CN102028760A - 一种杠板归药材的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杠板归药材的质量检测方法，包括下述步骤：供试品溶液的制备；对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.600mg的溶液。取香草酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.908mg的溶液；含量测定，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。本发明的方法准确度高、技术先进、操作快速简便，能使药材质量得到更有效的控制。

Description

一种杠板归药材的质量检测方法

技术领域

本发明属中药质量检测领域，具体来说涉及杠板归药材的质量检测方法。

背景技术

杠板归为蓼科植物杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分。夏季开花时采割，晒干。其炮制方法为：除去杂质，略洗，切断，干燥。性状：本品茎略呈方柱形，有棱角，多分枝，直径可达0.2cm；表面紫红色或者紫棕色，棱角上有倒生钩刺，节略膨大，节间长2～6cm，断面纤维性，黄白色，有髓或中空。叶互生，有长柄，盾状着生；叶片多皱缩，展平后呈近等边三角形，灰绿色至红棕色，下表面叶脉和叶柄均有倒生钩刺；托叶鞘包于茎节上或脱落。气微，茎味淡，叶味酸。

鉴别如下：

①本品茎横切面：表皮为一列细胞。皮层薄，为3-5列细胞。中柱鞘纤维束连续成环，细胞壁厚，木化。韧皮部老茎具韧皮纤维，壁厚，木厚。形成层明显。木质部导管大，单个或3-5个成群。髓部细胞大，有时成空腔。老茎在皮层、韧皮部、射线及髓部可见多数草酸钙簇晶，嫩茎则少见或无。老茎的表皮和皮层细胞含红棕色物。

叶表面观：上表皮细胞不规则多角形，垂周壁近平直或微弯曲。下表皮细胞垂周壁波状弯曲；气孔不等式。主脉和叶缘疏生由多列斜方形或长方形细胞组成的钩状刺。叶肉细胞含草酸钙簇晶，直径17-62μm。

②取本品粉末2g，加石油醚(60-90℃)50ml，超声处理。30分钟，滤过，弃去石油醚，药渣挥干溶剂，加热水25ml，置80℃水浴上热浸30分钟，不时振摇，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸一滴，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取咖啡酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液510μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上吗，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查：水分不得过13.0％(《中国药典》一部附录IX H第一法)。

总灰分不得过10.0％(《中国药典》一部附录IX K)

浸出物：照水溶性浸出物测定法(附录X A)项下的热浸法测定，不得少于15.0％。

杠板归作为一个药材，目前的研究表明，其主要药效杀菌抗病毒的物质基础是药材中含有的各种有机酸，含量亦较高。而现有的杠板归药材及其制剂的质量检测方法主要是采用高效液相色谱法测定槲皮素含量，由此可见测定槲皮素的含量对于一种衡量杠板归药材的质量的方法来说是存在很大的不足的，因为槲皮素并不是有机酸，也没有很强的的杀菌抗病毒作用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种准确度高、技术先进、操作快速简便，能使药材质量得到更有效的控制杠板归药材的质量检测方法。

本发明的一种杠板归药材的质量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取药材适量，粉碎，过3号筛，称取2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，放置3小时，超声处理1小时，摇匀，滤过，残渣用甲醇洗至无色，蒸干，用0.5moL·L-1氢氧化钠溶液30mL分3次溶解，转入锥形瓶中，50～60℃水浴回流2小时，放冷，移入分液漏斗中，用5mL水洗涤锥形瓶，洗涤液并入分液漏斗，用盐酸调pH＝2，用乙醚萃取4次，每次20mL，合并乙醚液，在50～60℃水浴蒸干，用甲酸-甲醇(5∶95)溶液溶解定容至10mL，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.600mg的溶液。取香草酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.908mg的溶液；

(3)含量测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定；

(4)色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：1.0％甲酸-甲醇(40∶60)，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，检测波长：290nm

上述的杠板归药材的质量检测方法，其中：阿魏酸含量不得低于0.06％(以干燥品计)，香草酸含量不得低于0.015％(以干燥品计)。

上述的杠板归药材的质量检测方法，其中：杠板归药材是杠板归药材及各种以杠板归药材为原料的各种剂型。

本发明的方法与现有技术相比，主要优越性如下：本根据“中药新药研究的技术要求”，试验采用了专属性强、灵敏度高的高效液相色谱法测定杠板归药材中所含阿魏酸、香草酸的含量，阿魏酸和香草酸与其他组份分离度、重现性、精密度、回收率都较好，故确定本发明的杠板归药材的质量检测方法采用高效液相色谱法测定杠板归药材中阿魏酸和香草酸的含量。本方法能够得到较好的检测结果，采用两个成分同时测定的方法又可以节省时间，提高效率，因此，本发明的方法准确度和灵敏度均较高、技术先进、操作快速简便，能使杠板归药材质量得到更有效的控制。

具体实施方式

以下通过杠板归药材的实施例和试验例来进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

杠板归药材的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取药材适量，粉碎，过3号筛，称取2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，放置3小时，超声处理1小时，摇匀，滤过，残渣用甲醇洗至无色，蒸干，用0.5moL·L^-1氢氧化钠溶液30mL分3次溶解，转入锥形瓶中，50～60℃水浴回流2小时，放冷，移入分液漏斗中，用5mL水洗涤锥形瓶，洗涤液并入分液漏斗，用盐酸调pH＝2，用乙醚萃取4次，每次20mL，合并乙醚液，在50～60℃水浴蒸干，用甲酸-甲醇(5∶95)溶液溶解定容至10mL，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

分别称取两个平行样S₁、S₂：

         S₁            S₂

样品(g)：2.0384        2.0042

(2)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.60mg的溶液。取香草酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.908mg的溶液；

将上述对照品溶液稀释成阿魏酸对照品溶液、香草酸对照品溶液：

                       阿魏酸对照品溶液    香草酸对照品溶液

对照品溶液浓度(mg/ml)：0.180               0.136

(3)色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：1.0％甲酸-甲醇(40∶60)，流速：1.0mL/min，检测波长：290nm。

含量测定方法：分别精密吸取二种对照品溶液和二份供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，测定峰面积，以下式计算样品中阿魏酸和香草酸的含量：

As：供试品溶液的峰面积；    Ar：对照品溶液的峰面积；

Cs：对照品浓度(mg/ml)；

Ms：供试品取样量(g)；       V：定容体积(ml)

①测定结果：

②计算：(平均含量3.0270g/袋)

$S_{11}=\frac{8818.4\×0.18\×10}{6953.8\×2.0384\×1000}\×100\%=0.104\%$

$S_{12}=\frac{8365.3\×0.18\×10}{6953.8\×2.0042\×1000}\×100\%=0.106\%$

$\stackrel{\‾}{S}=0.105\%$

RSD＝1.13％

同法求得香草酸

$\stackrel{\‾}{S}=0.055\%$

RSD＝1.27％

实施例2

杠板归药材的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取药材适量，粉碎，过3号筛，称取2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，放置3小时，超声处理1小时，摇匀，滤过，残渣用甲醇洗至无色，蒸干，用0.5moL·L^-1氢氧化钠溶液30mL分3次溶解，转入锥形瓶中，50～60℃水浴回流2小时，放冷，移入分液漏斗中，用5mL水洗涤锥形瓶，洗涤液并入分液漏斗，用盐酸调pH＝2，用乙醚萃取4次，每次20mL，合并乙醚液，在50～60℃水浴蒸干，用甲酸-甲醇(5∶95)溶液溶解定容至10mL，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

分别称取两个平行样S₁、S₂：

         S₁            S₂

样品(g)：2.0862        1.9657

(2)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.60mg的溶液。取香草酸对照品适量，精密称定，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液制成每1mL含0.90mg的溶液；

将上述对照品溶液稀释成阿魏酸对照品溶液、香草酸对照品溶液：

                       阿魏酸对照品溶液    香草酸对照品溶液

对照品溶液浓度(mg/ml)：0.180               0.136

(3)色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：1.0％甲酸-甲醇(40∶60)，流速：1.0mL/min，检测波长：290nm。

含量测定方法：分别精密吸取二种对照品溶液和二份供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，测定峰面积，以下式计算样品中阿魏酸和香草酸的含量：

As：供试品溶液的峰面积；    Ar：对照品溶液的峰面积；

Cs：对照品浓度(mg/ml)；

Ms：供试品取样量(g)；       V：定容体积(ml)

①测定结果：

②计算：(平均含量3.0270g/袋)

$S_{11}=\frac{9643.8\×0.18\×10}{6958.2\×2.0862\×1000}\×100\%=0.119\%$

$S_{12}=\frac{9126.6\×0.18\×10}{6958.2\×1.9657\×1000}\×100\%=0.120\%$

$\stackrel{\‾}{S}=0.120\%$

RSD＝0.59％

同法求得香草酸

S＝0.068％

RSD＝2.08％

实施例3～12：方法同实施例1

实施例3～12十批供试品测定结果见下表：

根据以上实施例1～12共12批样品的含量测定结果，并考虑药材产地、采摘期以及质地的不同，确定本药材阿魏酸含量不得低于0.06％(以干燥品计)，香草酸含量不得低于0.015％(以干燥品计)。

试验例

1、样品前处理

(1)性状：见上述杠板归药材质量标准，十二批样品均与此描述一致。

(2)鉴别：照中国药典一部原标准规定。

(3)含量测定：中国药典中对杠板归药材的含量测定指标选定的指标性化合物为槲皮素，但是药材中的有机酸才是杠板归药材杀菌抗病毒的药效的物质基础，所以本方法建立了HPLC法同时测定对杠板归药材中的阿魏酸和香草酸的测定方法。

(4)药品与药剂：香草酸对照品(批号110776-200402)、阿魏酸对照品(批号110773-200611)均购自中国药品生物制品检定所，为含量测定使用；杠板归药材(贵州远程制药有限责任公司提供)；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

(5)仪器分析条件：仪器为Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器，Agilent 1100化学工作站。

(6)色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：1.0％甲酸-甲醇(40∶60)，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，检测波长：290nm。

(7)检测波长的选择：阿魏酸和香草酸的最大吸收波长分别为324nm和290nm。选择290nm为测定波长，可同时兼顾测定两者含量。预实验结果表明样品中香草酸含量较低，选择其最大吸收波长为含量测定波长，可提高香草酸的灵敏度。

(8)供试品溶液处理的选择：考察了超声提取与水浴回流提取的方法，结果表明超声提取1小时与水浴回流2小时测得阿魏酸、香草酸含量差别不大，故采用超声提取作为提取方法。

考察超声提取时间时，选用了60min、90min和120min进行超声，结果发现超声120min比提取60min的目标成分增加量并不明显，故确定超声时间为60min。

阿魏酸不稳定，遇光和热容易分解[4]，将对照品和样品试剂加入一定量的酸且在避光及冰箱(4℃)的条件下保存，提高了稳定性。水浴回流时，考虑到阿魏酸不耐热，温度选择50～60℃。2、方法学考察

2.1线性范围

精密量取阿魏酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至10mL量瓶中，甲酸-甲醇(5∶95)溶液稀释至刻度，得线性系列溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标(Y)，阿魏酸进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程。以峰面积为纵坐标(Y)，阿魏酸进样量(μg)为横坐标(X)，计算得回归方程：Y＝3970.386X-26.395，r＝0.9995。表明阿魏酸在0.6μg～3.0μg的质量范围内具有良好的线性关系。

精密量取香草酸对照品溶液适量，稀释至0.454mg·mL-1，精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5mL至10mL量瓶中，用甲酸-甲醇(5∶95)溶液稀释至刻度，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标(Y)，香草酸进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程。以峰面积为纵坐标(Y)，香草酸进样量(μg)为横坐标(X)，计算得回归方程：Y＝1866.112X+15.2810，r＝0.9999。表明香草酸在0.454μg～2.270μg的质量范围内具有良好的线性关系。

2.2进样精密度试验

分别取阿魏酸对照品溶液和香草酸对照品溶液10μL，连续进样5次，测定峰面积，阿魏酸RSD为0.93％，香草酸RSD为1.02％，表明进样精密度良好。

2.3稳定性试验

取同一供试品溶液(遵义朝阳)10μL，分别于0、2、4、6、8、12h内各测定一次。测定阿魏酸与香草酸的峰面积，阿魏酸与香草酸峰面积的RSD分别为1.10％和0.93％，表明样品至少在12h内稳定。

2.4重复性试验

取同一批号杠板归样品(贵州台江)，制备供试品溶液6份，按上述色谱条件进行测定，计算含量。阿魏酸和香草酸RSD分别为2.2％和1.7％(n＝6)，表明方法重复性良好

2.5回收率试验

取6份已知含量(阿魏酸含量2.420mg·g-1，香草酸含量1.01mg·g-1)的样品1.0g，精密称定，分别精密加入阿魏酸对照品溶液4mL和香草酸对照品溶液1mL，按1.3.2项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按样品含量测定方法进行测定，计算回收率。阿魏酸回收率为99.32％，RSD＝1.29％(n＝6)，香草酸回收率为99.92％，RSD＝1.59％(n＝6)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种杠板归药材的质量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取药材适量，粉碎，过3号筛，称取2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，放置3小时，超声处理1小时，摇匀，滤过，残渣用甲醇洗至无色，蒸干，用0.5moL·L-1氢氧化钠溶液30mL分3次溶解，转入锥形瓶中，50～60℃水浴回流2小时，放冷，移入分液漏斗中，用5mL水洗涤锥形瓶，洗涤液并入分液漏斗，用盐酸调pH＝2，用乙醚萃取4次，每次20mL，合并乙醚液，在50～60℃水浴蒸干，用体积比为甲酸∶甲醇＝5∶95溶液溶解定容至10mL，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加体积比为甲酸∶甲醇＝5∶95溶液制成每1mL含0.600mg的溶液；取香草酸对照品适量，精密称定，加体积比为甲酸∶甲醇＝5∶95溶液制成每1mL含0.908mg的溶液；

(3)含量测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定；

(4)色谱条件：

色谱柱：250mm×4.6mm，5μm，Diamonsil C18柱；

流动相：1.0％体积比为甲酸∶甲醇＝40∶60，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，检测波长：290nm。

2.如权利要求1所述的杠板归药材的质量检测方法，其中阿魏酸含量以干燥品计不得低于0.06％，香草酸含量以干燥品计不得低于0.015％。

3.如权利要求1或2所述的杠板归药材的质量检测方法，其中杠板归药材是杠板归药材及各种以杠板归药材为原料的各种剂型。