CN111638299A - 一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括制备供试品溶液、制备对照品溶液、高效液相色谱分析、测定等步骤。本发明具有操作简单、稳定、灵敏、准确度高、重复性好等优点，能从色谱的整体特征面貌上较全面的反映明日叶的成分，准确地评价明日叶药材的质量，可较全面地对明日叶的内在质量进行控制与评价，监控明日叶药材的质量及鉴别真伪，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药。

Description

一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明属于中药材指纹图谱的构建方法的领域，具体涉及一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法。
背景技术
中药虽然已经有几千年的应用发展历史，但如何有效的评价中药材质量的真伪、优劣，一直是中药材研究与应用的重点和难点。随着科技的发展，指纹图谱质控技术在中药领域被提出并得到广泛认可，其在中药材质控中的应用也越来越多；中药材指纹图谱是指中药材经过适当处理后，采用一定的分析手段和检测仪器得到的，能够标示该中药材特性的图谱，它是现阶段可以较全面地反映中药材内在质量的最有效的手段之一，也得到了国际社会的认可。
明日叶 (AngelicakeiskeiKoidzumi) ，为伞形科当归属草本植物，原产于日本八丈岛，因今日摘叶，明天又长新芽因此而得名；现明日叶种植主要分布于广西、云南、贵州及台湾等南方地区；主要成分含有黄酮类、香豆素类、萜烯类等，具有抗衰老、抗溃疡、抗血栓、抗癌；降血压、降血脂、降血糖、降胆固醇；改善睡眠、改善视力等作用。近年来学者对明日叶的化学成分、提取分离与纯化，药理活性，明日叶的价值与开发等进行研究。中药指纹图谱能对中药材较复杂化学成分进行分类进行全面的分析；HPLC指纹图谱简便准确、灵敏度高、重复性好、检测种类多、分析快速是目前应用较为广泛的方法。目前关于明日叶的指纹图谱研究较少，历年的《中国药典》均未见收载，缺少对体现整体特性的研究，缺乏全面地控制药材质量的方法，从化学物质基础角度保证中药制剂的稳定性和可靠性，因此建立明日叶指纹图谱，对明日叶的质量评价具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，提供一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，该方法具有操作简单、稳定、灵敏、准确度高、重复性好等优点，能从色谱的整体特征面貌上较全面的反映明日叶的成分，为明日叶质量控制提供了新的科学方法，弥补了现有质量控制技术的不足。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
S1：制备供试品溶液：称取明日叶样品制成供试品溶液，备用；
S2：制备对照品溶液：分别称取绿原酸对照品和木犀草苷对照品，分别制成绿原酸对照品溶液、木犀草苷对照品溶液和混合对照品溶液，备用；
S3：高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在高效液相色谱检测条件下进行分析，将得到的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到明日叶的指纹图谱；所述高效液相色谱检测条件如下：采用ULtimate XB-C8色谱柱；以流动相A为甲醇，流动相B为0.1～0.3%甲酸为流动相进行梯度洗脱，柱温25～35℃，流速0.8～1.2mL/min，检测波长190～400nm，分析时间35min，进样量10μL，洗脱梯度程序：0～20min时，流动相A:流动相B＝5:95～40:60；20～40min，流动相A:流动相B＝40:60～48:52；40～45min，流动相A:流动相B＝48:52～5:95；
S4：测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录45min色谱图，以绿原酸为特征图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰，测定十批明日叶药材的指纹图谱，得到由其共有特征峰构成的明日叶药材的标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有特征峰有14个，其中5号峰为绿原酸。
进一步地，所述步骤S1中供试品溶液的制备包括以下步骤：称取明日叶粉末0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加入30～60mL的75%～95%乙醇超声15～60min，过滤于5℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容到2mL的容量瓶，以离心速度13000rpm/min，离心10min，取上清液，即得供试品溶液。
进一步地，所述步骤S2中对照品溶液的制备包括以下步骤：分别称取绿原酸对照品、木犀草苷对照品3mg，精密称定，分别加入甲醇溶解，定容至5mL的容量瓶，即分别得到绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液；再分别精密吸取1300μL绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液500μL，摇匀即得混合对照品溶液。
进一步地，所述色谱柱为ULtimate XB-C8[4.6 mm×250 mm，5μm]色谱柱。
进一步地，所述流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸。
进一步地，所述柱温为25℃，流速为0.8mL/min。
进一步地，所述检测波长为270nm。
进一步地，所述明日叶的指纹图谱有14个共有特征峰，编号分别为1～14，以5号峰绿原酸为对照峰；各共有特征峰的相对保留时间分别为：1号峰0.210～0.212，2号峰0.225～0.226，3号峰0.415～0.421，4号峰0.889～0.894，5号峰1.000，6号峰1.137～1.139，7号峰1.200～1.202，8号峰1.221～1.223，9号峰1.308～1.325，10号峰1.478～1.492，11号峰1.507～1.521，12号峰1.536～1.552，13号峰1.558～1.574，14号峰1.660～1.680；
各共有特征峰的相对峰面积的平均值分别为：1号峰0.0253，2号峰0.3310，3号峰0.6375，4号峰0.2992，5号峰1.0000，6号峰0.0680，7号峰0.0450，8号峰0.0879，9号峰0.0596，10号峰0.8045，11号峰1.0508，12号峰1.0940，13号峰0.5103，14号峰0.1018，这些共有特征峰构成了明日叶的液相指纹特征，可以作为明日叶的标准指纹图谱。
进一步地，采用SPSS 21.0软件对数据进行主成分分析，第一主成分主要影响明日叶样品质量的峰号为2、4、5、12、13号峰，其权重值分别为-0.942、0.950、0.928、0.998、0.985，第二成分主要影响的明日叶样品质量峰号为1、7号峰，其权重值分别为0.970和0.983。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下有益效果：
1、本发明建立了不同产地的明日叶药材HPLC指纹图谱，所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好，结合各系统适用性参数情况，并经方法学验证，该方法具有准确度高、重复性好、操作简便、稳定性好、易于掌握等优点，且分析时间较短，相似度评价有较好的一致性，主成分平面的得分图与聚类分析实验数据结果较为一致，可以较全面的反映样品的成分，能合理的评价不同产地的明日叶药材，可为全国各地明日叶的质量评价提供参考依据，为明日叶质量的规范化提供了可靠的实验依据，完善了明日叶HPLC指纹图谱的研究，保证明日叶指纹图谱的特征性和代表性。
2、本发明提供的方法通过研究确定了最优的参数条件，采用梯度洗脱方法获得了较好的分离效果，确定14个主要特征峰为共有峰，建立了能够使多数化学成分有效分离的明日叶药材指纹图谱，所建立的标准指纹图谱有14个共有峰，信息量较大，较完整的保留了供试液中的化学成分，通过比较其共有峰可以找出不同明日叶药材之间的细微差别，为完整、准确评价明日叶药材的质量提供了新的对照标准，从而能更好的控制明日叶药材的质量。
3、本发明建立的明日叶药材HPLC指纹图谱可用于鉴别明日叶药材的伪劣，利用该图谱能够明显区别明日叶药材和其他药材，并能区别不同产地的细明日叶，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药。
4、本发明供试品溶液制备简便，色谱条件容易实现，提取得到的明日叶化学成分全面，便于明日叶药材的指纹图谱的建立。
5、本发明综合运用了指纹图谱的共有峰比较、聚类分析和主成份分析的方法实现对明日叶药材的基源鉴别和有效分类，为明日叶药材的质量控制、有效临床使用提供依据。
附图说明
图1是色谱柱为ULtimate XB-C8[4.6×250mm,5μm] 的明日叶HPLC色谱图；
图2是流动相为甲醇-0.1%甲酸的明日叶HPLC色谱图；
图3是柱温为25℃的明日叶HPLC色谱图；
图4是流速为0.8mL/min的明日叶HPLC色谱图；
图5是明日叶全波长扫描色谱图；
图6是检测波长为270nm的明日叶HPLC色谱图；
图7是明日叶洗脱梯度1的HPLC色谱图；
图8是明日叶超声提取法的HPLC色谱图；
图9是提取溶剂为75%乙醇的明日叶HPLC色谱图；
图10是提取时间为30min的明日叶HPLC色谱图；
图11是提取溶剂加入量为30mL的明日叶HPLC色谱图；
图12是混合对照品溶液的HPLC色谱图（1-绿原酸，2-木犀草苷）；
图13是明日叶空白试验色谱图；
图14是明日叶的延长试验图；
图15是明日叶的HPLC标准指纹图谱；
图16是南宁青秀区明日叶的HLPC指纹图谱；
图17是南宁上林县明日叶的HLPC指纹图谱；
图18是北海合浦县明日叶的HLPC指纹图谱；
图19是崇左大新县明日叶的HLPC指纹图谱；
图20是钦州灵山县明日叶的HLPC指纹图谱；
图21是百色田阳县明日叶的HLPC指纹图谱；
图22是桂林永福县明日叶的HLPC指纹图谱；
图23是桂林兴安县明日叶的HLPC指纹图谱；
图24是柳州柳城县明日叶的HLPC指纹图谱；
图25是河池天峨县明日叶的HLPC指纹图谱；
图26是十批不同产地明日叶指纹图谱叠加图；
图27是十批不同产地明日叶对照图谱；
图28是十批不同产地明日叶聚类分析图；
图29是十批不同产地明日叶主成分平面得分图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，作进一步说明。
实施例1 明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法
1实验药材
1.1药材来源
十批明日叶药材，经广西一心医药马利飞副主任中药师鉴定，均为伞形科当归属明日叶(Angelica keiskeiKoidzumi)，实验药材产地见表1。
表1明日叶药材样品信息
药材编号 药材来源 采集时间 药材编号 药材来源 采集时间
S1 南宁青秀区 2019年3月 S6 百色田阳县 2019年9月
S2 南宁上林县 2019年3月 S7 桂林永福县 2019年9月
S3 北海合浦县 2019年3月 S8 桂林兴安县 2019年9月
S4 崇左大新县 2019年3月 S9 柳州柳城县 2019年9月
S5 钦州灵山县 2019年3月 S10 河池天峨县 2019年6月
1.2试剂
所用实验试剂见表2。
表2实验试剂
试剂名称 厂家 批号
无水乙醇（分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司 20190428
石油醚（分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司 20180925
乙酸乙酯（分析纯） 西陇化工股份有限公司 160319
甲醇（分析纯） 成都市科隆化学品有限公司 2019060502
冰醋酸（分析纯） 上海试一化学试剂有限公司 070127
甲酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 T20110822
磷酸（分析纯） 成都市科隆化学品有限公司 2017051601
绿原酸 中国食品药品检定研究院 110753-201716
木犀草苷 中国食品药品检定研究院 111720-201609
乙腈（色谱纯） TEDIA Company美国天地有限公司 AS1122-801
甲醇（色谱纯） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司
超纯水 四川优普超纯科技有限公司
1.3仪器
所用仪器设备见表3。
表3实验仪器
仪器名称 厂家 型号
电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 SQP
高速粉碎机 山东省青州市益康中药机械有限公司 YK-2000A
超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 KQ5200B
高效液相色谱仪 美国沃特世 ALLiancee2695
UV检测器 美国沃特世 Waters 2489
数显恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司 XMTD-7000
高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂 TGL-16G
循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 SHB-Ⅲ
优普系列超纯水器 四川优普超纯科技有限公司 UPC-ⅠⅠ-10T
2色谱条件考察
2.1色谱柱考察
不同的色谱柱对分离效果有较大的差别，高效液相色谱法中应用的色谱柱较多，选择ULtimateXB-C8[4.6×250mm,5μm]、Xpeonyx C18[4.6×250mm，5μm]、VenusiL XBP C18[4.6×250mm，5μm] 三种不同的色谱柱进行考察，比较不同厂家的色谱柱对成分的信息和分离效果，结果表明，型号为ULtimate XB-C8 [4.6×250mm,5μm]色谱柱所得到的整体峰形均匀，峰信息多，且分离效果好，因此采用ULtimate XB-C8[4.6×250mm,5μm]为最佳色谱柱。见图1。
2.2流动相的考察
不同的流动相系统能直接影响了样品在色谱柱的分离效果，为了筛选出最适宜的流动相系统，选择甲醇-酸水、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-酸水为流动相进行试验，结果表明：
甲醇-0.1%甲酸整体分离效果较好，提供较全面的样品成分，所以优选甲醇-0.1%甲酸为流动相系统。见图2。
2.3柱温的考察
温度在色谱柱中对样品成分的保留时间和分离效果有一定的影响，选择25℃、30℃、35℃三种不同的温度考察不同柱温度在检测器的吸收及分离效果，结果表明，柱温25℃的出峰时间较适宜，且分离效果较好，而柱温30℃、35℃的出峰时间较快，但峰推挤在一起，分离效果较低，因为柱压随柱温的升高而增加，基于保护色谱柱和仪器方面考虑，所以优选25℃为检测柱温。见图3。
2.4流速的考察
流速是影响样品出峰的重要参数，为了得到最优的流速，选择0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min三种种不同的流速考察不同流速对色谱峰的分离效果，结果表明，流速为0.8mL/min出峰完全，分离效果良好，随着流速的增加出峰时间提前，分离度降低，且柱压增加，所以优选流速为0.8mL/min进行检测。见图4。
2.5检测波长的考察
检测波长能让样品较全面显示出更多的峰信息，因此波长的选择对指纹图谱研究有着重要的影响，为了得到最佳的检测波长，对明日叶进行了190nm～400nm的全波长扫描，见图5，进而考察6种不同的检测波长，结果表明，波长会影响基线的变化及色谱峰的吸收，检测波长270nm的色谱峰成分多，基线也较为平稳，而检测波长240nm、290nm、300nm、320nm、340nm的色谱峰成分较少，故确定270nm为最佳的检测波长。见图6。
2.6洗脱梯度的考察
洗脱梯度对样品的出峰时间及分离效果有较大的影响，选择5种不同的洗脱梯度，比较明日叶样品在不同梯度的分离效果，见表4至表9：
表4明日叶的洗脱梯度1
时间 甲醇比例% 0.1%甲酸比例%
0 5 95
20 40 60
40 48 52
45 5 95
表5明日叶的洗脱梯度2
时间 甲醇比例% 0.1%甲酸比例%
0 25 75
20 48 52
40 70 30
45 25 75
表6明日叶的洗脱梯度3
时间 甲醇比例% 0.1%甲酸比例%
0 27 73
15 46 54
20 48 52
25 53 47
35 80 20
45 100 0
50 27 73
表7明日叶的洗脱梯度4
时间 甲醇比例% 0.1%甲酸比例%
0 10 90
20 46 54
24 35 65
30 40 60
35 10 90
表8明日叶的洗脱梯度5
时间 甲醇比例% 0.1%甲酸比例%
0 20 80
20 40 60
30 45 55
35 20 80
表9明日叶的洗脱梯度6
时间 甲醇比例% 0.1%甲酸比例%
0 5 95
20 36 64
40 48 52
45 5 95
结果表明，洗脱梯度1的色谱图基线平稳，色谱峰较多且峰形均匀，分离度高，随着甲醇浓度洗脱的梯度增加，样品洗脱的成分减小，分离效果差，因此采用洗脱梯度1进行明日叶的指纹图谱研究。见图7。
2.7最佳的色谱条件
综上色谱条件考察的结果可得，最佳色谱条件如表10所示。
表10明日叶的最佳色谱条件
项目 数值
色谱柱ULtimate XB-C<sub>8</sub> 4.6mm×250mm,5μm
柱温 25℃
检测波长 270nm
流速 0.8mL/min
流动相 甲醇-0.1%甲酸
进样量 10μL
3供试品溶液的制备
3.1供试品溶液提取方法考察
比较冷浸、超声、加热回流三种提取法的提取效果，分别按表10的色谱条件洗脱，结果表明冷浸法的峰面积偏低，超声提取法和加热回流提取法的整体差异不大，但超声提取较为简易且不需要加热，避免了长时间加热可能对有效成分的稳定性有影响，故优选超声提取法制备供试品溶液。见图8。
3.2供试品溶液提取溶剂的考察
依次用乙酸乙酯、75%乙醇、95%乙醇、纯水四种溶剂比较提取溶剂对明日叶的提取效果，按表10的最佳色谱条件进行洗脱，结果表明，乙酸乙酯和纯水的提取得到峰信息少，峰面积也小，75%乙醇、95%乙醇提取得到的峰信息多，但75%乙醇提取的峰面积更大且较均匀，故选用75%乙醇作为最佳提取溶剂。见图9。
3.3供试品溶液提取时间的考察
比较提取时间为15、30、45及60min对明日叶的提取效果，按表10的最佳色谱条件进行洗脱，结果表明，随着提取时间的增加峰面积有所增加，但提取时间30min后增加的幅度较小，故采用提取时间30min作为最佳提取时间。见图10。
3.4供试品溶液提取溶剂加入量的考察
分别比较提取时间为20mL、30mL、40mL对明日叶的提取效果，按表10的最佳色谱条件进行洗脱，结果表明，随提取溶剂加入量的增大峰面积增大，30mL与40mL峰面积差异不大，为节省溶剂，故采用溶剂加入量为30mL作为最佳加入量。见图11。
4供试品溶液的制备
称取明日叶粉末0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加入30mL的75%乙醇超声30min，过滤于5℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容到2mL的容量瓶，以离心速度13000rpm/min，离心10min，取上清液，即得供试品溶液。
5对照品溶液的制备
分别称取绿原酸对照品、木犀草苷对照品3mg，精密称定，分别加入甲醇溶解，定容至5mL的容量瓶，即分别得到绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液；再分别精密吸取1300μL绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液500μL，摇匀即得混合对照品溶液。按表10的最佳色谱条件进行洗脱，得到混合对照品色谱图，见图12。
6空白试验与延长试验
6.1空白试验
为了检测流动相对样品分析可能存在其他物质的干扰，精密吸取甲醇10μL，注入高效液相色谱仪，按表10的最佳色谱条件进行洗脱，结果表明流动相中几乎不存在其他杂质的干扰样品分析。明日叶空白试验色谱图见图13。
6.2延长试验
取明日叶供试品溶液，按表10的最佳色谱条件进行洗脱，将明日叶供试品溶液洗脱时间延长至120min，结果表明，在35min内，所有峰均可被完全洗脱出，明日叶供试品溶液35min后无色谱峰，故分析时间确定为35min。见图14。
7方法学考察
7.1参照峰选择
明日叶指认出绿原酸和木犀草苷的特征峰，结果表明，明日叶中绿原酸（5号峰）的峰面积高，分离度适宜，因此明日叶选择绿原酸作为参照峰，绿原酸在明日叶样品色谱图为5号峰。见图15。
7.2精密度试验
取同一份供试品溶液，按表10的色谱条件洗脱，连续进样6次，每次进样10μL，记录图谱，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果显示明日叶的共有峰相对保留时间RSD＜0.76%，相对峰面积RSD＜2.77%，表明仪器精密度良好。精密度结果见表11和表12。
表11明日叶指纹图谱精密度试验共有峰相对保留时间（n=6）
共有峰编号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD（%）
1 0.2096 0.2097 0.2092 0.2094 0.2094 0.2099 0.2095 0.12%
2 0.2244 0.2254 0.2240 0.2243 0.2242 0.2242 0.2244 0.22%
3 0.4103 0.4098 0.4102 0.4099 0.4102 0.4133 0.4106 0.32%
4 0.8491 0.8474 0.8470 0.8470 0.8476 0.8632 0.8502 0.75%
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00%
6 1.1391 1.1392 1.1385 1.1387 1.1386 1.1381 1.1387 0.04%
7 1.2010 1.2011 1.2002 1.2003 1.2003 1.2000 1.2005 0.04%
8 1.2211 1.2213 1.2206 1.2208 1.2208 1.2206 1.2209 0.02%
9 1.3107 1.3110 1.3095 1.3098 1.3098 1.3091 1.3100 0.05%
10 1.4760 1.4761 1.4744 1.4742 1.4737 1.4762 1.4751 0.08%
11 1.5052 1.5053 1.5035 1.5032 1.5028 1.5060 1.5043 0.09%
12 1.5359 1.5356 1.5326 1.5322 1.5316 1.5345 1.5337 0.12%
13 1.5575 1.5572 1.5541 1.5537 1.5530 1.5557 1.5552 0.12%
14 1.6620 1.6616 1.6575 1.6569 1.6559 1.6595 1.6589 0.15%
表12明日叶指纹图谱精密度试验共有峰相对峰面积（n=6）
共有峰编号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
1 0.0363 0.0359 0.0350 0.0359 0.0356 0.0359 0.0358 1.27%
2 0.0924 0.0913 0.0900 0.0907 0.0897 0.0917 0.0910 1.13%
3 0.1310 0.1312 0.1270 0.1272 0.1272 0.1316 0.1292 1.75%
4 0.2640 0.2627 0.2614 0.2589 0.2613 0.2654 0.2623 0.88%
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00%
6 0.0690 0.0688 0.0688 0.0685 0.0688 0.0721 0.0693 1.98%
7 0.0400 0.0399 0.0401 0.0393 0.0393 0.0396 0.0397 0.89%
8 0.0933 0.0935 0.0959 0.0964 0.0962 0.0945 0.0950 1.44%
9 0.0277 0.0291 0.0299 0.0290 0.0290 0.0290 0.0290 2.50%
10 0.7053 0.7070 0.6689 0.6674 0.6670 0.6808 0.6828 2.76%
11 1.0428 1.0499 1.0469 1.0476 1.0467 1.0324 1.0444 0.60%
12 0.8288 0.8253 0.8159 0.8086 0.8098 0.7989 0.8146 1.37%
13 0.3509 0.3523 0.3452 0.3494 0.3461 0.3295 0.3456 2.41%
14 0.0759 0.0735 0.0760 0.0774 0.0742 0.0725 0.0749 2.43%
7.3重复性试验
取同一份供试品溶液，按表10的色谱条件洗脱，连续进样6次，每次进样10μL，记录图谱，结果显示明日叶的共有峰相对保留时间RSD＜0.35%，峰面积RSD＜2.95%，说明该方法重复性良好。重复性结果见表13和表14。
表13明日叶指纹图谱重复性试验共有峰相对保留时间（n=6）
共有峰编号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD（%）
1 0.2096 0.2097 0.2097 0.2097 0.2097 0.2097 0.2097 0.03
2 0.2247 0.2241 0.2240 0.2230 0.2230 0.2229 0.2236 0.34
3 0.4101 0.4102 0.4101 0.4101 0.4101 0.4101 0.4101 0.01
4 0.8487 0.8490 0.8502 0.8511 0.8511 0.8535 0.8506 0.21
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
6 1.1385 1.1384 1.1385 1.1385 1.1385 1.1385 1.1385 0.00
7 1.2003 1.2001 1.2002 1.2004 1.2004 1.2003 1.2003 0.01
8 1.2207 1.2205 1.2208 1.2209 1.2209 1.2208 1.2208 0.01
9 1.3097 1.3095 1.3097 1.3098 1.3098 1.3096 1.3097 0.01
10 1.4735 1.4733 1.4734 1.4727 1.4727 1.4720 1.4730 0.04
11 1.5025 1.5023 1.5026 1.5018 1.5018 1.5010 1.5020 0.04
12 1.5310 1.5307 1.5310 1.5304 1.5304 1.5297 1.5305 0.03
13 1.5523 1.5519 1.5521 1.5517 1.5517 1.5509 1.5518 0.03
14 1.6550 1.6547 1.6547 1.6543 1.6543 1.6532 1.6544 0.04
表14明日叶指纹图谱重复性试验共有峰相对峰面积（n=6）
共有峰编号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
1 0.0383 0.0386 0.0375 0.0373 0.0373 0.0377 0.0378 1.42
2 0.0963 0.0959 0.0897 0.0917 0.0917 0.0928 0.0930 2.80
3 0.1340 0.1367 0.1267 0.1318 0.1318 0.1336 0.1324 2.52
4 0.2737 0.2709 0.2623 0.2605 0.2605 0.2717 0.2666 2.30
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
6 0.0692 0.0694 0.0690 0.0699 0.0699 0.0667 0.0690 1.73
7 0.0397 0.0406 0.0392 0.0411 0.0411 0.0424 0.0407 2.82
8 0.0982 0.0981 0.0971 0.0974 0.0974 0.1000 0.0980 1.07
9 0.0293 0.0306 0.0286 0.0285 0.0285 0.0298 0.0292 2.94
10 0.6825 0.6776 0.6730 0.6805 0.6805 0.7053 0.6832 1.66
11 1.0876 1.0730 1.0619 1.0774 1.0774 1.1156 1.0822 1.70
12 0.8264 0.8327 0.8121 0.8242 0.8242 0.8500 0.8283 1.52
13 0.3531 0.3545 0.3453 0.3466 0.3466 0.3645 0.3518 2.07
14 0.0885 0.0910 0.0861 0.0852 0.0852 0.0876 0.0873 2.60
7.4稳定性试验
取同一份供试品溶液，按表10的色谱条件洗脱，连续进样6次，每次进样10μL，记录图谱，结果显示明日叶的共有峰相对保留时间RSD＜0.49%，峰面积RSD＜2.92%，说明样品在24h内稳定。稳定性结果见表15和表16。
表15明日叶指纹图谱稳定性试验共有峰相对保留时间（n=6）
共有峰编号 0h 2h 4h 8h 12h 24h 平均值 RSD（%）
1 0.2106 0.2114 0.2108 0.2106 0.2107 0.2109 0.2108 0.14
2 0.2244 0.2252 0.2249 0.2248 0.2252 0.2247 0.2248 0.14
3 0.4181 0.4168 0.4198 0.4194 0.4192 0.4206 0.4190 0.33
4 0.8735 0.8815 0.8755 0.8755 0.8763 0.8846 0.8778 0.48
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
6 1.1378 1.1390 1.1376 1.1376 1.1376 1.1376 1.1379 0.05
7 1.1999 1.2016 1.1997 1.1997 1.1998 1.1998 1.2001 0.06
8 1.2204 1.2222 1.2201 1.2202 1.2203 1.2203 1.2206 0.07
9 1.3086 1.3109 1.3082 1.3081 1.3081 1.3081 1.3087 0.09
10 1.4765 1.4792 1.4765 1.4760 1.4763 1.4774 1.4770 0.08
11 1.5050 1.5080 1.5053 1.5048 1.5051 1.5065 1.5058 0.08
12 1.5341 1.5375 1.5341 1.5335 1.5336 1.5350 1.5346 0.10
13 1.5558 1.5591 1.5558 1.5551 1.5552 1.5565 1.5562 0.10
14 1.6591 1.6626 1.6593 1.6583 1.6585 1.6600 1.6596 0.10
表16明日叶指纹图谱稳定性试验共有峰相对峰面积（n=6）
共有峰编号 0h 2h 4h 8h 12h 24h 平均值 RSD（%）
1 0.0388 0.0390 0.0380 0.0382 0.0385 0.0382 0.0385 1.03
2 0.1004 0.0979 0.0986 0.1011 0.0977 0.0930 0.0981 2.91
3 0.1370 0.1419 0.1371 0.1344 0.1362 0.1375 0.1373 1.80
4 0.2474 0.2532 0.2465 0.2462 0.2448 0.2465 0.2474 1.20
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
6 0.0810 0.0821 0.0801 0.0787 0.0771 0.0766 0.0793 2.74
7 0.0511 0.0526 0.0539 0.0542 0.0517 0.0537 0.0529 2.42
8 0.1035 0.1051 0.1045 0.1030 0.1011 0.1029 0.1033 1.36
9 0.0562 0.0586 0.0556 0.0558 0.0553 0.0542 0.0560 2.62
10 0.6550 0.6561 0.6539 0.6594 0.6549 0.6576 0.6562 0.31
11 0.9940 1.0067 1.0015 1.0041 1.0060 1.0011 1.0022 0.46
12 0.7701 0.7596 0.7628 0.7650 0.7550 0.7566 0.7615 0.74
13 0.3343 0.3377 0.3485 0.3545 0.3355 0.3329 0.3406 2.59
14 0.0838 0.0838 0.0879 0.0885 0.0826 0.0844 0.0852 2.85
8明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立
8.1 十批明日叶指纹图谱
十批不同地区的明日叶按上述供试品溶液的制备方法制备，然后精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪中，按表10的色谱条件洗脱，记录十批明日叶的HLPC色谱图，依据所得的十批明日叶的HLPC色谱图，制定标准指纹图谱。十批明日叶的HLPC色谱图见图16至图25，十批明日叶的色谱叠加图见图26。
8.2对照指纹图谱与共有峰的确定
借助《中药色谱图指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，对照指纹图谱通过平均数法生成，将百色田阳采集的明日叶的HPLC色谱图定为参照图谱，提取明日叶的共有模式生成对照图谱，对照图谱见图27。共标定了14个峰，并以5号峰作为参照峰，计算出共有峰保留时间、峰面积及共有峰相对保留时间、共有峰峰面积，结果见表17-表20。
表17 十批明日叶指纹图谱共有峰保留时间
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 3.981 4.022 4.019 4.02 4.022 4.02 4.018 4.02 4.017 4.023
2 4.257 4.287 4.289 4.284 4.287 4.293 4.291 4.286 4.29 4.293
3 7.856 8.01 7.994 7.989 7.988 7.997 7.996 7.99 7.988 8.035
4 16.946 16.951 16.914 16.9 16.903 16.922 16.923 16.92 16.907 16.998
5 18.945 19.021 19.012 19.009 19.013 19.028 19.028 19.022 19.019 19.041
6 21.577 21.647 21.64 21.636 21.632 21.641 21.641 21.633 21.63 21.628
7 22.77 22.839 22.833 22.83 22.827 22.843 22.843 22.835 22.833 22.827
8 23.163 23.229 23.222 23.219 23.216 23.224 23.226 23.218 23.215 23.212
9 25.098 24.906 24.899 24.891 24.886 24.89 24.891 24.883 24.88 24.871
10 28.263 28.12 28.108 28.111 28.116 28.139 28.145 28.14 28.125 28.138
11 28.821 28.665 28.653 28.656 28.663 28.697 28.705 28.7 28.685 28.72
12 29.41 29.231 29.223 29.223 29.221 29.234 29.24 29.23 29.224 29.256
13 29.823 29.647 29.641 29.637 29.632 29.639 29.643 29.632 29.628 29.639
14 31.824 31.624 31.618 31.61 31.602 31.611 31.612 31.6 31.598 31.593
表18 十批明日叶指纹图谱共有峰峰面积
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 371.1 525.6 567.6 529.9 442.7 202.4 175.2 157.3 228.4 740.5
2 996.7 1311.6 1399.3 1306.6 1131.9 2500.8 2290.2 2107.1 2532.5 5941.5
3 1953.4 1715.1 1834.9 1744.5 1516.5 4812.6 4411.1 4118.2 4942.4 2567.7
4 2679.0 3261.1 3516.7 3271.4 2914.2 2227.5 2070.2 1923.8 2278.3 793.8
5 10216.9 13178.1 14178.5 13328.6 11227.9 7832.7 6919.6 6363.3 7812.3 1605.5
6 690.7 1153.2 1258.9 1142.7 947.5 513.4 470.5 375.7 485.5 559.5
7 416.6 669.1 730.5 678.1 573.7 325.3 311.6 245.4 340.0 639.4
8 942.6 1371.9 1525.3 1406.3 1197.1 654.0 608.5 491.4 655.6 569.5
9 358.3 747.4 838.9 778.9 668.0 444.6 412.3 212.2 412.8 273.7
10 7015.8 8795.0 9541.6 8960.2 7696.6 6090.2 5566.6 5042.7 6229.7 5243.0
11 11060.3 13451.1 14503.6 13671.1 11935.5 7974.9 7271.0 6701.6 8185.0 3631.2
12 8351.6 10093.9 10950.0 10298.5 8985.6 8312.1 7569.7 7026.1 8428.9 1252.4
13 3615.1 4561.9 5032.1 4654.5 4020.4 3834.8 3531.0 3201.3 3926.8 1258.4
14 767.6 1175.1 1343.3 1234.2 1114.0 818.6 704.2 637.0 767.0 474.7
表19 十批明日叶指纹图谱共有峰相对保留时间
共有峰编号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD（%）
1 0.210 0.211 0.211 0.211 0.212 0.211 0.211 0.211
2 0.225 0.225 0.226 0.225 0.225 0.226 0.226 0.225
3 0.415 0.421 0.420 0.420 0.420 0.420 0.420 0.420
4 0.894 0.891 0.890 0.889 0.889 0.889 0.889 0.889
5 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 1.139 1.138 1.138 1.138 1.138 1.137 1.137 1.137
7 1.202 1.201 1.201 1.201 1.201 1.200 1.200 1.200
8 1.223 1.221 1.221 1.221 1.221 1.221 1.221 1.221
9 1.325 1.309 1.310 1.309 1.309 1.308 1.308 1.308
10 1.492 1.478 1.478 1.479 1.479 1.479 1.479 1.479
11 1.521 1.507 1.507 1.507 1.508 1.508 1.509 1.509
12 1.552 1.537 1.537 1.537 1.537 1.536 1.537 1.537
13 1.574 1.559 1.559 1.559 1.559 1.558 1.558 1.558
14 1.680 1.663 1.663 1.663 1.662 1.661 1.661 1.661
表20 十批明日叶指纹图谱共有峰相对峰面积
共有峰编号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD（%）
1 0.0363 0.0399 0.0400 0.0398 0.0394 0.0258 0.0253 0.0247
2 0.0976 0.0995 0.0987 0.0980 0.1008 0.3193 0.3310 0.3311
3 0.1912 0.1301 0.1294 0.1309 0.1351 0.6144 0.6375 0.6472
4 0.2622 0.2475 0.2480 0.2454 0.2595 0.2844 0.2992 0.3023
5 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000
6 0.0676 0.0875 0.0888 0.0857 0.0844 0.0655 0.0680 0.0590
7 0.0408 0.0508 0.0515 0.0509 0.0511 0.0415 0.0450 0.0386
8 0.0923 0.1041 0.1076 0.1055 0.1066 0.0835 0.0879 0.0772
9 0.0351 0.0567 0.0592 0.0584 0.0595 0.0568 0.0596 0.0333
10 0.6867 0.6674 0.6730 0.6723 0.6855 0.7775 0.8045 0.7925
11 1.0825 1.0207 1.0229 1.0257 1.0630 1.0182 1.0508 1.0532
12 0.8174 0.7660 0.7723 0.7727 0.8003 1.0612 1.0940 1.1041
13 0.3538 0.3462 0.3549 0.3492 0.3581 0.4896 0.5103 0.5031
14 0.0751 0.0892 0.0947 0.0926 0.0992 0.1045 0.1018 0.1001
8.3共有峰与非共有峰面积占比
十批明日叶样品的共有峰与非共有峰的面积占比见表21，结果显示十批明日叶样品的非共有峰面积占比在15.04%～48.05%之间。
表21 十批明日叶指纹图谱非共有峰面积占比
编号 非共有峰面积 总面积 非共有峰面积占比（%）
S1 8750.72 58186.64 15.04
S2 15895.88 77906.01 20.40
S3 18603.53 85824.84 21.68
S4 16428.67 79434.14 20.68
S5 14191.14 68562.59 20.70
S6 12925.76 59469.75 21.74
S7 12084.21 54396.11 22.22
S8 10578.34 49181.36 21.51
S9 13517.64 60742.81 22.25
S10 23632.04 49182.79 48.05
8.4明日叶药材相似度评价
借助《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，对十批明日叶样品进行相似度评价，相似度结果见表22，结果显示除S10结算结果小于0.9之外，其余均大于0.9，表明不同产地的明日叶化学成分类型基本一致，亦有不同程度的的差异，但S10与其余9批差异较大，不同生长环境与采收季节可能对明日叶的质量存在一定的影响。
表22 十批不同产地明日叶指纹图谱的相似度结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
S1 1 0.999 0.999 0.999 0.999 0.968 0.967 0.966 0.968 0.67
S2 0.999 1 1 1 1 0.961 0.959 0.958 0.96 0.666
S3 0.999 1 1 1 1 0.962 0.96 0.958 0.961 0.666
S4 0.999 1 1 1 1 0.962 0.96 0.958 0.961 0.666
S5 0.999 1 1 1 1 0.962 0.961 0.959 0.962 0.667
S6 0.968 0.961 0.962 0.962 0.962 1 1 1 1 0.745
S7 0.967 0.959 0.96 0.96 0.961 1 1 1 1 0.748
S8 0.966 0.958 0.958 0.958 0.959 1 1 1 1 0.745
S9 0.968 0.96 0.961 0.961 0.962 1 1 1 1 0.747
S10 0.67 0.666 0.666 0.666 0.667 0.745 0.748 0.745 0.747 1
对照图谱 0.995 0.992 0.992 0.992 0.993 0.987 0.986 0.985 0.987 0.727
9聚类分析与主成分分析
9.1聚类分析及主成分的数据提取
由上述十批图谱可得，共标定14个峰，提取14个共有峰面积作为模式识别的原始数据，峰面积见表23。
表23 十批不同产地明日叶指纹图谱共有峰峰面积
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 371.1 525.6 567.6 529.9 442.7 202.4 175.2 157.3 228.4 740.5
2 996.7 1311.6 1399.3 1306.6 1131.9 2500.8 2290.2 2107.1 2532.5 5941.5
3 1953.4 1715.1 1834.9 1744.5 1516.5 4812.6 4411.1 4118.2 4942.4 2567.7
4 2679.0 3261.1 3516.7 3271.4 2914.2 2227.5 2070.2 1923.8 2278.3 793.8
5 10216.9 13178.1 14178.5 13328.6 11227.9 7832.7 6919.6 6363.3 7812.3 1605.5
6 690.7 1153.2 1258.9 1142.7 947.5 513.4 470.5 375.7 485.5 559.5
7 416.6 669.1 730.5 678.1 573.7 325.3 311.6 245.4 340.0 639.4
8 942.6 1371.9 1525.3 1406.3 1197.1 654.0 608.5 491.4 655.6 569.5
9 358.3 747.4 838.9 778.9 668.0 444.6 412.3 212.2 412.8 273.7
10 7015.8 8795.0 9541.6 8960.2 7696.6 6090.2 5566.6 5042.7 6229.7 5243.0
11 11060.3 13451.1 14503.6 13671.1 11935.5 7974.9 7271.0 6701.6 8185.0 3631.2
12 8351.6 10093.9 10950.0 10298.5 8985.6 8312.1 7569.7 7026.1 8428.9 1252.4
13 3615.1 4561.9 5032.1 4654.5 4020.4 3834.8 3531.0 3201.3 3926.8 1258.4
14 767.6 1175.1 1343.3 1234.2 1114.0 818.6 704.2 637.0 767.0 474.7
9.2聚类分析结果
应用SPSS 21.0软件，采用组间均联法，选用夹角余弦为测度，对十批不同产地的明日叶的指纹图谱数据进行聚类分析，结果表明十批明日叶样品主要分为3类，南宁青秀区、南宁上林县、崇左大新县、北海合浦县、钦州灵山县为一类；百色田阳、柳州柳城县、桂林兴安县、桂林永福县为一类；河池天峨县为一类。见图28。
9.3主成分分析
采用SPSS 21.0软件对数据进行明日叶主成分分析，各项指标结果见表21和表22。结果表明，可提取两个主成分且累计贡献率达96.3%，可较全面的反映明日叶样品的化学成分的基本特征，如表24所示。表25旋转成份矩阵结果显示第一主成分主要影响样品质量的峰号为2、4、5、12、13号峰，其权重值分别为-0.942、0.950、0.928、0.998、0.985，第二成分主要影响的样品质量峰号为1、7号峰，其权重值分别为0.970和0.983。并对其主成分得分作图，结果表明主成分分析结果与聚类分析结果基本一致。结果见图29。
表24主成分特征值和贡献率
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
表25旋转成份矩阵
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
综上所述，本发明结合各系统适用性参数情况，并经方法学验证，该方法准确度高、重复性好，相似度评价有较好的一致性，主成分平面的得分图与聚类分析实验数据结果较为一致，可以较全面的反映样品的成分，能合理的评价不同产地的明日叶药材，可为全国各地明日叶的质量评价提供参考依据，为明日叶质量的规范化提供了可靠的实验依据，完善了明日叶HPLC指纹图谱的研究，保证明日叶指纹图谱的特征性和代表性。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备供试品溶液：称取明日叶样品制成供试品溶液，备用；
S2：制备对照品溶液：分别称取绿原酸对照品和木犀草苷对照品，分别制成绿原酸对照品溶液、木犀草苷对照品溶液和混合对照品溶液，备用；
S3：高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在高效液相色谱检测条件下进行分析，将得到的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到明日叶的指纹图谱；所述高效液相色谱检测条件如下：采用ULtimate XB-C8色谱柱；以流动相A为甲醇，流动相B为0.1～0.3%甲酸为流动相进行梯度洗脱，柱温25～35℃，流速0.8～1.2mL/min，检测波长190～400nm，分析时间35min，进样量10μL，洗脱梯度程序：0～20min时，流动相A:流动相B＝5:95～40:60；20～40min，流动相A:流动相B＝40:60～48:52；40～45min，流动相A:流动相B＝48:52～5:95；
S4：测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录45min色谱图，以绿原酸为指纹图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰，测定十批明日叶药材的指纹图谱，得到由其共有特征峰构成的明日叶药材的标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有特征峰有14个，其中5号峰为绿原酸。
2.根据权利要求1所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤S1中供试品溶液的制备包括以下步骤：称取明日叶粉末0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加入30～60mL的75%～95%乙醇超声15～60min，过滤于5℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容到2mL的容量瓶，以离心速度13000rpm/min，离心10min，取上清液，即得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤S2中对照品溶液的制备包括以下步骤：分别称取绿原酸对照品、木犀草苷对照品3mg，精密称定，分别加入甲醇溶解，定容至5mL的容量瓶，即分别得到绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液；再分别精密吸取1300μL绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液500μL，摇匀即得混合对照品溶液。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱柱为ULtimate XB-C8[4.6 mm×250 mm，5μm]色谱柱。
5.根据权利要求1-3任一所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸。
6.根据权利要求1-3任一所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述柱温为25℃，流速为0.8mL/min。
7.根据权利要求1-3任一所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述检测波长为270nm。
8.根据权利要求1-3任一所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述明日叶的指纹图谱有14个共有特征峰，编号分别为1～14，以5号峰绿原酸为对照峰；各共有特征峰的相对保留时间分别为：1号峰0.210～0.212，2号峰0.225～0.226，3号峰0.415～0.421，4号峰0.889～0.894，5号峰1.000，6号峰1.137～1.139，7号峰1.200～1.202，8号峰1.221～1.223，9号峰1.308～1.325，10号峰1.478～1.492，11号峰1.507～1.521，12号峰1.536～1.552，13号峰1.558～1.574，14号峰1.660～1.680；
各共有特征峰的相对峰面积的平均值分别为：1号峰0.0253，2号峰0.3310，3号峰0.6375，4号峰0.2992，5号峰1.0000，6号峰0.0680，7号峰0.0450，8号峰0.0879，9号峰0.0596，10号峰0.8045，11号峰1.0508，12号峰1.0940，13号峰0.5103，14号峰0.1018。
9.根据权利要求1-3任一所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于：采用SPSS 21.0软件对数据进行主成分分析，第一主成分主要影响明日叶样品质量的峰号为2、4、5、12、13号峰，其权重值分别为-0.942、0.950、0.928、0.998、0.985，第二成分主要影响的明日叶样品质量峰号为1、7号峰，其权重值分别为0.970和0.983。
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