CN105683329A - 低毒性的含有槐糖脂的组合物及其用途 - Google Patents

低毒性的含有槐糖脂的组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了低毒性的含有槐糖脂的组合物，其特征在于至少含有以下：来自于槐糖脂生产酵母培养物的着色组分、酸型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸。所述低毒性的含有槐糖脂的组合物的特征还在于，使100质量％代表酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸的总质量，则其各自按干重计的比例如下：(1)94质量％至99.99质量％的酸型槐糖脂，(2)0质量％至2质量％的内酯型槐糖脂，以及(3)总量为0.01质量％至4质量％的脂肪酸和羟基脂肪酸。

Description

低毒性的含有槐糖脂的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及低毒性的含有槐糖脂的组合物及其用途。
背景技术
近年来，随着对清洁之关注的提高，表面活性剂常常被用于洗发和/或清洁皮肤。另一方面，遭受因常常使用表面活性剂引起的手粗糙和皮炎的消费者数目也在提高。事实上，厚生劳动省(厚生労働省)的患者数调查(根据疾病类别分类)示出，特应性皮炎患者的数目从1987年的224,000提高至2009年的399,000，并且在2011年存在369,000名患者。这表明日常遭受表面活性剂伤害(例如，皮肤干燥感、皮肤粗糙、皮肤开裂、湿疹、头发干燥感等)的消费者数目可能潜在地很大。
在这样的情况下，越来越多地使用氨基酸表面活性剂(例如N-酰基-L-谷氨酸三乙醇胺)和聚甘油脂肪酸酯表面活性剂(例如聚月桂酸甘油酯)作为相对更安全的表面活性剂。由于其引起较少的安全性问题，所以肥皂(脂肪酸盐)已被重新考虑。然而，已知碳链长度为6至10个碳原子的中链脂肪酸(如肥皂)是高度刺激性的。在上述表面活性剂中，已知氨基酸表面活性剂是刺激性相对较小的(低刺激)；然而，即便这些表面活性剂也不是完全满意的。
生物表面活性剂，是来自于活生物体的表面活性剂，具有高生物降解性和高安全性，并因此预期作为新一代表面活性剂在工业上使用。其中，槐糖脂(其为糖脂表面活性剂的一种)是由酵母发酵获得的发酵产物并且已知是高度安全的。例如，专利文献(PTL)1公开了槐糖脂具有低刺激度。然而，其中所公开的槐糖脂的低刺激度与氨基酸表面活性剂的刺激度相当，并且期望进一步降低刺激(毒性降低)。此外，已知内酯型槐糖脂(槐糖脂的一种形式)是相对有毒的(非专利文献(NPL)1)。
引用列表
专利文献
专利文献1：JP2009-275145A
非专利文献
非专利文献1：ShahV，DoncelGF，SeyoumT，EatonKM，ZalenskayaI，HagverR，AzimA，GrossR(2005)，Sophorolipids，MicrobialGlycolipidswithAnti-HumanImmunodeficiencyVirusandSperm-ImmobilizingActivities.Antimicrob.AgentsChemother.49(10)，4093-4100
非专利文献2：KarenM.J.Saerens，LienSaey，WimSoetaert(2011)，One-StepProductionofUnacetylatedSophorolipidsbyanAcetyltransferaseNegativeCandidabombicola.Biotechnol.Bioeng.108(12).2923-2931
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供低毒性的含有槐糖脂的组合物。本发明的另一个目的是提供所述低毒性含有槐糖脂的组合物的用途。本文中使用的“低毒性的含有槐糖脂的组合物”是指包含低毒性槐糖脂的低毒性组合物。
问题的解决方案
本发明人进行了广泛的研究来解决上述问题。结果，本发明人发现，在通过酵母发酵生产的含有槐糖脂的组合物中包含的组分当中，不仅内酯型槐糖脂，而且脂肪酸、羟基脂肪酸、以及酸型槐糖脂所包含之乙酰基中的每一种，都对含有槐糖脂的组合物的细胞毒性有相当大的影响。本发明人确定，除去这些物质可以提供毒性较小的含有槐糖脂的组合物，特别是对眼睛和黏膜具有极低刺激性的含有槐糖脂的组合物。
本发明是基于以上发现完成的，并且包括以下实施方案。下文中，“槐糖脂”可以缩写为“SL”。具体地，本发明的“低毒性的含有槐糖脂的组合物”也可称为“低毒性的含有SL的组合物”。
(I)低毒性的含有SL的组合物
(I-1)低毒性的含有SL的组合物，至少含有来自于SL生产酵母培养物的着色组分、酸型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸，基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，按干重计，以下组分为以下比例：
(1)酸型SL：94质量％至99.99质量％，
(2)内酯型SL：0质量％至2质量％，
(3)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至4质量％。
(I-2)根据(I-1)所述的低毒性的含有SL的组合物，其中基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，内酯型SL的比例以及脂肪酸和羟基脂肪酸的总比例满足以下(i)和(ii)中的至少一个：
(i)内酯型SL：优选地大于0质量％但不大于2质量％，更优选地0.1质量％至2质量％，甚至更优选地0.1质量％至1.5质量％，并且特别优选地0.8质量％至1.5质量％；以及
(ii)脂肪酸和羟基脂肪酸(总计)：优选地0.01质量％至2.4质量％，更优选地0.01质量％至1.2质量％，并且甚至更优选地0.01质量％至0.24质量％。
(I-3)根据(I-1)所述的低毒性的含有SL的组合物，其中基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，酸型SL的比例、内酯型SL的比例以及脂肪酸和羟基脂肪酸的总比例如下：
酸型SL：优选地96.1质量％或更大，更优选地97.9质量％或更大，并且甚至更优选地99.31质量％或更大，
内酯型SL：优选地大于0质量％但不大于2质量％，更优选地0.1质量至2质量，甚至更优选地0.1质量％至1.5质量％，并且特别优选地0.8质量％至1.5质量％，
脂肪酸和羟基脂肪酸(总计)：0.01质量％至2.4质量％，更优选地0.01质量％至1.2质量％，并且甚至更优选地0.01质量％至0.24质量％。
(I-4)根据(I-1)至(I-3)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中基于所述组合物中酸型SL和内酯型SL的总量作为100质量％，酸型SL的比例为98质量％至100质量％，优选地98.5质量％至100质量％，更优选地99质量％至100质量％，并且甚至更优选地99.5质量％至100质量％，并且酸型SL的比例为0质量％至2质量％，优选地0质量％至1.5质量％，并且更优选0质量％至1质量％
(I-5)根据(I-1)至(I-4)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中通过溶解所述低毒性的含有槐糖脂的组合物使得溶液具有10质量％的乙醇可溶性成分而制备的水溶液在440nm波长下的吸光度(色度：OD440)为0.001至1，优选地0.005至0.8，更优选地0.01至0.6，特别优选地0.01至0.5，并且进一步特别优选地0.4或更小。
(I-6)根据(I-1)至(I-5)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中对应于1g其乙醇可溶性成分之量的所述组合物的酯值为0.01至2mgKOH/g，优选地0.01至1.5mgKOH/g，更优选地0.1至1.5mgKOH/g，并且特别优选地0.8至1.5mgKOH/g。
(I-7)根据(I-1)至(I-6)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中对应于1g其乙醇可溶性成分之量的所述组合物的羟值为460至630mgKOH/g，优选地545至630mgKOH/g，更优选地560至630mgKOH/g，特别优选地575至630mgKOH/g，并且进一步特别优选地575至585mgKOH/g。
(I-8)根据(I-1)至(I-7)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中所述组合物的HeLa细胞致死浓度(IC50)为2,000ppm或更高，并且优选地3,000ppm至60,000ppm。
(I-9)根据(I-1)至(I-8)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中所述组合物的HeLa细胞致死浓度(IC50)/临界胶束浓度(CMC)比例(IC50/CMC)为6.7至200，优选地10至200，更优选地17至200，并且特别优选地33至200。
(I-10)根据(I-1)至(I-9)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中所述组合物具有以下物理特性(a)至(c)中的至少一个：
(a)蒸发残余物：1％至100％；
(b)干燥失重：0％至99％；和
(c)乙醇可溶性成分：1％至100％。
(I-11)根据(I-1)至(I-10)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中所述组合物的红外吸收光谱包括至少在约1024cm-1、约1706cm-1至1730cm-1、约2854cm-1、约2924cm-1和约3000cm-1至3500cm-1波长下的红外吸收带。
(I-12)根据(I-1)至(I-11)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物，其中所述组合物为固体形式。
(I-13)根据(I-12)所述的低毒性的含有SL的组合物，其中所述固体形式为粉末或颗粒。
(II)低毒性的含有SL的组合物的用途
(II-1)阴离子表面活性剂，其包含根据(I-1)至(I-13)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物作为活性组分。
(II-2)香料或化妆品(香粧品)，食品或饮料(飲食品)，药品，准药品(医薬部外品)，或者用于香料或化妆品、食品或饮料、药品或准药品的添加剂，包含根据(I-1)至(I-13)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物。
(II-3)根据(II-2)所述的香料或化妆品，食品或饮料，药品，准药品，或者用于香料或化妆品、食品或饮料、药品或准药品的添加剂，其中所述香料或化妆品、食品或饮料、药品、准药品或者添加剂施用于黏膜、创伤或炎症部位。
此外，本发明包括用于生产低毒性的含有槐糖脂的组合物的方法以及用于降低含有槐糖脂的组合物的毒性的方法。
(III)用于生产低毒性的含有SL的组合物的方法
(III-1)用于生产根据(I-1)至(I-12)中任一项所述的低毒性的含有SL的组合物的方法，所述方法包括对通过培养SL生产酵母获得的含SL培养物或所述培养物的经处理产物进行(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤。
(III-2)根据(III-1)所述的生产方法，其中对通过培养SL生产微生物获得的含SL培养物或所述培养物的经处理产物进一步进行(2)除去与SL结合之乙酰基的步骤和(3)除去内酯型SL的步骤中的至少一个。
(III-3)根据(III-1)或(III-2)所述的生产方法，其中(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤包括选自溶剂萃取、吸附和色谱中的至少一种处理。
(III-4)根据(III-3)所述的生产方法，其中所述溶剂萃取是使用乙醚作为溶剂的萃取方法；所述吸附是使用活性炭、硅胶、沸石、离子交换树脂或氧化铝作为吸附剂的方法；所述色谱是使用ODS树脂作为固定相并使用乙醇水溶液作为流动相的反相柱色谱。
(III-5)根据(III-1)至(III-4)中任一项所述的生产方法，其中(2)除去与SL结合之乙酰基的步骤包括选自水解和酶处理中的至少一种处理。
(III-6)根据(III-5)所述的生产方法，其中所述酶处理使用乙酰酯酶。
(III-7)根据(III-1)至(III-6)中任一项所述的生产方法，其中(3)除去内酯型SL的步骤是选自水解和色谱中的至少一种处理。
(III-8)根据(III-7)所述的生产方法，其中所述色谱是使用ODS树脂作为固定相并使用乙醇水溶液作为流动相的反相柱色谱。
(IV)用于降低含有SL的组合物的毒性的方法
(IV-1)用于降低含有SL的组合物的毒性的方法，所述方法包括对通过培养SL生产酵母获得的含SL培养物或其经处理产物进行(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤，以生产低毒性的含有SL的组合物，其中基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，按干重计，以下组分为以下比例：
(a)酸型SL：94质量％至99.99质量％，
(b)内酯型SL：0质量％至2质量％，以及
(c)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至4质量％。
(IV-2)根据(IV-1)所述的毒性降低方法，其中所述方法生产低毒性的含有SL的组合物，其中基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，内酯型SL的比例以及脂肪酸和羟基脂肪酸的总比例满足以下(i)和(ii)中的至少一个：
(i)内酯型SL：优选地大于0质量％但不大于2质量％，更优选地0.1质量％至2质量％，甚至更优选地0.1质量％至1.5质量％，并且特别优选地0.8质量％至1.5质量％；以及
(ii)脂肪酸和羟基脂肪酸(总计)：优选地0.01质量％至2.4质量％，更优选地0.01质量％至1.2质量％，并且甚至更优选地0.01质量％至0.24质量％。
(IV-3)根据(IV-1)所述的毒性降低方法，其中所述方法生产低毒性的含有SL的组合物，其中基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，酸型SL的比例、内酯型SL的比例以及脂肪酸和羟基脂肪酸的(总)比例如下：
(a)酸型SL：优选地96.1质量％或更大，更优选地97.9质量％或更大，并且甚至更优选地99.31质量％或更大；
(b)内酯型SL：优选地大于0质量％但不大于2质量％，更优选地0.1质量％至2质量％，甚至更优选地0.1质量％至1.5质量％，并且特别优选地0.8质量％至1.5质量％；以及
(c)脂肪酸和羟基脂肪酸(总计)：0.01质量％至2.4质量％，更优选地0.01质量％至1.2质量％，并且甚至更优选地0.01质量％至0.24质量％。
(IV-4)根据(IV-1)至(IV-3)中任一项所述的毒性降低方法，所述方法生产低毒性的含有SL的组合物，其中基于所述组合物中酸型SL和内酯型SL的总量作为100质量％，酸型SL的比例为98质量％至100质量％，优选地98.5质量％至100质量％，更优选地99质量％至100质量％，并且特别优选地99.5质量至100质量％，并且内酯型SL的比例为0质量％至2质量％，优选地0质量％至1.5质量％，更优选地0质量％至1质量％。
(IV-5)根据(IV-1)至(IV-4)中任一项所述的毒性降低方法，其中所述方法生产低毒性的含有SL的组合物，其中对应于1g其乙醇可溶性成分之量的所述组合物的酯值为0.01至2mgKOH/g，优选地0.01至1.5mgKOH/g，更优选地0.1至1.5mgKOH/g，并且特别优选地0.8至1.5mgKOH/g。
(IV-6)根据(IV-1)至(IV-5)中任一项所述的毒性降低方法，其中所述方法生产低毒性的含有SL的组合物，其中对应于1g其乙醇可溶性成分之量的所述组合物的羟值为460至630mgKOH/g，优选地545至630mgKOH/g，更优选地560至630mgKOH/g，特别优选地575至630mgKOH/g，并且更特别优选地575至585mgKOH/g。
(IV-7)根据(IV-1)至(IV-6)中任一项所述的毒性降低方法，其中对通过培养SL生产微生物获得的含SL培养物或所述培养物的经处理产物进一步进行(2)除去与SL结合之乙酰基的步骤和(3)除去内酯型SL的步骤中的至少一个。
(IV-8)根据(IV-1)至(IV-7)中任一项所述的毒性降低方法，其中(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤包括选自溶剂萃取、吸附和色谱中的至少一种处理。
(IV-9)根据(IV-8)所述的毒性降低方法，其中所述溶剂萃取是使用乙醚作为溶剂的方法；所述吸附是使用活性炭、硅胶、沸石、离子交换树脂或氧化铝作为吸附剂的方法；并且所述色谱是使用ODS树脂作为固定相并使用乙醇水溶液作为流动相的反相柱色谱。
(IV-10)根据(IV-7)至(IV-9)中任一项所述的毒性降低方法，其中(2)除去与SL结合之乙酰基的步骤包括选自水解和酶处理中的至少一种处理。
(IV-11)根据(IV-10)所述的毒性降低方法，其中所述酶处理使用乙酰酯酶。
(IV-12)根据(IV-7)至(IV-11)中任一项所述的毒性降低方法，其中(3)除去内酯型SL的步骤是选自水解和色谱中的至少一种处理。
(IV-13)根据(IV-12)所述的毒性降低方法，其中所述色谱是使用ODS树脂作为固定相并使用乙醇水溶液作为流动相的反相柱色谱。
本发明的有利效果
根据本发明，可以提供具有低细胞毒性的含有SL的组合物。本发明的低毒性的含有SL的组合物具有表面活性剂的作用，并且还具有极低的细胞毒性以及对眼睛和黏膜的低刺激。因此，本发明的组合物优选地不仅可以添加到施用于皮肤、创伤或炎症部位的化妆品、药品、准药品等中，而且可以添加到施用于眼黏膜的眼部护理产品(如滴眼剂、洗眼剂)以及隐形眼镜装着液、施用于口腔黏膜的口腔用药、施用于鼻黏膜的喷鼻剂等中。
附图说明
图1示出了绘制细胞致死浓度(IC50)相对于CMC的图。细胞致死浓度(IC50)由细胞毒性测试来计算，所述细胞毒性测试使用参考生产例2和实施例1至10中获得的含有SL的组合物(粗纯化的含有SL的组合物-2和实施例产物1至10)、吐温20和市售阴离子表面活性剂A至C(A：“AmisoftLT-12”(30％)：由AjinomotoCo.，Inc.生产；B：“SurfactinNa”(100％)：由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.生产；C：“LipolanLJ-441”(37％)：由LionCorporation生产)以及SLS来进行。CMC在测试例2中计算。
具体实施方式
(I)一般的槐糖脂(已知的SL)
槐糖脂(SL)通常是由羟基脂肪酸和槐糖或者一个或更多个羟基被乙酰化的槐糖组成的糖脂。槐糖是由通过β1→2键结合的两个葡萄糖分子组成的糖。羟基脂肪酸是具有羟基的脂肪酸。SL大致上分为酸型SL(通式(1))和内酯型SL(通式(2))。酸型SL是其中羟基脂肪酸的羧基游离的槐糖脂。内酯型SL是其中羟基脂肪酸的羧基与分子中的槐糖结合的槐糖脂。由某种酵母(SL生产酵母)通过发酵获得的SL通常为由以下通式(1)表示的SL和由以下通式(2)表示的SL的混合物，并且作为具有不同脂肪酸链长(R3)且在槐糖的6’位(R2)和6”位(R1)处乙酰化或质子化的30种或更多种类型的结构同系物的集合体获得。
在通式(1)或(2)中，R0为氢原子或甲基。R1和R2各自独立地为氢原子或乙酰基。R3为饱和脂肪族烃链或具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃链，并且可具有一个或更多个取代基。取代基的实例包括卤素原子、羟基、低级(C1-6)烷基、卤代低级(C1-6)烷基、羟基低级(C1-6)烷基、卤代低级(C1-6)烷氧基等。R3通常具有11至20个碳原子，优选地13至17个碳原子，并且更优选地14至16个碳原子。卤素原子或者与烷基或烷氧基结合的卤素原子的实例包括氟、氯、溴和碘。
如上所述，由SL生产酵母通过发酵获得的培养液通常包含作为通式(1)所示酸型SL和通式(2)所示内酯型SL之混合物的SL。培养液中的酸型SL与内酯型SL之比通常为45∶55至10∶90(干重比)。
优选的SL生产酵母的实例包括Candidabombicola。念珠菌属(Candida)属已改名为Starmerella属。该酵母是已知产生大量SL(酸型SL和内酯型SL)的SL生产酵母(参见例如CanadianJournalofChemistry，39，846(1961)(注意：该文献中描述的球拟酵母(Torulopsis)属属于念珠菌属，但是目前归类为Starmerella属，如上所述)；以及AppliedandEnvironmentalMicrobiology，47，173(1984))。Candida(Starmerella)bombicola保存在生物资源库如ATCC中并且可得自于生物资源库如ATCC(CandidabombicolaATCC22214等)。本发明的低毒性的含有SL的组合物也可以通过使用属于已知产生SL(酸型SL和内酯型SL)的念珠菌属(Starmerella属)的其他SL生产酵母来生产。这样的SL生产酵母的实例包括Candidamagnoliae、Candidagropengisseri、Candidaapicola、Candidapetrophilum、Candidabogoriensis、Candidabatistae等。据报道，在这些酵母的培养液中生产相对大量的SL(R.Hommel，Biodegradation，1，107(1991))。
已知CandidafloricolaZM-1502菌株(FERMP-21133)和CandidafloricolaNBRC10700T菌株是选择性地仅生产酸型SL的SL生产酵母(JP2008-247845A)。因此，当应选择性地生产酸型SL时，可以优选地使用这些SL生产酵母。
为了培养这些SL生产酵母，使用这样的培养基，其包含糖(例如葡萄糖)作为碳源(亲水性底物)；以及脂肪酸、脂肪酸酯(例如脂肪酸甘油三酯)，或者包含脂肪酸作为组分的脂肪或油(例如植物油)(疏水性底物)。所述培养基的其他组分没有特别限制，并且可以适当地选自通常用于酵母的培养基组分。
(II)低毒性的含有SL的组合物
根据本发明的低毒性的含有SL的组合物至少在细胞毒性方面不同于上述的已知SL组合物，并且具有以下特征。
所述组合物至少包含来自于SL生产酵母培养物的着色组分、酸型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸。基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，这些组分的比例为按干重计如下：
(1)酸型SL：94质量％至99.99质量％，
(2)内酯型SL：0质量％至2质量％，
(3)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至4质量％。
以下说明这些特征。
(1)酸型SL的比例为按干重计的94质量％至99.99质量％。
这是相对于低毒性的含有SL的组合物中包含的酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸总量(100质量％)的酸型SL的比例(按干重计)。这对应于低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的酸型SL的比例。因此，低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的酸型SL的比例可以认为是94质量％至99.99质量％。酸型SL的比例优选地为96.1质量％或更大，更优选地97.9质量％或更大，并且特别的99.31质量％或更大。
本发明的低毒性的含有SL的组合物包括包含比例为95质量％至99.86质量％的酸型SL的低毒性的含有SL的组合物(实施例1至10)。这些仅是本发明的一些实施方案。本发明不限于这些实施方案。
酸型SL的比例可以由低毒性的含有SL的组合物的酯值和醚萃取物含量来计算。如以下文中将描述的，本文中使用的“酯值”和“醚萃取物含量”对应于相对于酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量(100质量％)的“内酯型SL”的比例以及“脂肪酸和羟基脂肪酸”的比例。因此，100减去“酯值”和“醚萃取物含量”的总和对应于低毒性的含有SL的组合物中包含的酸型SL的比例(质量％)。
(2)内酯型SL的比例为按干重计的0质量％至2质量％。
这是相对于低毒性的含有SL的组合物中包含的酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量(100质量％)的内酯型SL的比例(按干重计)。这对应于低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的内酯型SL的比例。因此，低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的内酯型SL的比例可以认为是0质量％至2质量％。虽然鉴于获得低毒性的含有SL的组合物，内酯型SL的比例优选地尽可能小，但是包含量为大于0质量％但不大于2质量％的内酯型SL提供了良好的表面张力减小能力，而且还实现了作为表面活性剂的优异性能(润湿性、增溶能力、去污力、起泡性)(参见测试例5)。
因此，当主要焦点是低毒性时，低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的内酯型SL的比例(上限和下限)如下：
上限：优选地1.5质量％或更小，更优选地0.9质量％或更小，甚至更优选地0.45质量％或更小，并且特别优选地0.1质量％或更小；以及
下限：优选地0质量％。当使用内酯型SL生产酵母作为SL生产酵母时，内酯型SL的量可以是例如0.01质量％。
另一方面，当待生产具有优异低毒性同时保持作为表面活性剂的优异性能(润湿性、增溶能力、去污力、起泡性，下文中统称为“表面活性剂效力”)的低毒性的含有SL的组合物时，低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的内酯型SL的比例(上限和下限)如下：
上限：优选地2质量％或更小，并且更优选地1.5质量％或更小；
下限：优选地大于0质量％，更优选地0.1质量％或更大，并且甚至更优选地0.8质量％或更大。
本发明的低毒性的含有SL的组合物包括包含量为0.04质量％至2.0质量％的内酯型SL的低毒性的含有SL的组合物(实施例1至10)。这些仅是本发明的一些实施方案。本发明不限于这些实施方案。
内酯型SL的比例可以由低毒性的含有SL的组合物的酯值(mgKOH/g)获得。
具体地，本文中使用的“酯值(mgKOH/g)”是指使对应于1g乙醇可溶性成分的量的样品(低毒性的含有SL的组合物)中包含的酯完全皂化所需的氢氧化钾的量(mg)。“酯值”允许理解为样品(即，低毒性的含有SL的组合物)中内酯环中酯键的比例。酯值(mgKOH/g)与内酯型SL相对于含有SL的组合物中所含SL的总量(100质量％)的比例相关。内酯型SL相对于乙醇可溶性成分(100质量％)的比例可以由酯值计算。
乙醇可溶性成分基本上相当于含有SL的组合物中包含的酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量。因此，基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，酸型SL的比例可以通过获得酯值来计算。
“酯值(mgKOH/g)”可以按照由日本油化学会(日本)规定的脂肪、油和相关物质的JOCS标准分析方法(2.3.3-1996)来测量。测试例1中说明了细节。本发明的低毒性的含有SL的组合物的酯值(mgKOH/g)通常为0至2mgKOH/g。从低毒性的观点来看，酯值优选地为0至1.5mgKOH/g，更优选地0.01至0.9mgKOH/g，并且特别优选地0至0.45mgKOH/g。为了实现低毒性同时保持作为表面活性剂的良好性能(润湿性、增溶能力、去污力和起泡性)，酯值优选地大于0mgKOH/g(例如，0.01mgKOH/g)但不大于2mgKOH/g，更优选地为0.1至2mgKOH/g，甚至更优选地0.1至1.5mgKOH/g，并且特别优选地0.8至1.5mgKOH/g。
当将低毒性的含有SL的组合物中包含的酸型SL和内酯型SL限定为100质量％时，酸型SL与内酯型SL的比例(酸型SL与内酯型SL的重量比)为98∶2至100∶0，优选地98.5∶1.5至100∶0，并且更优选地99∶1至100∶0。当将产生内酯型SL的酵母用作SL生产酵母时，酸型SL不可能占100质量％。在这种情况下，酸型SL与内酯型SL的比例(重量比)可为99.99∶0.01。
(3)脂肪酸和羟基脂肪酸的总比例为按干重计的0.01质量％至4质量％。
这是相对于低毒性的含有SL的组合物中的酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量(100质量％)的脂肪酸和羟基脂肪酸的比例(按干重计)。这对应于低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的脂肪酸和羟基脂肪酸的比例。因此，低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(100质量％)中包含的脂肪酸和羟基脂肪酸的比例可以认为是0.01质量％至4质量％。
本文提及的脂肪酸是培养SL生产酵母中使用的培养基中所包含的脂肪酸。脂肪酸通过实施例中说明的用于测量醚萃取物含量的方法作为醚萃取物来计算。具体地，脂肪酸是具有6至24个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸。这样的脂肪酸的具体实例包括：己酸(C6)、庚酸(C7)、辛酸(C8)、壬酸(C9)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、十五烷酸(C15)、棕榈酸(C16)、十七烷酸(C17)、硬脂酸(C18)、花生酸(C20)、二十二烷酸(C22)、二十四烷酸(C24)等饱和脂肪酸；以及棕榈油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)、花生四烯酸(C20∶4)、二十碳五烯酸(C20∶5)、二十二碳六烯酸(C22∶6)等不饱和脂肪酸。
本文中提及的羟基脂肪酸的实例包括上述脂肪酸，其中至少一个氢原子被替换为羟基。
脂肪酸和羟基脂肪酸的(总)比例的上限优选地为2.4质量％或更小，更优选地1.2质量％或更小，并且特别优选地0.24质量％或更小。该比例的下限优选地为例如0.01质量％。虽然就获得具有低毒性的含有SL的组合物而言，脂肪酸和羟基脂肪酸的量优选地尽可能低，但是就保持酸型SL的表面活性剂效力而言，在一定程度上包含0.01质量％至4质量％的脂肪酸和羟基脂肪酸是有利的。不受特定理论束缚，实现该优点的一个原因可以是脂肪酸和羟基脂肪酸在测试样品中表现出一种螯合作用。具体地，由于脂肪酸和羟基脂肪酸的螯合作用，测试样品中包含的金属离子K、Na、Ca、Mg等被捕获，从而抑制酸型SL与金属离子形成盐并且使得酸型SL可以保持其作为表面活性剂的作用。本发明的低毒性的含有SL的组合物包括总比例为0.1质量％至4质量％的脂肪酸和羟基脂肪酸的低毒性的含有SL的组合物(实施例1至10)。然而，这些仅是本发明的一些实施方案。本发明不限于这些实施方案。
具有16个和18个碳原子的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸在本发明的低毒性的含有SL的组合物中包含的脂肪酸和羟基脂肪酸当中是占优势的。具体地，低毒性的含有SL的组合物中包含的主要脂肪酸是具有16个碳原子的饱和脂肪酸和具有18个碳原子且包含一个或两个双键的不饱和脂肪酸。低毒性的含有SL的组合物中包含的主要羟基脂肪酸是具有16个碳原子的饱和脂肪酸和具有18个碳原子且包含一个或两个双键的不饱和脂肪酸(参见测试例1和表2)。因此，脂肪酸和羟基脂肪酸的(总)比例也可以认为基本上是C16和C18脂肪酸和羟基脂肪酸(的总量)的比例。
脂肪酸和羟基脂肪酸的比例可以由低毒性的含有SL的组合物的醚萃取物含量(％)来确定。
具体地，本文中使用的“醚萃取物含量(％)”是指使用醚从对应于1g其乙醇可溶性成分之量的样品(低毒性的含有SL的组合物)中萃取的物质的比例(质量％)。这允许理解为样品(低毒性的含有SL的组合物)中包含的脂肪酸和羟基脂肪酸的比例。即，由于“醚萃取物含量(％)”与乙醇可溶性成分(100质量％)中脂肪酸和羟基脂肪酸的比例相关，所以乙醇可溶性成分(100质量％)中脂肪酸和羟基脂肪酸的比例可以由“醚萃取物含量(％)”来计算。如上所述，由于乙醇可溶性成分基本上对应于含有SL的组合物中包含的酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量，所以相对于酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量(100质量％)的脂肪酸和羟基脂肪酸的量可以通过获得“醚萃取物含量(％)”来计算。
测试例1中说明了用于测量“醚萃取物含量(％)”的方法的细节。本发明的低毒性的含有SL的组合物的“醚萃取物含量(％)”通常为0.01质量％至4质量％，优选地0.01质量％至2.4质量％，更优选地0.01质量％至1.2质量％，并且特别优选地0.01质量％至0.24质量％。特别地，醚萃取物含量(％)可以是例如0.1质量％至4质量％。
根据本发明一个实施方案的低毒性的含有SL的组合物包括除以上特征(1)至(3)之外还具有以下特征(4)和(5)中至少一个的组合物：
(4)对应于1g其乙醇可溶性成分之量的组合物的羟值为460至630mgKOH/g；以及
(5)通过使低毒性的含有SL的组合物溶解以使溶液的乙醇可溶性成分为10质量％而制备的水溶液的吸光度(色度：OD440)为0.001至1。
以下说明了这些特征。
(4)对应于1g其乙醇可溶性成分之量的组合物的羟值为460至630mgKOH/g。
本文中使用的“羟值(mgKOH/g)”是指使对应于1g其乙醇可溶性成分之量的样品(低毒性的含有SL的组合物)中包含的化合物的OH基团完全乙酰化所需的氢氧化钾的量(mg)。这允许测量样品(低毒性的含有SL的组合物)中包含的SL中游离羟基的比例。高羟值(mgKOH/g)意味着SL中游离羟基的比例高(即，少量羟基被乙酰化＝少量乙酰基)。低羟值(mgKOH/g)意味着SL中游离羟基的比例低(即，大量羟基被乙酰化＝大量乙酰基)。
“羟值(mgKOH/g)”可以按照由日本油化学会(日本)规定的脂肪、油和相关物质的JOCS标准分析方法(2.3.6.2-1996)来测量。测试例1中说明了细节。本发明的低毒性的含有SL的组合物的“羟值(mgKOH/g)”优选地使得对应于1g其乙醇可溶性成分之量的组合物的羟值为460至630mgKOH/g，如上所述。更优选地，羟值为545至630mgKOH/g，甚至更优选地560至630mgKOH/g，并且特别优选地575至630mgKOH/g。本发明的低毒性的含有SL的组合物包括羟值为575至585mgKOH/g的低毒性的含有SL的组合物(实施例1至10)。这些仅是本发明的一些实施方案。本发明不限于这些实施方案。
(5)通过使低毒性的含有SL的组合物溶解以使溶液的乙醇可溶性成分为10质量％ 而制备的水溶液的吸光度(OD 440 )为0.001至1。
根据本发明的低毒性的含有SL的组合物具有除白色之外的颜色。
酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸是无色的或白色的。因此，低毒性的含有SL的组合物的着色意味着所述组合物除酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸之外还包含着色组分。着色组分没有特别限制，只要其来自于SL生产酵母培养物即可。着色组分的实例包括但不限于类黑精(メラノィジン)。
本发明的低毒性的含有SL的组合物的着色程度可以如下评价：将低毒性的含有SL的组合物溶解在碱溶液(0.1NNaOH中的2％Na2CO3)中以制备乙醇可溶性成分的总浓度为10质量％的水溶液，并且测量该水溶液在440nm波长下的吸光度(色度：OD440)。当以上述方式制备本发明的低毒性的含有SL的组合物时，水溶液的色度(OD440)为0.001至1，优选地0.005至0.8，更优选地0.01至0.6，并且特别优选地0.01至0.5。本发明的低毒性的含有SL的组合物包括色度(OD440)为0.1至0.4的低毒性的含有SL的组合物(实施例1至7)。但是，这些仅是本发明的一些实施方案。本发明不限于这些实施例。
根据本发明另一个实施方案的低毒性的含有SL的组合物的特征在于除以上特征之外还具有以下物理特性(a)至(c)中的至少一个：
(a)蒸发残余物：1％至100％；
(b)干燥失重：0％至99％；和
(c)乙醇可溶性成分：1％至100％。
如测试例1所说明的，术语“蒸发残余物(％)”是指通过样品蒸发获得的残余物的量并且以质量百分比(质量％)表示。蒸发残余物允许理解为样品(即，本发明的低毒性的含有SL的组合物)中的共存物质(特别是具有高沸点的共存物质)的含量。“蒸发残余物(％)”可以按照JISK0067-1992的第二法来测量。测试例1中描述了细节。本发明的低毒性的含有SL的组合物的蒸发残余物(％)可以是1％至100％，优选地5％至100％，并且更优选地10％至100％。进一步优选地，蒸发残余物为60％至100％，更优选地70％至100％，特别优选地80％至100％，并且更特别优选地90％至100％。
如将在测试例1说明的，术语“干燥失重(％)”是指通过干燥样品获得的损失量，其以质量百分比(质量％)表示。干燥失重允许理解为样品(即，本发明的低毒性的含有SL的组合物)中水和其他挥发性物质(低沸点化合物)的含量。干燥失重(％)可以按照JISK0067-1992的第一法来测量。测试例1中描述了细节。本发明的低毒性的含有SL的组合物的干燥失重(％)可以是0％至99％，优选地0％至95％，并且更优选地0％至90％。进一步优选地，干燥失重为0％至30％，更优选地0％至20％，特别优选地0％至20％，并且更特别优选地0％至10％。
如将在测试例1说明的，术语“乙醇可溶性成分(％)”是指样品中包含的乙醇可溶物质的量(质量％)。乙醇可溶性成分(％)允许理解为样品中乙醇可溶极性物质(例如表面活性剂)的含量。“乙醇可溶性成分(％)”可以按照JISK3362-2008来测量。测试例1中描述了细节。本发明的低毒性的含有SL的组合物的乙醇可溶性成分(％)可以是1至100％，优选地5％至100％，并且更优选地10％至100％。乙醇可溶性成分(％)甚至更优选地为85％至100％，甚至更更优选地90％至100％，特别优选地95％至100％，并且更特别优选地98％至100％。乙醇可溶性成分(％)是指当目标样品(即，本发明的低毒性的含有SL的组合物)的量被限定为100质量％时所述组合物中包含的酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的比例(质量％)。
更优选地，本发明的低毒性的含有SL的组合物的红外吸收光谱包括至少在约1024cm-1、约1706cm-1至1730cm-1、约2854cm-1、约2924cm-1和约3000cm-1至3500cm-1波数下的红外吸收带(吸收峰)。
本发明的低毒性的含有SL的组合物的形式没有特别限制。本发明的低毒性的含有SL的组合物可以是液体、乳液或固体的形式。固体形式是优选的。固体形式的实例包括片剂、丸剂、粉末、颗粒和胶囊。粉末或颗粒形式是优选的，并且粉末形式是更优选的。
本发明的低毒性的含有SL的组合物的特征在于，由于从SL生产酵母发酵的副产物(在生产过程期间产生)中选择性除去了细胞毒性组分，所以所述组合物包含更少量的细胞毒性组分，同时保持表面活性剂作用。细胞毒性组分的实例包括但不限于：内酯型SL；具有16或18个碳原子的脂肪酸和羟基脂肪酸；含乙酰基的SL等。
本发明的低毒性的含有SL的组合物的毒性可以例如通过细胞致死浓度(IC50)来评价，细胞致死浓度(IC50)通过使用HeLa细胞(人子宫颈上皮样癌细胞)的细胞毒性测试来计算。然而，为了从表面活性剂作用和细胞毒性作用两方面来评价低毒性的含有SL的组合物的作用，优选的是，计算通过用低毒性的含有SL的组合物的“细胞致死浓度(IC50)”除以低毒性的含有SL的组合物的“临界胶束浓度(CMC)”获得的值(IC50/CMC)。
测试例3中详细地描述了使用HeLa细胞的细胞毒性测试和用于计算细胞致死浓度(IC50)的方法。测试例2中详细地描述了用于测量临界胶束浓度(CMC)的方法。
本发明的低毒性的含有SL的组合物的HeLa细胞致死浓度(IC50)可以是例如2,000ppm至60,000ppm，优选地3,000ppm至60,000ppm，更优选地5,000ppm至60,000ppm，并且特别优选地10,000ppm至60,000ppm。
本发明的低毒性的含有SL的组合物的临界胶束浓度(CMC)可以是例如50ppm至500ppm，优选地50ppm至400ppm，更优选地50ppm至300ppm，并且特别优选地100ppm至300ppm。
由细胞致死浓度(IC50)和临界胶束浓度(CMC)计算的本发明的低毒性的含有SL的组合物的“IC50/CMC”为6.7至200，优选地10至200，更优选地17至200，并且特别优选地33至200。本发明的低毒性的含有SL的组合物包括“IC50/CMC”为106.7至200的低毒性的含有SL的组合物(实施例1至10)。然而，这些仅是本发明的一些实施方案。本发明不限于这些实施方案。
如将在测试例3中说明的，本发明的低毒性的含有SL的组合物对眼睛和黏膜具有极低的刺激，如细胞致死浓度(IC50)所示出的；并且对眼睛和黏膜的毒性较小且刺激较小(无刺激)。
(III)低毒性的含有SL的组合物的用途
如以上所说明的，本发明的低毒性的含有SL的组合物具有表面活性剂作用，并且还具有极低的细胞毒性以及对眼睛和黏膜的低刺激性，并且在实际浓度下可以被认为是基本上无毒且无刺激的。因此，本发明的低毒性的含有SL的组合物可以用作毒性较小且刺激较小的阴离子表面活性剂。此外，本发明的低毒性的含有SL的组合物也可以用于需要高安全性和低刺激(无刺激)的产品，例如食品或饮料、药品、准药品和香料或化妆品。还可以将本发明的低毒性的含有SL的组合物用作食品或饮料、药品、准药品或者香料或化妆品的添加剂。
本文中使用的“食品或饮料”除一般的食品产品和饮料之外还包括具有特定功能并且摄入以保持健康等的食品或饮料，例如健康补充剂、健康功能食品、特定保健用食品和补充剂。本文中使用的“香料或化妆品”是指包括“化妆品”和“芳香产品”的概念，例如清香剂、古龙水(オ一デコロン)和香水。化妆品是出于清洁、美化人身体和提高人身体的吸引力以改变人的外貌的目的，或者出于保持皮肤或头发的健康的目的，通过施用和涂擦、喷涂或其他类似方法(例如，涂抹)施用于身体的那些。化妆品的实例包括美容化妆品(例如，粉底、唇膏等)、基础化妆品(例如，化妆水、乳液等)、头发护理产品(例如，护发素、头发洗剂、发乳等)和梳洗用产品(例如，牙膏、洗发水、染发液、肥皂、洁面乳、沐浴露等)。
本发明的低毒性的含有SL的组合物特别地适于用作要求低刺激(或无刺激)的外用组合物。这样的外用组合物的具体实例包括用于过敏性皮肤的香料和化妆品(化妆品和芳香产品)；施用于具有创伤或炎症的皮肤的外用药品产品或准药品；施用于眼睛、鼻腔、口腔等的黏膜的药品或准药品(例如，喷鼻剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用洗剂、洗鼻液、隐形眼镜装着液等眼部护理产品)等。
当将本发明的低毒性的含有SL的组合物用作阴离子表面活性剂时，低毒性的含有SL的组合物自身可以用作阴离子表面活性剂。或者，低毒性的含有SL的组合物还可包含其他组分，只要不损害本发明的特征即可，即，只要实现低毒性和/或低刺激性，同时提供表面活性剂作用即可。这样的其他组分的实例包括但不限于：溶剂，例如蒸馏水、离子交换水和乙醇；添加剂，例如氯化钠和氯化钾；增溶剂，例如甘油、丙二醇和己二醇；以及增稠剂，例如黄原胶、藻酸和葡聚糖；pH调节剂，例如盐酸、硫酸、硼酸、氢氧化钠和氢氧化钾；螯合剂，例如磷酸化合物、次氮基三乙酸(NTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)；以及其他组分，例如颜料和酶。当并入有其他组分时，阴离子表面活性剂中包含的本发明的低毒性的含有SL的组合物没有特别限制，只要提供表面活性剂作用即可。按酸型SL的量计，阴离子表面活性剂优选地包含量为0.005质量％至99.9质量％，优选地0.01质量％至50质量％，更优选地0.02质量％至10质量％，并且特别优选地0.1质量％至5质量％的低毒性的含有SL的组合物。
当将本发明的低毒性的含有SL的组合物用作用于食品或饮料、药品、准药品或者香料或化妆品的添加剂(食品添加剂、药品添加剂、准药品添加剂)时，低毒性的含有SL的组合物自身可以用作用于这些产品的添加剂。或者，低毒性的含有SL的组合物还可包含其他组分，只要其不损害本发明的特征即可，即，只要提供期望的表面活性剂作用，同时实现低毒性和/或低刺激性即可。这样的其他组分可以根据期望产品(例如食品或饮料、药品、准药品或者香料或化妆品)进行适当选择。当并入有其他组分时，添加剂中包含的本发明的低毒性的含有SL的组合物没有特别限制，只要提供期望的表面活性剂作用即可。按酸型SL的量计，添加剂可包含量为例如0.005质量％至99.9质量％，优选地0.01质量％至50质量％，更优选地0.02质量％至10质量％，并且特别优选地0.1质量％至5质量％的本发明的低毒性的含有SL的组合物。
当将本发明的低毒性的含有SL的组合物添加到食品或饮料、药品、准药品或者香料或化妆品中时，即，当通过使用本发明的低毒性的含有SL的组合物来生产食品或饮料、药品、准药品或者香料或化妆品时，这些产品中低毒性的含有SL的组合物的量可以根据每种产品的目的和特性在提供期望表面活性剂作用的范围内适当选择。虽然待添加的本发明的低毒性的含有SL的组合物的量没有限制，但是可以添加到食品或饮料、药品、准药品或者香料或化妆品中的低毒性的含有SL的组合物的量使得所得食品或饮料等上述产品的CMC为300ppm或更大。例如，就酸型SL而言，这样的食品或饮料等上述产品可包含量为0.005质量％至99.9质量％，优选地0.01质量％至50质量％，更优选地0.02质量％至10质量％，并且特别优选地0.1质量％至5质量％的低毒性的含有SL的组合物。
(IV)用于生产低毒性的含有SL的组合物的方法
(IV-1)起始材料(含SL培养物或其经处理产物)
用作生产低毒性的含有SL的组合物之起始材料的含SL培养物或其经处理产物的实例包括范围广泛的含SL培养物的粗纯化产物和其经处理的包含SL的产物。SL生产酵母的实例包括已知酵母。例如，可以优选地使用上述的Candida(Starmerella)bombicola。Candida(Starmerella)bombicola保藏在ATCC(其为生物资源库)中并且可从其获得(CandidabombicolaATCC22214)。属于念珠菌属并且已知产生SL(酸型SL和内酯型SL)的其他SL生产酵母也可用于生产本发明的低毒性的含有SL的组合物。这样的SL生产酵母的实例包括木兰Candidamagnoliae、Candidagropengisseri、Candidaapicola、Candidapetrophilum、Candidabogoriensis、Candidabatistae等。这些酵母可以是由保藏机构提供的菌株或者通过对其进行连续传代培养获得的菌株。其中，由Rhodotorula(Candida)bogoriensisNRCC9862生产的SL为13-[(2’-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]二十二烷酸6’，6”-二乙酸酯，其中在槐糖与烷基中心处的羟基之间形成糖苷键。虽然这种SL不同于由以上通式(1)和(2)表示的SL，但是从由槐糖和羟基脂肪酸形成的立场来看是相同的，并且包括在本发明SL的范围内。
在本发明中，CandidafloricolaZM-1502菌株(FERMP-21133)和CandidafloricolaNBRC10700T菌株可以适当地用作选择性仅生产酸型SL的SL生产酵母。下文中，这些SL生产酵母也可以称为“酸型SL生产酵母”，从而将这些SL生产酵母与生产酸型SL和内酯型SL二者的SL生产酵母(内酯型/酸型SL生产酵母)区分开。
或者，也可以使用非专利文献(非专利文献2)中公开的乙酰转移酶缺失的Candidabombicola。当使用乙酰转移酶缺失的Candidabombicola时，可以通过单一步骤生产非乙酰化SL。
用于培养SL生产酵母的优选方法是例如培养并同时给予高浓度的糖和疏水性油性底物的方法。培养方法不限于此，并且可以使用宽范围的已知方法，只要其不干扰本发明的效果即可。已知方法可以是JP2002-045195A(专利文献2)等中公开的方法。更具体地，可以使用葡萄糖作为糖并使用包含脂肪酸和植物油的碳源作为疏水性油性底物来培养SL生产酵母的方法。
培养基组成没有特别限制。已知SL的脂肪酸部分取决于脂肪酸链长和作为培养基组分添加的疏水性底物的比例，并因此可以在一定程度上进行控制。例如，高比例的油酸或含油酸脂质适于用作疏水性底物。实例包括植物油(例如棕榈油、米糠油、菜籽油、橄榄油和红花油)，以及动物油(例如猪油和牛脂肪)。对于具有稳定高产率的SL发酵生产，亲水性糖和疏水性脂肪/油的混合物优选地作为碳源。葡萄糖常常用作亲水性底物。
在使用已知的固液分离方法(例如离心分离或倾析)从所得培养液中分离并除去液体组分之后，用水洗涤所得固体以获得含SL级分(含SL培养物)。通过培养内酯型/酸型SL生产酵母获得的含SL级分(含SL培养物)是内酯型SL和酸型SL的混合物(含有内酯型/酸型SL的组合物)。SL总量中酸型SL的含量小于45质量％(基于固体)。相比之下，通过培养酸型SL生产酵母获得的含SL级分(含SL培养物)中包含的SL均为酸型SL。
用于从SL生产酵母的培养液中收集含有内酯型/酸型SL的组合物(或含有酸型SL的组合物)的方法可以是任意已知的方法，只要该方法不干扰本发明的效果即可。可用方法的实例包括JP2003-009896A(专利文献(PTL)3)中公开的方法等。该方法通过调节SL生产酵母的培养液或由其制备的含SL级分的pH来控制SL在水中的溶解度。具体地，在用NaOH水溶液等将SL生产酵母的培养液调节至约pH6至7以使SL溶解之后，对所得溶液进行离心以收集上清液。随后，添加硫酸水溶液等以将上清液调节至约pH2至3，从而使SL不溶解。使该混合物沉降之后，倾析所得混合物以获得水含量为约50％的含有内酯型/酸型SL的组合物(或含有酸型SL的组合物)。
(IV-2)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤(脂肪酸除去步骤)
本发明的低毒性的含有SL的组合物可以通过对含SL培养物或所述培养物的经处理产物进行至少(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤来生产。
脂肪酸除去方法的实例包括(a)溶剂萃取、(b)吸附和(c)色谱。这些脂肪酸除去方法可以单独使用或者以两种或更多种的组合使用。当组合使用两种或更多种处理时，处理可以以任意顺序进行，并且该顺序没有特别限制。当顺序为(a)→(c)或(b)→(c)时，优选地首先进行溶剂萃取或吸附。
(a)溶剂萃取
溶剂萃取是使用脂肪酸和羟基脂肪酸的疏水性大于SL的特性来进行的分离方法。溶剂萃取通常是通过使用与含SL溶液不相容的溶剂(通常为水)从含SL溶液中萃取和除去脂肪酸和羟基脂肪酸(疏水性化合物)的方法。与含SL溶液不相容的任何溶剂都可以用作所述溶剂。这样的溶剂的实例包括但不限于乙酸乙酯、乙醚(醚)、己烷等。考虑到酸型SL的高回收率以及脂肪酸和羟基脂肪酸的高除去率，乙醚(醚)是特别优选的。
为了提高脂肪酸和羟基脂肪酸的除去率，优选地事先将待处理的含SL溶液的pH调节至酸性范围。将含SL溶液的pH调节至酸性范围使脂肪酸和羟基脂肪酸的羧基质子化，从而有助于其在溶剂中的回收。酸性范围没有特别限制，并且可以是例如约pH6或更低。具体地，酸性范围为约pH1至小于约pH6，优选地约pH1至5，更优选地约pH1至4.5，并且特别优选地约pH2至4。为了将含SL溶液(含SL培养物或其经处理产物)调节至酸性范围，通常使用pH调节剂。pH调节剂的实例包括：无机酸，例如硫酸、盐酸、硝酸、磷酸、硼酸和氢氟酸；有机酸，例如甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、谷氨酸和天冬氨酸；等。
以下说明了溶剂萃取的具体操作步骤，将使用乙醚(醚)作为溶剂并使用硫酸作为pH调节剂的情况作为实例。首先，将含有SL的组合物(含SL培养物或其经处理产物)添加到分液漏斗中以得到20质量％的乙醇可溶性成分，并调节至pH3。用蒸馏水将总体积调节至100mL。随后，向其中添加1/2至2体积的醚，剧烈混合所得混合物并使其静置。将所得下层转移至另一个分液漏斗中。进一步地，向转移至该分液漏斗中的水相中添加1/2至2体积的醚，剧烈混合所得液体并以与上述相同的方式使其静置。这样的萃取操作进行至少两次，更优选地进行三次或更多次。萃取之后，优选地通过加热或减压除去醚。
(b)吸附
吸附是利用SL、脂肪酸和羟基脂肪酸与所使用吸附剂的亲和力差异来进行的分离方法。可以选择性吸附疏水性化合物的化合物通常可以用作所述吸附剂。实例包括活性炭、硅胶、沸石、离子交换树脂等。也可以使用JP2008-64489A中公开的氧化铝。活性炭对于吸附高度疏水性化合物是特别优选的。离子交换树脂的实例包括强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂是优选的。
为了提高脂肪酸和羟基脂肪酸的除去率，优选地事先将待处理的含SL溶液的pH调节至酸性范围。将含SL溶液的pH调节至酸性范围使脂肪酸和羟基脂肪酸的羧基质子化，从而有助于其被吸附在吸附剂上。酸性范围没有特别限制，并且可以是例如约pH6或更低。更具体地，酸性范围为约pH1至小于约pH6，优选地约pH1至5，更优选地约pH1至4.5，并且特别优选地约pH2至4。为了将含SL溶液(含SL培养物或其经处理产物)调节至酸性范围，通常使用pH调节剂。可用的pH调节剂可以与以上(a)中所说明的那些相同。
以下说明了吸附的具体操作步骤，将使用活性炭作为吸附剂并使用硫酸作为pH调节剂的情况作为实例。首先，通过添加硫酸将对应于30质量％的乙醇可溶性成分的量的含有SL的组合物(含SL培养物或其经处理产物)调节至pH3。向其中添加量为基于含有SL的组合物和活性炭的总量的5质量％至15质量％的活性炭并混合。考虑到提高活性炭对脂肪酸和羟基脂肪酸的吸附效率和通过过滤除去活性炭，可以将混合物加热。加热温度没有特别限制，并且可以是例如40℃至小于100℃，优选地50℃至小于100℃，更优选地55℃至小于100℃，特别优选地60℃至小于100℃。
(c)色谱
色谱是利用两亲性SL的结构来进行的分离方法。作为用作固定相的填料(吸附剂)，通常可以使用本领域中已知的任何填料，例如硅胶、十八烷基硅胶(ODS)树脂、离子交换树脂和合成吸附剂。本发明中使用的色谱优选地是分配色谱，并且特别优选地是反相色谱。对于反相色谱，可以使用对于环境和人体高度安全的洗脱剂(流动相)。
当使用反相色谱作为色谱时，优选地使用ODS树脂等作为填料。当使用包含经疏水十八烷基等化学修饰的硅胶支持物的ODS树脂时，通过利用与SL烷基侧链的疏水相互作用可以从含有SL的组合物(含SL培养物或其经处理产物)中高效地除去脂肪酸和羟基脂肪酸。作为反相色谱的洗脱剂(流动相)，从分离效率等的观点来看，优选地使用极性强于用作固定相的填料的溶剂。这样的洗脱剂的实例包括水和低级醇(例如甲醇或乙醇)的混合物。从安全性和环境的观点来看，水和乙醇的混合物是优选的。洗脱剂优选地包含量为0.01体积％至0.2体积％并且优选地0.05体积％至0.1体积％的挥发性酸组分。这样的酸组分的实例包括甲酸、乙酸和三氟乙酸(TFA)。
为了提高酸型SL在固定相上的吸附量并提高酸型SL的回收率，优选地事先将待经受色谱的含SL溶液的pH调节至酸性范围。由于酸型SL的pKa值为pH6.1至6.4，所以酸性范围优选地小于约pH6。更具体地，酸性范围优选地为约pH1至小于约pH6，更优选地约pH1至5，特别优选地约pH1至4.5，并且特别优选地约pH2至4。为了将含SL溶液(含SL培养物或其经处理产物)调节至酸性范围，通常使用pH调节剂。可用的pH调节剂可以与以上(a)中所说明的那些相同。
以下说明了色谱的具体操作步骤，将使用ODS树脂作为固定相并使用乙醇水溶液作为流动相的情况作为实例。在将含有SL的组合物(含SL培养物或其经处理产物)供应至固定相之后，输送乙醇浓度为约70％至小于80％(％意指体积％；下文中同样适用)的洗脱剂(乙醇水溶液)以收集含有酸型SL的级分，而杂质(例如脂肪酸和羟基脂肪酸)被吸附且保留下来。具体地，可以使用例如以下方法。
(1)由柱的最上部(下文中，分离柱顶部)供应浓度为约70％至小于80％的洗脱剂(例如，乙醇浓度为约70％至小于约80％的洗脱剂(乙醇水溶液))以使柱平衡。
(2)从分离柱顶部添加含有SL的组合物(含SL培养物的经处理产物)。
(3)从分离柱顶部倾倒浓度为约70％至小于80％的洗脱剂以选择性地洗脱和收集含有酸型SL的级分。
在步骤(1)和(3)的每一步中，洗脱剂的乙醇浓度可在上述浓度范围内随时间提高(梯度洗脱法)，或者可在上述浓度范围内保持相同浓度(分步洗脱法)。优选地，使用后一种分步洗脱法。分步洗脱法的实例如下。向用乙醇浓度为70％的乙醇水溶液平衡(步骤(1))的固定相(柱填料)中添加含有SL的组合物(步骤(2))。随后，倾倒乙醇浓度为70％的乙醇水溶液(步骤(3))以洗脱和收集期望的含有酸型SL的级分(步骤(3))。在步骤(3)之前，可使用乙醇浓度小于70％的乙醇水溶液以从含酸性SL级分中除去含SL培养物中包含的臭味组分、着色组分和盐(步骤(3’))。在这种情况下，将步骤(3’)中使用的乙醇水溶液的浓度调节至与步骤(1)中平衡的乙醇浓度相同。
本发明的低毒性的含有SL的组合物可以如下制备：除上述除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤(1)(脂肪酸除去步骤)之外，还对含SL培养物或其经处理产物进行(2)除去SL的乙酰基的步骤(脱乙酰化步骤)和(3)除去内酯型SL的步骤(内酯型SL除去步骤)中的至少一个。以下说明了这些处理步骤。
(IV-3)除去SL的乙酰基的步骤(脱乙酰化步骤)
脱乙酰化方法的实例包括(d)水解处理和(e)酶处理。这些脱乙酰化方法可以单独使用，或者可以以两种或更多种的组合使用。当组合使用两种或更多种处理时，处理可以以任意顺序进行，并且顺序没有特别限制。脱乙酰化步骤是当通过产生乙酰化SL的SL生产酵母生产含SL培养物或其经处理产物时优选使用的处理步骤。当使用选择性生产非乙酰化SL的SL生产酵母(乙酰转移酶缺失的SL生产酵母)制备含SL培养物或其经处理产物时，不使用脱乙酰化步骤。
(d)水解处理
对于水解处理，可以使用众所周知的方法，只要其不干扰本发明的效果即可。例如，可以适当地使用使用碱如氢氧化物的金属(例如，钠、钾、钙、镁等)盐、磷酸盐、碳酸盐或烷醇胺进行的碱水解。此外，水解处理也可以使用各种催化剂如醇来进行。进行碱水解的温度、压力和时间没有特别限制，只要实现除去含SL培养物或其经处理产物中所包含的乙酰基的目的和效果即可。然而，优选的是，使用允许脱乙酰化高效进行同时抑制副反应(例如，期望产物酸性SL的降解和化学改性)的温度、压力和时间。从这个观点来看，反应温度通常为约30℃至120℃，并且优选地50℃至90℃。压力通常为约1个大气压至10个大气压，并且优选地约1个大气压至2个大气压。反应时间通常为约10分钟至约5小时，并且优选地约1小时至3小时。此外，进行碱水解的时间可以根据待处理的含有SL的组合物中与SL结合之乙酰基的数目适当设定。
(e)酶处理
使用酶除去与SL结合之乙酰基的方法是利用由乙酰酯产生醇和乙酸的酶进行的方法。乙酰酯酶通常用作所述酶。例如，可以使用分离自黑曲霉(Aspergillusniger)、红球菌属(Rhodococcussp.)或季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)的乙酰酯酶。
适于乙酰酯酶反应的条件为pH5至8，并且优选地6至7.5。只要可以将pH调节在该范围内，可以使用任何常用的pH调节剂。可用的pH调节剂的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、硫酸、盐酸等。反应温度优选地为20℃至40℃，并且特别优选地20℃至35℃。反应时间通常为6小时或更久，优选地12小时或更久，并且特别优选地1天或更久。
使用酶的脱乙酰化处理没有特别限制，只要其不干扰本发明的目的和效果即可。可用方法的一个实例包括将含有SL的组合物添加到0.1M磷酸水溶液(pH7)中至浓度为10质量％，添加50U的乙酰酯酶，然后在室温(25℃)下搅拌1天。
(IV-4)除去内酯型SL的步骤(内酯型SL除去步骤)
除去内酯型SL之方法的实例包括(f)水解处理和(g)色谱。这些内酯型SL除去方法可以单独使用，或者可以以两种或更多种的组合使用。当组合使用两种或更多种处理时，处理可以以任意顺序进行，并且顺序没有特别限制。然而，(f)→(g)的顺序是优选的。内酯型SL除去步骤是当通过产生酸型SL和内酯型SL二者的SL生产酵母(内酯型/酸型SL生产酵母)生产含SL培养物或其经处理产物时优选使用的处理步骤。当使用选择性地生产酸型SL的SL生产酵母(酸型SL生产酵母)制备含SL培养物或其经处理产物时，不使用内酯型SL除去步骤。
(f)水解处理
本文使用的水解处理是打开含SL培养物或其经处理产物中包含的内酯型SL的内酯环以将内酯型SL转化为酸型SL的处理。
对于水解处理，可以使用众所周知的方法，只要其不干扰本发明的效果即可。例如，可以适当地使用使用碱如氢氧化物的金属(例如，钠、钾、钙、镁等)盐、磷酸盐、碳酸盐或烷醇胺进行的碱水解。此外，水解处理也可以使用多种催化剂如醇来进行。进行碱水解的温度、压力和时间没有特别限制，只要可以实现打开含SL培养物或其经处理产物中所包含的内酯型SL的内酯环的目的和效果即可。然而，优选的是，使用允许内酯环打开高效进行同时抑制副反应(例如，期望产物酸性SL的降解和化学改性)的温度、压力和时间。从这个观点来看，反应温度通常为约30℃至120℃，并且优选地约50℃至90℃。压力通常为约1个大气压至10个大气压，并且优选地约1个大气压至2个大气压。反应时间通常为约10分钟至约5小时，并且优选地约1小时至3小时。此外，进行碱水解的时间可以根据待处理的含有SL的组合物中包含的内酯型SL的比例适当设定。
(g)色谱
本文使用的色谱是选择性地除去含SL培养物或其经处理产物中包含的内酯型SL的处理。
通常来说，作为用作固定相的填料(吸附剂)，可以使用本领域已知的任何填料，例如硅胶、十八烷基硅胶(ODS)树脂、离子交换树脂和合成吸附剂。本发明中使用的色谱优选地是分配色谱，并且特别优选地是反相色谱。
当使用反相色谱作为色谱时，优选地使用ODS树脂等作为填料。从分离效率等的观点来看，优选地使用极性大于用作固定相的填料的溶剂作为反相色谱的洗脱剂(流动相)。这样的洗脱剂的实例包括水和低级醇(例如甲醇或乙醇)的混合物。从安全性和环境的观点来看，水和乙醇的混合物是优选的。洗脱剂优选地包含量为0.01体积％至0.2体积％并且优选地0.05体积％至0.1体积％的挥发性酸组分。这样的酸组分的实例包括甲酸、乙酸和三氟乙酸(TFA)。
为了提高吸附在固定相上的酸型SL的量并提高酸型SL的回收率，优选地事先将待处理的含SL溶液的pH调节至酸性范围。由于酸型SL的pKa值为pH6.1至6.4，所以酸性范围优选地小于pH6。更具体地，酸性范围优选地为约pH1至小于约pH6，更优选地约pH1至5，特别优选地约pH1至4.5，并且特别优选地约pH2至4。将含SL溶液(含SL培养物或其经处理产物)调节至酸性范围通常使用pH调节剂来进行。可用的pH调节剂可以与以上(a)中所说明的那些相同。
以下说明了色谱的具体操作步骤，将使用ODS树脂作为固定相并使用乙醇水溶液作为流动相的情况作为实例。在将含有SL的组合物(含SL培养物或其经处理产物)供应至固定相之后，倾倒乙醇浓度为约70％至小于80％(％意指体积％；下文中同样适用)的洗脱剂(乙醇水溶液)以收集含有酸型SL的级分，而杂质(例如内酯型SL)被吸附且保留下来。具体地，例如，可以使用以下方法。
(1)由柱的最上部(下文中，分离柱顶部)供应浓度为约70％至小于80％的洗脱剂(例如，乙醇浓度为约70％至小于约80％的洗脱剂(乙醇水溶液))以使柱平衡。
(2)从分离柱顶部添加含有SL的组合物(含SL培养物的经处理产物)。
(3)从分离柱顶部倾倒浓度为约70％至小于80％的洗脱剂以选择性地洗脱和收集含有酸型SL的级分。
在步骤(1)和(3)的每一步中，洗脱剂的乙醇浓度可在上述浓度范围内随时间提高(梯度洗脱法)，或者可在上述浓度范围内保持相同浓度(分步洗脱法)。优选地，使用后一种分步洗脱法。分步洗脱法的实例如下。向用乙醇浓度为70％的乙醇水溶液平衡(步骤(1))的固定相(柱填料)中添加含有SL的组合物(步骤(2))。随后，倾倒乙醇浓度为70％的乙醇水溶液(步骤(3))以洗脱和收集期望的含有酸型SL的级分(步骤(3))。在步骤(3)之前，可使用乙醇浓度小于70％的乙醇水溶液以从含酸性SL级分中除去含SL培养物中包含的臭味组分、着色组分和盐(步骤(3’))。在这种情况下，将步骤(3’)中使用的乙醇水溶液的浓度调节至与步骤(1)中平衡的乙醇浓度相同。
用于生产本发明的低毒性的含有SL的组合物的方法可通过对含SL培养物或其经处理产物单独进行上述脂肪酸除去步骤(IV-2)来进行，或者对含SL培养物或其经处理产物进行脂肪酸除去步骤(IV-2)与脱乙酰化步骤(IV-3)和/或内酯型SL除去步骤(IV-4)的组合来进行。在这种情况下，这些步骤的顺序没有特别限制，只要可以实现本发明的目的即可。
这样两个或更多个步骤的组合的实例包括如下。当通过使用酸型SL生产酵母(参见例如专利文献1)生产含SL培养物或其经处理产物时，脱乙酰化步骤(IV-3)(例如，(d)至(e))可在脂肪酸除去步骤(IV-20(例如，(a)至(c))之后进行。反之，脂肪酸除去步骤(例如，(a)至(c))(IV-2)可在脱乙酰化步骤(例如，(d)至(e))(IV-3)之后进行。虽然这无限制，但是优选脂肪酸除去步骤(IV-2)在脱乙酰化步骤(IV-3)之后进行。特别地，例如，在选自(d)水解和(e)酶处理的至少一种处理之后，可进行选自(a)溶剂萃取、(b)吸附和(c)色谱的至少一种处理。优选为(d)水解与(a)溶剂萃取和/或(c)色谱的组合。
例如，当通过使用内酯型/酸型SL生产酵母生产含SL培养物或其经处理产物(参见例如参考生产实施例1)时，可在内酯型SL除去步骤(IV-4)(例如，(f)至(g))之后以任意顺序组合进行脂肪酸除去步骤(IV-2)(例如，(a)至(c))和脱乙酰化步骤(IV-3)(例如，(d)至(e))的至少一个。由于(f)和(g)(即，内酯型SL除去步骤(IV-4))与脱乙酰化步骤(IV-3)的(d)和脂肪酸除去步骤(IV-2)的(c)重复，所以在进行内酯型SL除去处理(IV-4)时可以同时进行脱乙酰化(IV-3)或脂肪酸除去(IV-2)。优选组合可以是例如其中在水解(d)(或(f))之后进行选自溶剂萃取(a)和色谱(c)(或(g))的至少一种处理的方法。
另外，例如，当使用乙酰转移酶缺失的SL生产酵母制备含SL培养物或其经处理产物(参见例如非专利文献(NPL)2)时，可以任意顺序组合进行内酯型SL除去步骤(IV-4)(例如，(f)至(g))和脂肪酸除去步骤(IV-2)(例如，(a)至(c))。优选组合可以是例如其中在(f)水解之后进行选自(a)溶剂萃取和(c)色谱的至少一种处理的方法。
(V)用于降低含有SL的组合物的毒性的方法
根据上述生产方法，使得从SL生产酵母制备的含有SL的组合物的毒性较小且刺激性较小以提供本发明的低毒性的含有SL的组合物。因此，上述生产方法可以解释为用于降低通过培养SL生产酵母生产的含有SL的组合物的毒性和刺激性的方法。
用于降低毒性的方法(或者用于降低刺激性的方法)可以根据(IV)中的上述方法进行。上述在第(IV)部分中的全部描述可以通过引用并入此处。在第(III)部分说明的本发明的低毒性的含有SL的组合物可以通过使用用于降低毒性的方法(或用于降低刺激性的方法)来制备和获得。因此，对于通过降低使用SL生产酵母生产的含有SL的组合物的毒性和刺激性而获得的低毒性的含有SL的组合物，第(III)部分中的全部描述通过引用并入此处。
实施例
以下将参照实施例和测试例更具体地描述本发明。但是，本发明不限于此或受其限制，本领域的技术人员可在本发明的精神内进行多种修改。
参考生产实施例1：SL的生产(粗纯化的含有SL的组合物-1的制备)
使用每升包含10g水性葡萄糖(由NihonShokuhinKakoCo.，Ltd.生产，产品名称：NisshokuGansuiKesshoBudoto)、10g蛋白胨(由OrientalYeastCo.，Ltd.生产，产品名称：PeptoneCB90M)和5g酵母萃取物(由AsahiFood&HealthcareCo.，Ltd.生产，产品名称：MeastPowderN)的液体培养基作为培养基。在摇动下，在培养基中在30℃下培养CandidabombicolaATCC22214两天。这用作预培养液。
基于培养基的总量，以4质量％的量将预培养液接种至5升发酵罐中的主培养基(3L)中，然后在30℃和0.6vvm的通气速率下培养6天以进行发酵。主培养基每升包含100g水性葡萄糖、50g棕榈油精(由NOFCorporation生产，产品名称：Palmary2000)、50g油酸(由AcidChem生产，产品名称：Palmac760)、1g氯化钠、10g磷酸二氢钾、10g七水合硫酸镁、2.5g酵母萃取物(由AsahiFood&HealthcareCo.，Ltd.生产，产品名称：MeastPowderN)和1g尿素(灭菌之前pH为4.5至4.8)。
从开始培养的第六天，停止发酵。将从发酵罐除去的培养液加热，然后降回到室温，并使其静置2天至3天。结果，培养液从底部按这个顺序分离成以下三层：液态棕色沉淀物层；推断主要含真菌细胞的乳白色固态层；和上清液。将上清液除去之后，以与除去的上清液的量相同的量添加工业用水或地下水。在对所得的混合物进行搅拌的同时，逐渐添加48质量％氢氧化钠水溶液以调节pH至6.5至6.9，从而使培养液中包含的SL溶解。通过台式离心机(Westfalia：由WestfaliaSeparatorAG生产)对所得的产物进行离心以使乳白色固体沉淀，并收集上清液。在对收集的上清液进行搅拌时，逐渐添加浓度为62.5质量％的硫酸水溶液以调节pH至2.5-3.0，从而再次使SL不溶。在使所得的混合物静置2天之后，通过倾析尽可能将上清液除去，从而获得残余物作为粗纯化的含有SL的组合物-1(其含水量为约50％，参考实施例1)。
参考生产实施例2：粗纯化的含有SL的组合物-2的制备
通过添加氢氧化钠水溶液将上述参考生产实施例1中获得的粗纯化的含有SL的组合物-1调节至pH14，然后在80℃下对所得的混合物进行热处理2小时以进行水解(碱水解)。随后，将水解产物降温至室温，然后通过使用硫酸(9.8M水溶液)调节至pH7.5。通过过滤除去产生的不溶性物质以获得滤液作为“粗纯化的酸性含有SL的组合物-2”(参考生产实施例产物2)。
实施例1：低毒性的含有SL的组合物的制备
通过使用硫酸(9.8M水溶液)将参考生产实施例2中获得的粗纯化的酸性含有SL的组合物-2调节至pH3.0。
在以下条件下对其进行反相柱色谱：
固定相：C18柱(COSMOSIL40C18-PREP，由NacalaiTesque，Inc.生产，15kg)；
流动相：50％和70％乙醇水溶液。
具体地，将1.2kg调节至pH3.0的粗纯化的酸性含有SL的组合物-2(按其乙醇可溶性成分计，相对于15kg固定相负载量的约3％的量的粗纯化的酸性含有SL的组合物-2)添加至C18柱。首先，供应35L50％乙醇水溶液以通过洗脱除去水溶性杂质(臭味、盐和一部分着色组分)。随后，向柱提供30L70％乙醇水溶液以在开始用70％乙醇溶液进行洗脱时收集第一15L作为含SL级分。
使获得的含SL溶液经受蒸发器(由ToyoChemicalFoodPlantCo.，Ltd.生产)以蒸馏出溶剂(乙醇)并将溶液浓缩。使浓缩物经受喷雾干燥器(干燥喷雾器)(型号：R-3，由SUS304制成，水蒸发量：最大量5kg/h，由SakamotogikenCo.，Ltd.生产)以获得干燥粉末。喷雾干燥条件如下：喷雾器：12,000rpm；和腔内温度：105℃。结果，获得细粉末(实施例产物1)。
实施例2：低毒性的含有SL的组合物的制备
通过使用硫酸(9.8M水溶液)将参考生产实施例2中获得的粗纯化的酸性含有SL的组合物调节至pH3.0。
将1.2kg调节至pH3.0的粗纯化的酸性含有SL的组合物-2倒入分液漏斗，然后添加400ml乙醚并混合。使混合物分离成两层之后，将下层收集在另一个分液漏斗中。再添加400ml乙醚，并用乙醚进行萃取三次。在50℃下使从下层收集的液体静置直至不能再闻到醚的气味。以与实施例1中相同的方式对收集的液体进行反相柱色谱。具体地，将收集的通过蒸发从中除去乙醚的液体添加至C18柱之后，首先向其提供35L50％乙醇水溶液以通过洗脱除去水溶性组分(臭味、盐和一部分着色组分)。随后，向柱供应30L70％乙醇水溶液以在开始用70％乙醇溶液进行洗脱时收集第一15L作为含SL级分。
使获得的含SL溶液经受蒸发器(由ToyoChemicalFoodPlantCo.，Ltd.生产)以蒸馏掉溶剂(乙醇)并由此使其浓缩。使浓缩物经受喷雾干燥器(干燥喷雾器)(型号：R-3，由SUS304制成，水蒸发量：最大量5kg/h，由SakamotogikenCo.，Ltd.生产)以获得干燥粉末。喷雾干燥条件如下：喷雾器：12,000rpm；和腔内温度：105℃。结果，获得细粉末(实施例产物2)。
实施例3至7：低毒性的含有SL的组合物的制备
通过使用硫酸(9.8M水溶液)将参考生产实施例2中获得的粗纯化的酸性含有SL的组合物调节至pH3.0。通过以下方法(溶剂萃取)用乙醚(醚)对其进行萃取。
具体地，按乙醇可溶性成分计，将调节至pH3.0的粗纯化的含有SL的组合物-2以3g的量置于带螺旋盖的50ml玻璃离心管中，并添加蒸馏水以使总体积为15ml。在使其与以下各个体积的醚混合并且剧烈混合之后，在200×g下对所得的混合物进行离心2分钟以使混合物分离成两层。除去上层醚层(萃取操作)。此萃取操作进行如下所述次数。
实施例3：使用3ml醚进行萃取1次(→实施例产物3)。
实施例4：使用7ml醚进行萃取1次(→实施例产物4)。
实施例5：使用15ml醚进行萃取1次(→实施例产物5)。
实施例6：使用15ml醚进行萃取2次(→实施例产物6)。
实施例7：使用15ml醚进行萃取3次(→实施例产物7)。
其后，在50℃下使萃取物静置，然后将醚除去以获得含有SL的组合物(实施例产物3至7)。
实施例8至10：低毒性的含有SL的组合物的制备
通过添加氢氧化钠水溶液将上述参考生产实施例1中获得的粗纯化的含有SL的组合物-1调节至pH14，然后通过在80℃下加热15分钟(实施例8)，在80℃下加热30分钟(实施例9)，和在80℃下加热45分钟(实施例10)使其水解(进行碱水解)。将各水解产物降温至室温，然后通过添加硫酸(9.8M水溶液)调节至pH7.5。通过过滤将产生的不溶物质除去。此外，使用硫酸(9.8M水溶液)将各个所得的混合物调节至pH3.0并按乙醇可溶性成分计以3g的量置于带螺旋盖的50ml玻璃离心管中，并添加蒸馏水以使其各自的总体积为15ml。在添加己烷并剧烈混合之后，在200×g下对各个混合物进行离心2分钟以使混合物分离成两层，并除去上层己烷层(萃取操作)。此萃取操作进行5次。然后在80℃下使各个萃取物静置以除去己烷。从而获得含有SL的组合物(实施例产物8至10)。
测试例1用于测量每个样品的物理特性的方法
根据以下方法测量上述参考生产实施例1和2与实施例1至10中获得的含有SL的组合物(粗纯化的含有SL的组合物-1、粗纯化的含有SL的组合物-2和实施例产物1至10)的酯值(mgKOH/g)、羟值(mgKOH/g)、醚萃取物含量(％)、色度(OD440)、蒸发残余物(％)、干燥失重(％)、乙醇可溶性成分(％)和红外吸收光谱(cm-1)。还进行了HPLC分析。
(1)测试总结
表1
(2)测试方法
(A)酯值
酯值可以作为为皂化值(使量相当于1g其乙醇可溶性成分的样品中包含的游离酸中和和使量相当于1g其乙醇可溶性成分的样品中包含的酯皂化所需的氢氧化钾的量(mg)：JISK3331，脂肪、油和相关物质的JOCS标准分析方法(2.3.2.1-1996))与酸值(使量相当于1g其乙醇可溶性成分的样品中包含的游离酸中和所需的氢氧化钾的量(mg)：JISK3331，脂肪、油和相关物质的JOCS标准分析方法(2.3.1-1996))之差来确定。或者，作为用于直接测量的方法，还可使用以下方法。
直接法
向皂化烧瓶中准确地称取约3g样品，并添加50mL95体积％乙醇。在适当地旋转烧瓶并使用酚酞指示剂时，通过用0.1mol/L氢氧化钾标准溶液滴定使样品中和(从而获得酸值)。随后，准确地添加25mL0.5mol/L氢氧化钾-乙醇标准溶液，并给烧瓶配备冷凝器。通过不时地旋转缓慢地加热烧瓶，同时调节加热温度以使回流的乙醇不到达冷凝器的上端。将烧瓶的内容物煮沸30分钟之后立即使烧瓶冷却。在所述内容物硬化成琼脂样状态之前除去泠凝器。添加几滴酚酞指示剂，并用0.5mol/L盐酸标准溶液进行滴定。将指示剂的轻微的深红色消失之后的30秒定义为终点。将到达此终点所需的0.5mol/L盐酸标准溶液的量定义为“该测试中使用的0.5mol/L盐酸标准溶液的量(mL)”。为了进行比较，通过向烧瓶中称取50mL95体积％乙醇并精确地添加25mL0.5mol/L盐酸标准溶液来同时进行空白测试。将空白测试中所需的0.5mol/L盐酸标准溶液的量定义为“空白测试中使用的0.5mol/L盐酸标准溶液的量(mL)”。1g样品的酯值由下式1来计算。量相当于1g其乙醇可溶性成分的样品的酯值根据下式2由乙醇可溶性成分(％)来计算。
lg样品的酯值＝[28.05×(A-B)×F]/C(式1)
A：空白测试中使用的0.5mol/L盐酸标准溶液的量(mL)
B：该测试中使用的0.5mol/L盐酸标准溶液的量(mL)
C：样品量(g)
F：0.5mol/L盐酸标准溶液的因数
量相当于1g其乙醇可溶性成分的样品的酯值＝[1g样品的酯值]×100/D(式2)
D：样品的乙醇可溶性成分(％)
(B)羟值
羟值可以根据由日本油化学会规定的脂肪、油和相关物质的JOCS标准分析方法(2.3.6.2-1996)由使量相当于1g乙醇可溶性物质的样品中包含的游离羟基乙酰化所必需的乙酸中和所需的氢氧化钾的量(mg)来获得。
试剂
乙酰化试剂：将12.5g乙酸酐置于100ml容量瓶中。添加吡啶至标记线。小心地使混合物充分混合。将由此制备的液体保存在棕色瓶中以使其不暴露于湿气、二氧化碳和酸性蒸汽。
测试方法
将1克样品置于长颈圆底烧瓶中。添加适当量的丙酮。在105℃下对所得的混合物进行加热以除去水。其后，精确地添加5ml乙酰化试剂并加热至95℃至100℃。加热1小时之后，将烧瓶从热浴中取出，并使其在空气中冷却。添加1ml蒸馏水并混合之后，再次将烧瓶置于热浴中并加热10分钟。再次将烧瓶取出并使其在空气中冷却之后，添加冷凝在漏斗壁上的液体同时用5ml中性乙醇洗掉。向烧瓶的内容物添加酚酞溶液并用0.5NKOH/EtOH进行滴定以根据下式计算1g样品的羟值。在下式3中，酸值为使1g样品中包含的游离酸中和所需的氢氧化钾的量(mg)并可以根据脂肪、油和相关物质的JOCS标准分析方法(JISK3331)[2.3.1-1996]来测定。量相当于1g乙醇可溶性成分的样品的羟值可以根据式4由乙醇可溶性成分(％)获得。
羟值(mgKOH/g)＝[(a-b)×28.055×F]/C+酸值(式3)
a：空白测试中的0.5NKOH/EtOH的滴定量(ml)
b：该测试中的0.5NKOH/EtOH的滴定量(ml)
c：样品量(g)
F：0.5NKOH/EtOH的因数
量相当于1g乙醇可溶性成分的样品的羟值＝[1g样品的羟值]×100/d(式4)
d：样品的乙醇可溶性成分(％)
(C)醚萃取物含量(％)
醚萃取物含量为用醚从量相当于1g其乙醇可溶性成分的样品中萃取的物质量(质量％)。
测量方法
将1克样品置于50ml回收烧瓶中，并添加10ml10％氢氧化钠水溶液。将冷凝器与烧瓶连接，并在80℃下进行加热2小时。添加10ml10％盐酸水溶液进行中和。在添加99.5％乙醇时，使用蒸发器将水蒸馏掉。其后，添加10ml99.5％乙醇，并用超声处理使所得的混合物分散。通过玻璃漏斗将分散体过滤，并将滤液转移至50ml回收烧瓶。用99.5％乙醇进一步洗涤滤液之后，使用蒸发器将乙醇蒸馏掉。将残余物转移至15ml带螺旋盖的玻璃离心管，并通过使用硫酸(由KantoChemicalCo.，Inc.生产)调节至pH3。在用蒸馏水将总体积调节至5mL之后，添加5ml醚。将所得混合物剧烈混合并使用台式离心机H-108M2(由KokusanCo.，Ltd.生产)在1,000rpm下离心2分钟以使混合物分离成两层。将上层转移至已知重量的100ml烧杯中，并重新添加5ml醚。总计进行醚萃取操作3次。将包含醚萃取物的100ml烧杯置于50℃孵育箱中，并除去醚。使所得混合物进一步在105℃孵育箱中静置30分钟以彻底除去醚。
在将所得混合物降温至室温之后，测量重量。根据下式5计算1g样品中的醚萃取物含量。量相当于1g样品之乙醇可溶性成分的样品中的醚萃取物含量可以根据下式6由乙醇可溶性成分(％)来计算。
1g样品中的醚萃取物含量(质量％)＝{([除去醚之后烧杯的重量]-[测试之前烧杯的重量])/样品量(g)}×100(式5)
量相当于1g乙醇可溶性成分的样品中的醚萃取物含量(质量％)＝{[1g样品中的醚萃取物含量(质量％)]}×100/d(式6)
d：样品的乙醇可溶性成分(％)
(D)通过HPLC分析对醚萃取物进行组分分析
将在上述(C)醚萃取物含量中获得的醚萃取物溶解于99.5％乙醇以获得1％溶液。在下表中示出的条件下进行HPLC分析。在这些HPLC分析条件下，在8分钟至20分钟的保留时间内检测到酸型SL，在20分钟至45分钟的保留时间内检测到羟基脂肪酸，并在44分钟至55分钟的保留时间内检测到脂肪酸。将在20分钟至55分钟的保留时间内检测到各个峰与已知的羟基脂肪酸和脂肪酸(标准产品)的保留时间进行对照以鉴定样品中包含的羟基脂肪酸和脂肪酸。将脂肪酸的峰或羟基脂肪酸的峰的面积除以在20分钟至55分钟的保留时间内检测到的峰面积的总和以计算每1g乙醇可溶性成分脂肪酸的比例和羟基脂肪酸的比例。即，根据下式10计算脂肪酸的含量和羟基脂肪酸的含量。
脂肪酸或羟基脂肪酸的含量(％)＝醚萃取物含量(％)×A1/A2
(式10)
A1：脂肪酸或羟基脂肪酸的峰面积
A2：脂肪酸和羟基脂肪酸的峰面积的总和
获得的脂肪酸以以下方式来表示。碳原子的数量表示在C之后；双键的数量表示在冒号之后。即，例如，具有18个碳原子和1个双键的油酸表示为C18∶1。羟基脂肪酸通过在末端添加(OH)来表示。即，具有18个碳原子的羟基油酸表示为C18∶1(OH)。
表2
(E)色度(OD 440 )
色度(OD440)可以通过测量将样品溶解于碱性水溶液(0.1NNaOH中的2％Na2CO3)中以使所得溶液的乙醇可溶性成分为10质量％而制备的水溶液在440nm下的吸光度来获得。
(F)蒸发残余物(％)
在进行准确称量之后，根据JISK0067-1992的第二法(在热板上进行热蒸发的方法)将样品蒸发至干燥，并称量残余物。根据下式7计算蒸发残余物(％)。
蒸发残余物(％)＝([W2-W3]/[W1-W3])×100(式7)
W1：样品和样品容器的总质量(g)
W2：残余物和样品容器的总重量(g)
W3：样品容器的质量(g)
(G)干燥失重(％)
准确地称量样品然后根据JISK0067-1992的第一法(在大气压下通过加热进行干燥的方法)通过加热(105±2℃，2小时)进行干燥。测定干燥之后样品的降低量。根据下式8计算干燥失重(％)。
干燥失重(％)＝([W1-W2]/[W1-W3])×100(式7)
W1：干燥之前称量瓶和样品的总质量(g)
W2：干燥之后称量瓶和样品的总质量(g)
W3：称量瓶的质量(g)
(H)乙醇可溶性成分(％)
乙醇可溶性成分指当向样品中添加乙醇时溶解于乙醇中的物质的量。
测量方法
准确地称量锥形瓶和玻璃过滤器。在105℃下在干燥器中进行干燥2小时或更久并使其冷却之后测量这些仪器的重量。准确称取约5g样品精确至1毫克，并置于锥形瓶中。向样品中添加100mL乙醇之后，给烧瓶配备玻璃管并在水浴中加热30分钟同时不时地旋转烧瓶以进行溶解。对于粉末状或颗粒状样品，使用95体积％乙醇。对于液态或糊状样品，使用99.5体积％乙醇。在通过玻璃过滤器将热溶液过滤之后，再次向锥形瓶中的残余物添加50mL乙醇以使残余物溶解。使用玻璃过滤器将所得的热溶液过滤，并用热乙醇充分洗涤锥形瓶和玻璃过滤器。在使其冷却至室温之后，将滤液和洗涤液转移至250ml容量瓶，并添加乙醇至标记线。使用移液管将每份100ml液体等分到两个已知质量的200ml烧杯中。在水浴中将烧杯中的一个加热，并除去乙醇。在调节至105±2℃的干燥器中干燥残余物1小时，使其在干燥器中冷却，然后准确地称量(干燥的残余物)。
根据下式8计算乙醇可溶性成分(％)。
乙醇可溶性成分(质量％)＝(A/[S×100/250])×100(式8)
＝([250×A]/S)
A：干燥的残余物量(g)
S：样品质量(g)
(I)灼烧残余物
灼烧残余物测试是在通过以下方法(第一法)灼烧样品之后对残余物质的量进行测量的方法。该方法通常用于测量有机物质中包含作为杂质的无机物质的量。在一些情况下，该方法还用于测量有机物质中包含作为组分的无机物质的量，或者挥发性无机物质中包含的杂质的量。例如，在本发明中，“0.1％或更少的灼烧残余物(第一法，1g)”意指当准确地测量约1g样品并根据下述第一法的操作程序进行灼烧时，灼烧之后样品的残余物基于样品的取样量为0.10％或更少。
取样方法
将由铂、石英或陶瓷制成的坩埚灼烧至恒重并使其在干燥器(硅胶)中冷却之后，准确地测量坩埚的质量。向坩埚中准确地称取(测量误差范围为±10％之内)预定量(取样量)的各样品，然后进行以下程序。
第一法
在坩埚中，用少量的硫酸将样品润湿并在尽可能低的温度下逐渐加热以使大多数样品烧成灰或蒸发。然后用硫酸将样品润湿，使其完全灰化，并灼烧(在450℃至550℃下)至恒重。使残余物在干燥器(硅胶)中冷却之后，准确地测量质量。根据下式9灼烧残余物(％)由测量值(残余物)和之前测量的取样量获得。
灼烧残余物(％)＝([W2-W3]/[W1-W3])×100(式9)
W1：取样量和样品容器(坩埚)的总质量(g)
W2：残余物和样品容器(坩埚)的总重量(g)
W3：样品容器(坩埚)的质量(g)
(J)红外吸收光谱
液态样品通过在105±2℃下加热3小时进行干燥至固态之后使用。固态样品原样使用。通过ATR方法使用SpectrumTM100傅立叶变换红外光谱仪(由PerkinElmerCo.，Ltd.生产)分析红外吸收光谱。
(3)测试结果
表3示出参考生产实施例和实施例中制备的含有SL的组合物(粗纯化的含有SL的组合物-1，粗纯化的含有SL的组合物-2和实施例产物1至10)的测试结果。
表3
测试例2表面活性剂性能评价
对上述参考生产实施例2和实施例1至10中获得的含有SL的组合物(粗纯化的含有SL的组合物-2和实施例产物1至10)的临界胶束浓度(CMC)和表面张力降低能力进行测量。为了对比性对照，还对市售阴离子表面活性剂(A：“AmisoftLT-12”(30％)，由AjinomotoCo.，Inc.生产，B：“SurfactinNa”(100％)，由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.生产，C：“LipolanLJ-441”(37％)，由LionCorporation生产)、吐温20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(20E.O.))和SLS(月桂基硫酸钠)的临界胶束浓度(CMC)和表面张力降低能力进行测量。市售阴离子表面活性剂A包含N-酰基-L-谷氨酸三乙醇胺作为组分。市售阴离子表面活性剂B含有表面活性素钠作为组分。市售阴离子表面活性剂C包含α-烯烃磺酸钠作为组分。
(1)实验方法
根据Wilhelmy法测量临界胶束浓度(CMC)和表面张力降低能力。在pH7和20℃下使用CBVP-Z自动表面张力计(由KyowaInterfaceScienceCo.，Ltd.生产)进行测量。对于pH调节，使用氢氧化钠水溶液或盐酸水溶液。
(2)实验结果
表4示出样品的临界胶束浓度(CMC)和表面张力降低能力的测量结果。
表4
测试例3使用HeLa细胞进行的细胞毒性测试
使用HeLa细胞对上述参考生产实施例2和实施例1至10中获得的含有SL的组合物(粗纯化的含有SL的组合物-2和实施例产物1至10)进行细胞毒性测试。为了对比性对照，还对上述市售阴离子表面活性剂A至C、吐温20和SLS进行细胞毒性测试。
(1)实验方法
将HeLa细胞(KuraboIndustries，Ltd.)接种到96-孔板中至浓度为2×104个细胞/孔并在37℃和5％CO2下在包含10％NCS(新生牛血清：由Invitrogen生产)、非必需氨基酸、58μg/mlL-谷氨酸、60μg/ml卡那霉素的Dulbecco’sModifiedEagle培养基(由NissuiPharmaceuticalCo.，Ltd.生产)中培养72小时。用包含样品的培养基替换此培养基。48小时后，用包含1mg/mlMTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物)的培养基替换各培养基。使处理进行2小时之后，用异丙醇萃取甲染料。测量在570nm波长下的吸光度。根据下式计算细胞的存活力％。
细胞存活力(％)＝(A/B)×100(式10)
A：用样品处理48小时之后接种细胞的培养基的吸光度(OD570)
B：无样品的接种细胞的培养基的吸光度(OD570)
(2)实验结果
细胞存活力由上述MTT测定计算，并且细胞致死浓度(IC50)由所获得的细胞存活力测定。
图1是绘制由细胞存活力计算的细胞致死浓度(IC50)相对于测试例1中计算的CMC的图。表5示出使用各样品关于测试例1中计算的CMC(ppm)、细胞致死浓度(IC50)和由这两个值相除计算的值(IC50/CMC)获得的结果总结。
表5
这些结果显示实施例产物1至10的IC50为2,000ppm至60,000ppm，其明显高于市售表面活性剂、吐温20和SLS的IC50(10ppm至700ppm)，这由此表明实施例产物1至10的毒性显著地低。另外，这些实施例产物的IC50与粗纯化的含有SL的组合物-2的IC50(1,500ppm)相等或者是其1.3倍，其在生产实施例产物期间作为中间产物而获得。此结果证明毒性组分通过对粗纯化的含有SL的组合物-2进行的处理(溶剂萃取处理、疏水性柱色谱)被显著地除去。
提出在此测试中进行的细胞毒性测试替代Draize测试(一种作为替代的眼刺激性测试)，Draize测试通常用作眼刺激性测试以评价对眼睛或黏膜的刺激性(KenjiOkamoto，Nihon-niokeruganshigekisei-shikendaitaiho-nodoukou[“TrendsinalternativeocularirritationtestmethodsinJapan”]，FragranceJournal2005-2，第67页至71页；Daitaiho-womochiitekeshohingenryo-noganshigekisei-wohyokasuruniatattenoshishin[“Guidelinesforevaluatingocularirritationofcosmeticmaterialsusingalternativemethods”](由厚生科学研究班(HealthandWelfareScientificResearchGroup)制订)Altern.AnimalTest.Experiment，5(Supplement)，1988)。根据后一篇文献的厚生劳动省的提案，当使用测试物质以及使用吐温20作为无刺激的标准物质并使用SLS作为阳性对照物质进行细胞毒性测试时，可将IC50大于吐温20的IC50的受试物质评价为“基本无刺激的”，并且可以将IC50低于吐温20的IC50但高于SLS的IC50的测试物质评价为“轻度刺激的”(参见后一篇文献的注释8)。
如上表中所示，在实施例1至10中获得的本发明的低毒性的含有SL的组合物的IC50值显著地大于吐温20的IC50，因此确定为“无刺激的”材料。本发明的低毒性的含有SL的组合物的IC50值远大于市售表面活性剂的IC50。因此，与已知的表面活性剂相比，本发明的低毒性的含有SL的组合物的毒性更小且刺激性更小。
另外，本发明的低毒性的含有SL的组合物的IC50与CMC之比(IC50/CMC)为6.7∶1至200∶1，并且IC50值与CMC差异很大。因此，确定本发明的低毒性的含有SL的组合物充分起到作为表面活性剂的作用同时确保安全性(低毒性且低刺激性)。
测试例4高级脂肪酸和羟基脂肪酸的细胞毒性
高级脂肪酸和羟基脂肪酸的细胞毒性通过使用油酸作为含有SL的组合物中大量包含的高级脂肪酸，并使用12-羟基硬脂酸作为羟基脂肪酸来测量。
具体地，将油酸和12-羟基硬脂酸分别溶解于99.5％乙醇中至浓度为100,000ppm，然后通过GHP膜过滤器(0.45μm)(由NihonPallManufacturingLtd.生产)。用99.5％乙醇将滤液稀释至浓度为1,000ppm至50,000ppm。向10μl的各个稀释溶液中添加990μl10％NCS培养基以制备细胞毒性测试液体(液体的浓度为10ppm至1,000ppm)。使用这些溶液作为测试液体，根据测试例3中描述的方法确定HeLa细胞的存活力(％)。计算油酸和12-羟基硬脂酸的细胞致死浓度(IC50)。
结果显示油酸和12-羟基硬脂酸的细胞致死浓度(IC50)分别为300ppm和160ppm。这些IC50值小至本发明的低毒性的含有SL的组合物(实施例产物1至10)的IC50值(2,000ppm至60,000ppm)的1/6至1/375。因此，存在这样的顾虑：若包含于本发明的低毒性的含有SL的组合物中，这些化合物可能提高含有SL的组合物的细胞毒性。反之，低毒性的含有SL的组合物可以通过以如下方式制备含有SL的组合物来获得：不包含或者仅以痕量包含这样的具有16个至18个碳原子的高级脂肪酸和羟基脂肪酸等。
测试例5内酯型SL对表面活性剂效力的影响
向具有以下示出的组分特征的高纯度含有SL的组合物中添加内酯型SL以制备基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％以0质量％至2质量％的比例包含内酯型SL的组合物(实施例产物11至15)(量相当于1g乙醇可溶性成分的组合物的酯值：0至2mgKOH/g)。
高纯度的含有SL的组合物
(1)基于组合物中酸型SL、内酯型SL、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，酸型SL：99.95质量％，内酯型SL：0质量％，并且脂肪酸和羟基脂肪酸(总计)：0.05质量％，
(2)通过将组合物溶解以使溶液具有10质量％的乙醇可溶性成分浓度而制备的水溶液在440nm波长下的吸光度(OD440)：0.08，
(3)量相当于1g其乙醇可溶性成分的组合物的羟值：596mgKOH，
(4)HeLa细胞致死浓度(IC50)：63,000ppm。
测量这些含有SL的组合物的临界胶束浓度(CMC)和表面张力降低能力，并评价它们作为表面活性剂的性能(润湿性、增溶能力、去污力和起泡性)。根据Wilhelmy法以与测试例2中相同的方式测量临界胶束浓度(CMC)和表面张力降低能力。具体地，在pH7和20℃下使用CBVP-Z自动表面张力计(由KyowaInterfaceScienceCo.，Ltd.生产)进行测量。
表6示出了结果。
表6
通常来说，当将非离子型表面活性剂(内酯型SL是其一个实例)添加至阴离子型表面活性剂(酸型SL是其一个实例)时，表面张力可提高或降低，并且通常无法推测。在本发明的含有SL的组合物中，如表6中所示，当将非离子型表面活性剂(内酯型SL)以高至特定水平的量添加至阴离子型表面活性剂(酸型SL)时，可确定表面张力降低。特别地，当内酯型SL的比例从0％提高至1.5％时，表面张力(最小表面张力)降低。但是，在1.5％时达到稳定；即使以大于1.5％的比例添加内酯型SL，表面张力也未发生变化。
表面张力降低是表面活性剂所需的优点之一。期望以高至2％的浓度包含内酯型SL的本发明的组合物作为表面活性剂具有改善的性能并且实现了增强去污力、润湿性、增溶能力和起泡性的效果。
配方例
各自包含本发明的低毒性的含有SL的组合物的药品和准药品的配方如下所示。
配方例1滴眼剂(pH6.6)
配方例2洗眼剂(pH5.8)
配方例3隐形眼镜装着液(pH7.0)
配方例4隐形眼镜装着液(pH7.5)
配方例5伤口清洁剂(pH6.5)
工业实用性
根据本发明的生产方法和毒性降低方法可以以简单的方式安全并低能耗地生产低毒性的含有SL的组合物。本发明的低毒性的含有SL的组合物对细胞的毒性较小且刺激性也较小，其不仅适用于食品或饮料而且还适用于化妆品、药品或准药品，其为外部施用的(例如，施用于创伤部位)或者施用于黏膜。

Claims (15)

1.低毒性的含有槐糖脂的组合物，其至少含有来自于槐糖脂生产酵母培养物的着色组分、酸型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸，
基于所述组合物中所述酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、所述脂肪酸和所述羟基脂肪酸的总量作为100质量％，按干重计，以下组分为以下比例：
(1)酸型槐糖脂：94质量％至99.99质量％，
(2)内酯型槐糖脂：0质量％至2质量％，
(3)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至4质量％。
2.根据权利要求1所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中基于所述组合物中所述酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，所述内酯型槐糖脂的比例以及所述脂肪酸和羟基脂肪酸的总比例满足以下(i)和(ii)中的至少一个：
(i)内酯型槐糖脂：大于0质量％但不大于2质量％；以及
(ii)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至2.4质量％。
3.根据权利要求1或2所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中基于所述组合物中所述酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，所述内酯型槐糖脂的比例为0.1质量％至1.5质量％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中通过使所述低毒性的含有槐糖脂的组合物溶解以使溶液具有10质量％的乙醇可溶性成分而制备的水溶液在440nm波长下的吸光度(色度：OD440)为0.001至1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中对应于1g其乙醇可溶性成分之量的所述组合物的羟值为460mgKOH/g至630mgKOH/g。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中所述组合物的HeLa细胞致死浓度(IC50)为2,000ppm至60,000ppm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中所述组合物的HeLa细胞致死浓度(IC50)/临界胶束浓度(CMC)比例(IC50/CMC)为6.7至200。
8.阴离子表面活性剂，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物作为活性组分。
9.香料或化妆品、食品或饮料、药品、准药品、或者用于香料或化妆品、食品或饮料、药品或准药品的添加剂，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物。
10.根据权利要求9所述的香料或化妆品、食品或饮料、药品、准药品、或者用于香料或化妆品、食品或饮料、药品或准药品的添加剂，其中所述香料或化妆品、食品或饮料、药品、准药品或者添加剂施用于黏膜、创伤或炎症部位。
11.用于生产根据权利要求1至7中任一项所述的低毒性的含有槐糖脂的组合物的方法，所述方法包括使通过培养槐糖脂生产酵母获得的含有槐糖脂的培养物或所述培养物的经处理产物进行(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中进一步使通过培养槐糖脂生产微生物获得的含有槐糖脂的培养物或所述培养物的经处理产物进行(2)除去与槐糖脂结合的乙酰基和(3)除去内酯型槐糖脂的步骤中的至少一个。
13.用于降低含有槐糖脂的组合物的毒性的方法，所述方法包括使通过培养槐糖脂生产酵母获得的含有槐糖脂的培养物或其经处理产物进行(1)除去脂肪酸和/或羟基脂肪酸的步骤以生产低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中基于所述组合物中酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，按干重计，以下组分为以下比例：
(a)酸型槐糖脂：94质量％至99.99质量％，
(b)内酯型槐糖脂：0质量％至2质量％，以及
(c)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至4质量％。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法生产低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中基于所述组合物中所述酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，所述内酯型槐糖脂的比例以及所述脂肪酸和羟基脂肪酸的总比例满足以下(i)和(ii)中的至少一个：
(i)内酯型槐糖脂：大于0质量％但不大于2质量％；以及
(ii)脂肪酸和羟基脂肪酸总计：0.01质量％至2.4质量％。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述方法生产低毒性的含有槐糖脂的组合物，其中基于所述组合物中所述酸型槐糖脂、内酯型槐糖脂、脂肪酸和羟基脂肪酸的总量作为100质量％，所述内酯型槐糖脂的比例为0.1质量％至1.5质量％。
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