO.,LTD，用途：人iPS/ES细胞)
＊6CP-1(厂商：KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.,LTD，用途：造血干细胞)
由表9的结果能够看出，本发明的实施例具有较高的细胞存活率和较高的细胞增殖率。
[5未进行冻存预培养时添加SL的情况下添加DMSO所带来的影响(大鼠骨骼肌成肌细胞，含血清培养基)]
测量大鼠骨骼肌成肌细胞(JCRB9081L6)的活细胞数(冻结前的活细胞数)。使剩余的细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM。在CRYOGENICVIAL(SANSYO Co.,LTD)中，将表10的各组合物与细胞悬浮液以3：7的容量比混合，依次在4℃的条件下冷却5分、在－20℃的条件下冷却20分、在－80℃的条件下冷却。以－80℃保存一晩后，以37℃迅速解冻，测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子计算出存活率。
冻结前后的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/冻结前的活细胞数×100
并且，用ELISA对培养5天后的培养上清液中的细胞因子(VEGF：血管内皮细胞生长因子)进行定量检测作为成肌细胞的性质。
[表10]
由表10的结果可知，实施例15～17的细胞的存活率高于比较例8(仅33重量％DMSO)的细胞的存活率。还可知，实施例15～17的VEGF量高于比较例8(仅33重量％DMSO)的VEGF量。这意味着在本实施例中冻结对细胞性质的影响小于比较例中冻结对细胞性质的影响。
[6未进行冻存预培养时添加SL的情况下添加DMSO所带来的影响(人骨骼肌成肌细胞，含血清培养基)]
测量人骨格筋成肌细胞(来自患者)的活细胞数(冻结前的活细胞数)。使剩余的细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表11的各组合物与细胞悬浮液以3∶7的容量比混合，依次在4℃的条件下冷却5分、在一20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子计算出存活率。
冻结前后的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/冻结前的活细胞数×100
[表11]
浓度和成分 冻结前后的存活率(％)
比较例9 33重量％DMSO 81.5
实施例18 33重量％SL+33重量％DMSO 90.7
实施例19 3.3重量％SL+33重量％DMSO 93.4
实施例20 0.33重量％SL+33重量％DMSO 95.5
实施例21 0.033重量％SL+33重量％DMSO 93.6
DMSO：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造
由表11的结果可知，实施例18～21的细胞的存活率高于比较例9(仅33重量％DMSO)的细胞的存活率。
并且，利用Caco-2细胞、含血清培养基研究了添加SL的情况下添加DMSO对解冻时的存活率带来的影响。即，测量Caco-2细胞(人结肠腺癌)的活细胞数(冻结前的活细胞数)。使剩余的细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表12的各组合物与细胞悬浮液以1∶1的容量比混合，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子计算出存活率。
解冻时的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/解冻后的总细胞数×100
[表12]
浓度和成分 解冻时的存活率(％)
比较例25 20重量％DMSO 86.0
实施例38 0.02重量％SL+20重量％DMSO 90.0
由表12的结果可知，本发明的实施例的解冻时的存活率高于比较例(仅20重量％DMSO)的解冻时的存活率。
[7未进行冻存预培养时添加SL的情况下添加PG所带来的影响(人正常成纤维细胞，无血清培养基)]
通过台盼蓝染色测量人正常成纤维细胞(KURABO)的活细胞数(冻结前的活细胞数)。使细胞悬浮于无血清的DMEM。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表13的各试样与细胞悬浮液以3：7的容量比混合，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，通过台盼蓝染色测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子分别计算出冻结前后的存活率和增殖后的存活率。
冻结前后的存活率(％)＝解冻后的活细胞数/冻结前的活细胞数×100
增殖后的存活率(％)＝培养后的活细胞数/培养后的总细胞数×100
[表13]
根据表13的结果，实施例22、23的冻结前后的存活率高于比较例10的冻结前后的存活率。并且，实施例23的增殖后的存活率高于比较例10、11的增殖后的存活率。
[8未进行冻存预培养时添加SL的情况下添加PG所带来的影响(间充质干细胞，无血清培养基)]
通过台盼蓝染色测量间充质干细胞(Lonza)的活细胞数(冻结前的活细胞数)。使细胞悬浮于MSCGM-CD培养基。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表14的各试样与细胞悬浮液以3∶7的容量比混合，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却。以-80℃保存一晚后，以37℃迅速解冻，通过台盼蓝染色测量活细胞数(解冻后的活细胞数)。
通过下列式子计算出冻结前后的残存率。
冻结前后的残存率(％)＝解冻后的总细胞数/冻结前的总细胞数×100
[表14]
浓度和成分 冻结前后的残存率(％)
实施例24 0.033重量％SL+3.3重量％PG 88.1
实施例25 0.033重量％SL+16.5重量％PG 90.3
实施例26 0.033重量％SL+33重量％PG 92.6
比较例12 33重量％PG 83.9
比较例13 33重量％DMSO 89.2
根据表14的结果，实施例24～26的冻结前后的残存率高于比较例12的冻结前后的残存率。并且，实施例25、26的冻结前后的残存率高于比较例13的冻结前后的残存率。
此外，研究了未进行冻存预培养时添加SL的情况下添加PG以外的多元醇所带来的影响(间充质干细胞，含血清培养基)。即，将间充质干细胞(Lonza)种植到96孔板上并使细胞密度达到2.0×104cells/ml，培养6小时或72小时后，利用Cellcounting Kit－8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(未冻结的吸光度)。使剩余的细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM且使细胞密度达到4.0×105cells/ml。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.,LTD)中，将表15的各组合物与细胞悬浮液以1∶1的容量比混合，装入冻结处理容器BICELL(NihonFreezer Co.,Ltd.)，在―80℃的条件下冷却。保存一晩后，以37℃迅速解冻，取100μL种植到96孔板上并培养6小时或72小时，利用Cellcounting Kit－8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(冻存后的吸光度)。并且，对冻结前后的细胞基因(mRNA)表达进行评价。
通过下列式子计算出存活率和增殖率。
存活率(％)＝冻存后的吸光度(培养6小时)/未冻结的吸光度(培养6小时)
增殖率(％)＝冻存后的吸光度(培养72小时)/未冻结的吸光度(培养72小时)
[表15]
浓度和成分 存活率(％) 增殖率(％)
实施例39 0.01重量％SL+20重量％Gly 60.6 71.6
实施例40 0.02重量％SL+30重量％Gly 37.7 67.6
实施例41 0.02重量％SL+30重量％EG 30.6 62.5
实施例42 0.1重量％SL+30重量％Gly 54.3 83.7
实施例43 0.1重量％SL+20重量％Gly 71.9 74.3
实施例44 0.2重量％SL+20重量％Gly 51.7 73.9
比较例26 20重量％DMSO 44.7 30.7
比较例27 30重量％Gly 55.1 51.9
比较例28 20重量％Gly 54.9 34.7
根据表15的结果，本发明的实施例的冻结前后的存活率较高。而且冻结前后的增殖率也较高，但添加0.2重量％SL的情况下冻结前后的存活率略微下降。
此外，研究了本发明的实施例的0.02重量％SL+30重量％Gly、0.02重量％SL+30重量％EG以及0.1重量％SL+30重量％Gly的情况下和比较例的20重量％DMSO的情况下的细胞的基因表达。结果示于图2。CD34和CD73是间充质干细胞的标记，与未冻结时相比，本发明的实施例中CD34和CD73几乎没有变动，可认为间充质干细胞的性质得到维持。c-myc是起促进细胞分裂的加速作用的癌基因，与未冻结时相比，比较例26(20重量％DMSO)中确认到c-myc的变动，而本发明的实施例中c-myc几乎没有变动，可认为对间充质干细胞的影响较小。
[9组合物的细胞毒性(间充质干细胞)]
将间充质干细胞(Lonza)种植到96孔板上并使细胞密度达到2.0×104cells/ml，培养72小时。培养后，除去培养基，用不含胎牛血清的DMEM稀释而使浓度达到表16的各组合物的浓度并进行添加。培养48小时后，利用Cellcounting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度。
通过下列式子计算出存活率。
存活率(％)＝组合物暴露后的吸光度/未处理的吸光度
[表16]
浓度和成分 存活率(％)
比较例29 15重量％Gly 62.5
比较例30 10重量％Gly 76.7
比较例31 7.5重量％Gly 87.8
比较例32 5重量％Gly 88.0
实施例45 0.025重量％SL+10重量％Gly 84.0
实施例46 0.025重量％SL+7.5重量％Gly 94.3
实施例47 0.025重量％SL+5重量％Gly 95.5
实施例48 0.025重量％SL 104.3
实施例49 0.05重量％SL+15重量％Gly 76.0
实施例50 0.05重量％SL+10重量％Gly 88.4
实施例51 0.05重量％SL+7.5重量％Gly 94.3
实施例52 0.05重量％SL+5重量％Gly 91.3
实施例53 0.05重量％SL 100.8
实施例54 0.075重量％SL+15重量％Gly 80.4
实施例55 0.075重量％SL+10重量％Gly 89.8
实施例56 0.075重量％SL+7.5重量％Gly 97.3
实施例57 0.075重量％SL+5重量％Gly 97.9
实施例58 0.075重量％SL 105.1
实施例59 0.1重量％SL+15重量％Gly 68.9
实施例60 0.1重量％SL+10重量％Gly 82.1
实施例61 0.1重量％SL+7.5重量％Gly 85.0
实施例62 0.1重量％SL+5重量％Gly 90.6
实施例63 0.1重量％SL 96.7
比较例33 10重量％DMSO 75.2
表16的结果示出，就间充质干细胞而言，与添加DMSO的情况相比，添加SL+甘油的情况下毒性较低。
[10解冻后，未除去冻存组成而是直接培养的结果(间充质干细胞)]
将间充质干细胞(Lonza)种植到96孔板上并使细胞密度达到2.0×104cells/ml，培养6小时或72小时后，利用Cellcounting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(未冻结的吸光度)。使剩余的细胞悬浮于含有胎牛血清的DMEM且使细胞密度达到4.0×105cells/ml。在CRYOGENIC VIAL(SANSYO Co.，LTD)中，将表17的各组合物与细胞悬浮液以1∶1的容量比混合，装入冻结处理容器BICELL(Nihon Freezer Co.，Ltd.)，在-80℃的条件下冷却。保存一晚后，以37℃迅速解冻，在不除去各组合物的情况下取100μL种植到96孔板上并培养6小时，利用Cellcounting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES)测量吸光度(冻存后的吸光度)。
通过下列式子计算出存活率和增殖率。
存活率(％)＝冻存后的吸光度(培养6小时)/未冻结的吸光度(培养6小时)
[表17]
浓度和成分 存活率(％) 形态观察
实施例64 0.2重量％SL+30重量％Gly 33.9 △
实施例65 0.2重量％SL+20重量％Gly 41.7 ○
实施例66 0.2重量％SL+15重量％Gly 28.0 ○
实施例67 0.1重量％SL+30重量％Gly 28.2 △
实施例68 0.1重量％SL+20重量％Gly 48.6 ○
实施例69 0.1重量％SL+15重量％Gly 48.7 ○
实施例70 0.05重量％SL+30重量％Gly 31.9 △
实施例71 0.05重量％SL+20重量％Gly 35.0 ○
实施例72 0.05重量％SL+15重量％Gly 52.7 ○
比较例34 30重量％Gly 20.7 △
比较例36 20重量％DMSO 10.8 ×
○：与未冻结时相比，8成以上的细胞是粘着的
△：与未冻结时相比，3～8成细胞是粘着的
×：与未冻结时相比，3成以下的细胞是粘着的
用显微镜观察各实施例中的细胞的形态和比较例中的细胞的形态。图3是细胞形态的显微镜图片，其中，(A)为0.2重量％SL+30重量％Gly，(B)为0.2重量％SL+20重量％Gly，(C)为0.2重量％SL+15重量％Gly，(D)为0.1重量％SL+30重量％Gly，(E)为0.1重量％SL+20重量％Gly，(F)为0.1重量％SL+15重量％Gly，(G)为0.05重量％SL+30重量％Gly，(H)为0.05重量％SL+20重量％Gly，(I)为0.05重量％SL+15重量％Gly，(J)为30重量％Gly，(K)为20重量％DMSO。表17的结果示出，就间充质干细胞而言，与添加DMSO的情况相比，添加SL+甘油的情况下毒性较低。图3的结果还示出，与添加DMSO的情况相比，添加SL+甘油的情况下细胞的形态也较佳。
[11冷冻保存蔬菜或水果时添加SL的效果]
按表18、表19、表20的组成分别用水调配出溶液100g，将各食品(黄瓜、菠菜、苹果)分别浸渍于所述溶液。浸渍后，用纸巾擦去多余水分，以－20℃冷冻。保存一晩后，以37℃解冻，并按照下述判断标准对外观和口感进行评分。
<判断标准>
3：与冷冻前相比，未确认到差别
2：与冷冻前相比，确认到差别
1：与冷冻前相比，确认到很大差别
[表18]
组成 外观 口味 口感
实施例73 20重量％SL 3.0 2.4 3.0
实施例74 10重量％SL 3.0 3.0 3.0
实施例75 5重量％SL 3.0 3.0 3.0
实施例76 1重量％SL 3.0 2.5 2.4
实施例77 0.1重量％SL 3.0 2.1 1.8
比较例37 水 3.0 1.8 1.2
[表19]
组成 外观 口味 口感
实施例78 10重量％SL 3.0 3.0 3.0
实施例79 5重量％SL 3.0 3.0 3.0
实施例80 1重量％SL 3.0 3.0 2.8
实施例81 0.1重量％SL 3.0 2.8 2.1
实施例82 0.01重量％SL 3.0 2.3 1.9
比较例38 水 3.0 1.6 1.2
[表20]
组成 外观 口味 口感
实施例83 20重量％SL 2.8 2.5 3.0
实施例84 10重量％SL 3.0 3.0 3.0
实施例85 1重量％SL 3.0 3.0 2.7
实施例86 0.1重量％SL 3.0 2.6 2.0
比较例39 水 3.0 1.8 1.4
由表18、表19以及表20的结果能够看出，通过在冷冻保存蔬菜或水果前将其浸渍于添加有SL的溶液中，从而在冷冻保存后解冻的情况下，口味和口感良好。
[12冷冻保存鱼贝类或食用肉类时添加SL的效果]
按表21、22的组成分别用水调配出溶液100g，将各食品(金枪鱼、肝脏)分别浸渍于所述溶液30分钟。浸渍后，用纸巾擦去多余水分并测量重量(冷冻前的重量)后，以-20℃冷冻。保存一晚后，以37℃解冻，对外观进行观察并测量流失液量。按照下述判断标准对外观进行评分。
<判断标准>
3：与冷冻前相比，未确认到差别
2：与冷冻前相比，确认到差别
1：与冷冻前相比，确认到很大差别
测量流失液量(除去食材后的重量)，并通过下列式子计算出汁液流失率。流失液量是指：食品解冻时，细胞内的冰融化成水而从受到损伤的细胞中流失的水分。
汁液流失率(％)＝流失液量/冻结前的重量×100
[表21]
组成 外观 汁液流失率(％)
实施例87 20重量％SL 2.6 16.7
实施例88 10重量％SL 3.0 16.7
实施例89 5重量％SL 3.0 20.1
比较例40 水 1.8 23.4
[表22]
组成 外观 汁液流失率(％)
实施例90 20重量％SL 3.0 1.5
实施例91 10重量％SL 3.0 1.8
实施例92 5重量％SL 3.0 2.0
比较例41 水 2.1 2.2
由表21和表22的结果能够看出，通过在冷冻保存鱼贝类或食用肉类前将其浸渍于添加有SL的溶液中，能抑制流失液流失量。

Claims (9)

1.一种组合物，其特征在于：含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂，且用于提高冻存后的细胞存活率。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：含有5重量％到10重量％的二甲基亚砜(DMSO)。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：含有1重量％到50重量％的多元醇。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：作为多元醇，包括甘油、乙二醇、丙二醇中的至少一者。
5.一种组合物，其特征在于：含有槐糖脂和多元醇，不含二甲基亚砜(DMSO)，且用于提高冻存后的细胞存活率。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述多元醇为甘油，细胞为干细胞。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述干细胞为间充质干细胞。
8.一种冻存细胞的方法，其特征在于：从即将冻存细胞到冻存细胞6小时前的期间，向细胞培养基中添加权利要求1所述的组合物并使该组合物达到1容量％，来冻存细胞。
9.一种冻存细胞的方法，其特征在于：在冻存细胞时，向细胞培养基中添加权利要求2到7中任一项权利要求所述的组合物并使该组合物达到10容量％到99容量％，来冻存细胞。
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