CN116660433B - 一种徐长卿及其混淆品的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药材鉴别技术领域，具体涉及一种徐长卿及其混淆品的鉴别方法。该鉴别方法通过以下方法实现：首先制备对照品和供试品溶液，然后利用高效液相色谱法得到谱图后，根据谱图进行鉴别。本发明的鉴别和检查方法简单易操作，准确率高，特别是采用现行方法仍无法判别掺伪的徐长卿饮片，采用该方法，准确率达到100％，是一种适合推广使用的方法。
Description
技术领域
本发明属于药材鉴别技术领域，具体涉及一种徐长卿及其混淆品的鉴别方法。
背景技术
徐长卿为萝藦科植物徐长卿Cynanchum paniculatum(Bge.)Kitag.的干燥根和根茎，秋季采挖，除去杂质，阴干。徐长卿饮片的炮制方法为除去杂质，迅速洗净，切段，阴干。始载于《神农本草经》，列为上品，具有祛风，化湿，止痛，止痒的功效，用于风湿痹痛，胃痛胀满，牙痛，腰痛，跌扑伤痛，风疹、湿疹。目前市场上常有其他植物根及根茎冒充、掺伪使用。
市场上伪品的来源与正品徐长卿不同，掺在徐长卿中很难辨别，更甚者在徐长卿种植的过程中就存在伪品混种的问题。掺有伪品的徐长卿按照现行《中国药典》2020年版一部检验，性状、显微鉴别、丹皮酚薄层色谱鉴别和徐长卿对照药材鉴别所有检验项目均符合规定。检验项目专属性不强，使得符合标准的掺伪品在市场流通，严重影响了徐长卿的质量和疗效。
《现代中药研究及实践》2005年第3期刊载《徐长卿HPLC指纹图谱的初步研究》，《西南民族大学学报》2008年第6期刊载《徐长卿HPLC指纹图谱分析及丹皮酚含量测定》，未见学者报道正品与伪品或掺伪品的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的是针对徐长卿存在掺伪而检验方法专属性不强导致检验结果出现偏差的问题，克服现有质量控制技术的不足，提供一种准确度高且简便的方法来检查徐长卿药材及饮片的掺伪。本发明提供的徐长卿及其混淆品的鉴别方法，采用高效液相色谱法对徐长卿及其伪品的多个色谱峰进行测定，构建了徐长卿及其伪品的鉴别方法和徐长卿掺伪的检查方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种徐长卿及其混淆品的鉴别方法，通过高效液相色谱进行检测，谱图中，在21.361±5％min、39.904±5％min、48.915±5％min、52.408±5％min、54.705±5％min均未检测到色谱峰，待测样品为正品徐长卿；若图谱检出峰6色谱峰，在21.361±5％min、39.904±5％min、48.915±5％min、52.408±5％min、54.705±5％min均检测到5个色谱峰，且5个色谱峰的最大吸收波长应分别在238和327±2nm(峰1)、238和326±2nm(峰2)、258和284±2nm(峰3)、254和278和317±2nm(峰4)、281±2nm(峰5)范围内，则待测样品为伪品徐长卿或掺伪品徐长卿；当峰5和峰6峰面积比大于1时判定为伪品徐长卿，峰5和峰6峰面积比小于1时判定为掺伪品徐长卿。
本发明提供的鉴别方法，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，精密称定，得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取待测样品粉末，加甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，得供试品溶液；
(3)采用高效液相色谱法进行检测。
进一步的，步骤(1)中，所述对照品溶液的浓度为20μg/mL。
进一步的，步骤(2)中，所述供试品溶液具体的制备过程为：取待测样品粉末0.5g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解即可。
进一步的，步骤(3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为NouryonKromasil 100-5-C18，5μm，250mm×4.6mm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙睛，流动相B为0.1％的磷酸溶液，进行梯度洗脱，流速为1.0ml·
min-1，柱温35℃，DAD检测器，波长为190～500nm，进样量为5μl，测定波长为280nm。
进一步的，所述梯度洗脱为：梯度为0～10min，10％ A；10～20min，10％ A→15％A；20～50min，15％ A→30％ A；50～70min，30％ A→65％ A。
谱图中，所述峰1为6′-芥子酰蔗糖；所述峰2为6,6′-二芥子酰蔗糖；所述峰6为丹皮酚
本发明的有益效果：本发明的鉴别和检查方法简单易操作，准确率高，特别是采用《中国药典》规定的检验项目和方法仍无法判别掺伪的徐长卿饮片，采用该方法，准确率达到100％，是一种适合推广使用的方法。
附图说明
图1丹皮酚对照-280nm色谱图；
图2丹皮酚对照的光谱图；
图3正品徐长卿-280nm色谱图(编号X01)；
图4正品徐长卿主要色谱峰对应的光谱图(编号X01)；
图5准确性测试中编号X06的伪品徐长卿-280nm色谱图(编号X06)；
图6准确性测试中编号X06的伪品徐长卿六个色谱峰相对应的光谱图(编号X06)；
图7准确性测试中编号X10的掺伪品徐长卿-280nm色谱图(编号X10)；
图8准确性测试中编号X10的掺伪品徐长卿六个色谱峰相对应的光谱图(编号X10)；
图9对比例1中X8和X12的HPLC色谱图比较(伪品和掺伪品无法精准区分)；
图10对比例2中X2和X11的HPLC色谱图(正品和掺伪品无法精准区分)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
1.仪器与试药
仪器：waters 2695高效液相色谱仪(厂家：美国沃特世公司)；Sartorius CP225D电子天平(厂家：赛多利斯有限公司)。
试药：徐长卿对照药材，批号：121514 -201202；购自中国食品药品检定研究院。伪品和掺伪品徐长卿饮片来自市场抽取样品。乙腈、甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。
实施例1
1.1溶液的制备
1.1.1对照品溶液的制备
取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解制成20μg/mL的对照品溶液。其液相色谱图见图1，DAD吸收光谱图见图2。
1.1.2对照药材溶液的制备：取徐长卿对照药材粉末0.5g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。供试品溶液的色谱图见图3，其相关色谱峰的DAD吸收光谱见图4。
1.1.3伪品或掺伪品徐长卿溶液的制备：取伪品或掺伪品徐长卿饮片粉末0.5g，按照徐长卿对照药材溶液的制备方法，制得伪品或掺伪品徐长卿溶液。
伪品的HPLC色谱图和六个色谱峰的DAD吸收光谱图见图5和图6；掺伪品的HPLC色谱图和六个色谱峰的DAD吸收光谱图见图7和图8。
1.2色谱条件与系统适用性
色谱柱为Nouryon Kromasil 100-5-C18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙睛，流动相B为0.1％的磷酸溶液，进行梯度洗脱，梯度为0～10min，10％ A；10～20min，10％ A→15％ A；20～50min，15％A→30％ A；50～70min，30％A→65％ A，流速为1.0ml·min-1，柱温35℃，DAD检测器(波长为190～400nm)，进样量为5μl。
1.3测定波长的选择
取上述徐长卿对照药材溶液、徐长卿伪品溶液和徐长卿掺伪品溶液，分别进样5μl，记录相关图谱。经综合分析徐长卿样品、徐长卿伪品和徐长卿掺伪品的液相色谱图在280nm可以获得较丰富的信息，因此选择280nm作为测定波长。
该色谱条件下徐长卿药材及饮片呈现丹皮酚的色谱峰；而徐长卿伪品呈现包括丹皮酚在内的6个主要色谱峰，且峰5和峰6峰面积比(A5/A6)大于1；徐长卿掺伪品呈现包括丹皮酚在内的6个主要色谱峰，且峰5和峰6峰面积比(A5/A6)小于1；各色谱峰的保留时间和峰面积可能因实验条件差异而略有差异，但均应呈现6个主要色谱峰，见图5和图7。该试验中的徐长卿伪品尤其是掺伪品均符合徐长卿质量标准规定，但是采用上述检测方法可以很好的区分，说明该方法针对伪品和掺伪品有较好的鉴别作用。
1.4样品测定
为了考察方法的准确性，选择符合《中国药典》2020年版徐长卿药材和饮片的标准规定的13批样品，其中有正品、伪品和掺伪品。按照上述方法进行伪品鉴别和掺伪品检查，结果有4批样品被准确鉴别为伪品，4批样品被准确检查为掺伪品。
表1 13批样品的鉴别结果
对比例1
2.1伪品或掺伪品溶液的制备方法
取伪品或掺伪品徐长卿饮片粉末1.0g，加乙醇25ml，60℃水浴加热搅拌提取1.5h，倾出溶液并加少量乙醇洗涤残渣，合并滤液，用0.45μm滤膜过滤后，定容至50ml量瓶中，作为供试品溶液。
2.2色谱条件
色谱柱为Nouryon Kromasil 100-5-C18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相A为乙睛，流动相B为0.1％的磷酸溶液，进行梯度洗脱，梯度为0～10min，10％ A；10～20min，10％ A→15％ A；20～50min，15％ A→30％ A；50～70min，30％ A→65％A，流速为1.0ml·min-1，柱温35℃，检测波长280nm，进样量为5μl。
2.3样品测定
该色谱条件下徐长卿伪品和掺伪品均呈现包括丹皮酚在内的6个主要色谱峰，且峰5和峰6峰面积比(A5/A6)均小于1，无法做到精准地将伪品与掺伪品区分开来。见图9。
对比例2
3.1对照药材的制备方法
称取徐长卿样品粉末1.0g，加1mol/L的盐酸甲醇溶液5ml浸泡2h，加氯仿-甲醇(1：1)振摇提取，过滤，滤液置蒸发皿中挥干，残渣加甲醇定容至5ml量瓶中，过0.45μm滤膜后，作为供试品溶液。
3.2掺伪品溶液的制备方法
取掺伪品徐长卿饮片粉末1.0g，同徐长卿制备方法制成掺伪品样品溶液。
3.3色谱条件
色谱柱为Nouryon Kromasil 100-5-C18(5μm，250mm×4.6mm)，流动相A为乙睛，流动相B为水，进行梯度洗脱，梯度为0～10min，2％ A；10～45min，2％A→60％ A；45～50min，60％ A，流速为1.0ml·min-1，检测波长220nm，进样量为5μl。
3.4样品测定
在该色谱条件下无法将徐长卿正品与掺伪品做到精准区分。见图10。
Claims (3)
1.一种徐长卿及其混淆品的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，精密称定，得对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取待测样品粉末，加甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，得供试品溶液；
（3）采用高效液相色谱法进行检测；
通过高效液相色谱进行检测时，谱图中，在21.361±5%min、39.904±5% min、48.915±5% min、52.408±5% min、54.705±5% min均未检测到色谱峰，且仅检测到峰6色谱峰，则待测样品为正品徐长卿；若图谱中检出峰6色谱峰，同时检测出5个色谱峰，所述色谱峰为峰1-峰5，所述峰1-峰5的保留时间依次为：21.361±5% min、39.904±5% min、48.915±5% min、52.408±5% min、54.705±5% min，且5个色谱峰中，峰1-峰5的最大吸收波长应分别在238和327±2nm、238和326±2nm、258和284±2nm、254和278和317±2nm、281±2nm，则待测样品为伪品徐长卿或掺伪品徐长卿；当峰5和峰6峰面积比大于1时判定为伪品徐长卿，峰5和峰6峰面积比小于1时判定为掺伪品徐长卿；
所述峰1为6´-芥子酰蔗糖；峰2为6, 6´-二芥子酰蔗糖；所述峰6为丹皮酚；
步骤（3）中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为Nouryon Kromasil 100-5-C18，5μm，250mm×4.6mm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙睛，流动相B为0.1%的磷酸溶液，进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温35℃，DAD检测器，进样量为5μL，测定波长为280nm；
所述梯度洗脱为：梯度为0～10 min，10% A；10～20min，10% A→15% A；20～50min，15%A→30% A；50～70min，30% A→65% A。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中，所述对照品溶液的浓度为20μg/mL。
3.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，步骤（2）中，所述供试品溶液具体的制备过程为：取待测样品粉末0.5g，加甲醇50mL，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解即可。
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