CN104297405B - 一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，称取蓝盆花干燥粉末，置于具塞三角瓶中，精密加入乙醇溶液L，摇匀，密塞，超声提取1.0h，滤过，以无水乙醇洗净药渣，合并滤液，减压回收溶剂至干，以20％甲醇溶解转移至量瓶中，稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL置5mL量瓶中，以20％甲醇稀释到刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL加入预处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，加10％甲醇0.5mL洗脱，控制流速，弃去洗脱液，加甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜滤过。本发明利用高效液相色谱法对蒙药蓝盆花进行了指纹图谱研究，用于评价蓝盆花药材质量的真实性、优良性和稳定性。

Description

一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。

背景技术

近年来国际植物药市场需求量不断增长，我国植物药资源面临着药材原料严重缺乏的现状。中蒙药原料药材由于受基源、产地环境气候、采收时间、加工方法等一系列过程的影响，所含成分也往往相差很大，质量真实性、均一性、稳定性很难保障。同时在巨额利润的诱惑下，不少药商不顾消费者的生命安全，以假充真，以次充好。中蒙药质量问题成为中蒙药国际化的一个技术瓶颈。目前中蒙药的质量控制主要以已知的一种或几种活性成分或指标成分为控制质量的指标，通过定性和定量的分析，判断药品的真伪优劣。但是中蒙药的疗效既不是任何单一活性成分的作用，也不是多种成分活性的简单相加。所以，宏观地综合分析已成为中蒙药质量控制发展的必然趋势，现阶段色谱指纹图谱就是适应这一特点的质量控制模式，能够比较全面地、综合地反映药材中所含化学成分。

目前，蒙药蓝盆花药材及其复方制剂尚缺乏科学、可控的质量标准。仅在《中华本草》(蒙药卷)及《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)中有蓝盆花药材的显微鉴别和理化鉴别，无薄层鉴别项和含量测定项。简单的质量控制方法致使该药材的使用、生产和流通都受到限制，临床用药的有效性和安全性没有保证。目前本课题组和国内相关课题组对蓝盆花的质量控制方面进行了相关的研究，建立了药材中总黄酮的含量测定方法及单一成分的含量测定方法。无论是法定的现行标准还是目前已有的标准研究，都未能从整体的角度全面综合地反映蓝盆花药材的化学内涵和质量。

本发明利用高效液相色谱法构建了蒙药蓝盆花的色谱指纹图谱分析方法，并通过多批次药材的分析确定了该药材的标准指纹图谱。此方法简单方便、快速有效，可用于从宏观角度全面评价蒙药蓝盆花药材的质量。

发明内容

本发明的目的在于克服上述蓝盆花药材质量评价的现有技术缺陷，提供一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，用于宏观评价蓝盆花药材质量的真实性、优良性和稳定性。该发明方法简单方便、快速有效，可用于从宏观角度全面评价蒙药蓝盆花药材的质量，对于提高蓝盆花药材及其成方制剂质量，促进该药材及其制剂的现代研究和深层次开发利用具有重要意义。其具体技术方案为：

在蒙药蓝盆花现有药效物质基础研究结果的基础上利用高效液相色谱法构建蒙药蓝盆花的色谱指纹图谱分析方法，并结合多批次蓝盆花药材的指纹图谱分析，确定该药材的标准指纹图谱。本方法的特点：简便、稳定、精密度高、重现性好，可全面、客观、有效反映蒙药蓝盆花药材的质量。

一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(a)供试品溶液的制备：称取蓝盆花干燥粉末约1.0g，精密称定，置于100mL具塞三角瓶中，分别精密加入60％～100％的乙醇或60％～100％甲醇溶液20～50mL，摇匀，密塞，超声提取30～60min或回流提取30～60min，提取1～3次，合并滤液。减压回收溶剂至干，用20％的甲醇转移至25mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL置5mL量瓶中，以20％甲醇稀释到刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL加入预处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，加5％～20％甲醇0.5～2.0mL洗脱，控制流速，弃去洗脱液，加70％～100％甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

(b)对照品溶液的配制：分别取下列五种对照品适量，均制成0.1mg/mL样品溶液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

1.木犀草素-6-C葡萄糖苷

2.华北蓝盆花素

3.芹菜素7-O-芦丁糖苷

4.芹菜素-7-O-葡萄糖苷

5.木犀草素-7-O-葡萄糖苷

(c)色谱条件：色谱柱：各种反相C₁₈柱；流动相：甲醇-水、甲醇-水-磷酸、乙腈-水、乙腈-水-磷酸；洗脱梯度：10％B(0min)～100％B(95min)；检测波长：220～400nm；柱温：25～35℃；流速：0.6～1.0mL/min；进样量：10μL。

(d)标准指纹图谱：以10号药材指纹图谱作为蓝盆花药材的标准指纹图谱(如图1)。

该标准指纹图谱中包含共有指纹峰15个，以10号峰为对照，其相对保留时间和相对峰面积为1，其它指纹峰的相对保留时间和相对峰面积见表1。

表1蓝盆花标准指纹图谱中共有指纹峰的保留时间和峰面积

该标准指纹图谱中，5个指纹峰的结构可以确定。

3号峰：木犀草素-6-C葡萄糖苷

4号峰：华北蓝盆花素

7号峰：芹菜素7-O-芦丁糖苷

9号峰：芹菜素-7-O-葡萄糖苷

10号峰：木犀草素-7-O-葡萄糖苷

进一步优选确定蒙药蓝盆花指纹图谱分析的最佳方法及标准指纹图谱，包括以下步骤：

(a)供试品溶液的制备：称取蓝盆花干燥粉末1.0g，精密称定，置于100mL具塞三角瓶中，精密加入80％乙醇溶液50mL，摇匀，密塞，超声(功率150W)提取1.0h，滤过，以无水乙醇洗净药渣，合并滤液，减压回收溶剂至干，以20％甲醇溶解转移至25mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL置5mL量瓶中，以20％甲醇稀释到刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL加入预处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，加10％甲醇0.5mL洗脱，控制流速，弃去洗脱液，加甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

(b)对照品溶液的配制：取各对照品适量，用20％甲醇溶解制成0.1mg/mL样品溶液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

(c)色谱条件：色谱柱：YMC-PackODS-A(250×4.6mmD5μm，12nm)；流动相：水-乙腈-磷酸，采用二元线性梯度洗脱10％B(0min)～10％B(5min)～18％B(10min)～20％B(50min)～35％B(65min)～70％B(95min)；检测波长：265nm；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL。

(d)方法学验证：精密度：将所得的色谱图导入相似度评价软件进行相似度比较，相似度数值均大于0.95，且RSD小于2.0％，表明仪器精密度良好。重复性：将所得的色谱图导入相似度评价软件进行相似度比较，相似度均大于0.95，且RSD小于2.0％，说明该方法的重现性较好。稳定性：将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，相似度均大于0.95，且RSD小于2.0％，表明供试品溶液在24小时内的稳定性良好。

(e)标准指纹图谱：以10号药材指纹图谱作为蓝盆花药材的标准指纹图谱(如图1)。

该标准指纹图谱中包含共有指纹峰15个，以10号峰为对照，其相对保留时间和相对峰面积为1，其它指纹峰的相对保留时间和相对峰面积见表2。

表2蓝盆花标准指纹图谱中共有指纹峰的保留时间和峰面积

该标准指纹图谱中，5个指纹峰的结构可以确定。

3号峰：木犀草素-6-C葡萄糖苷

4号峰：华北蓝盆花素

7号峰：芹菜素7-O-芦丁糖苷

9号峰：芹菜素-7-O-葡萄糖苷

10号峰：木犀草素-7-O-葡萄糖苷

本发明所述蒙药蓝盆花指纹图谱在蒙药蓝盆花品种鉴别中的应用。

本发明所述蒙药蓝盆花指纹图谱分析方法简便易行，灵敏度高，重现性好；所述标准指纹图谱具有典型性、代表性，并能指认图谱中5个色谱峰的化学结构，能较为全面地、客观地反映该蒙药所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，在其品种鉴别和品种评价中具有重要应用价值。

使用者按照本发明建立的方法制备蒙药蓝盆花的供试品溶液，按照最终确定的色谱条件进样分析，所得图谱与蓝盆花标准指纹图谱利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)”进行相似度计算，相似度不得低于0.90。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：蒙药蓝盆花现行质量标准为国家标准，载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)，方法相当简单，其中化学方面仅有黄酮类成分的理化定性鉴别，如此简单的方法根本无法有效进行蓝盆花品种鉴定和品质评价。(1)本发明所述蓝盆花指纹图谱的分析方法，是结合比较深入的物质基础研究，通过科学优化建立起来的，各种方法学研究如精密度、稳定性、重现性等研究结果均表明该分析技术方法简便、灵敏度高、重现性好，是一种科学的蒙药蓝盆花指纹图谱的分析方法。(2)本发明所述的蒙药蓝盆花标准指纹图谱，是通过对13批不同产地的蒙药蓝盆花药材进行色谱指纹图谱分析而建立起来的，具有代表性。(3)本发明所述的蒙药蓝盆花标准指纹图谱具有15个共有指纹峰，其中5个可以确定结构，能够准确、客观地反映蒙药蓝盆花中所含的主要化学成分，因而能够从宏观上综合反映该药材的品质，可以填补蒙药蓝盆花质量评价中化学评价基本缺失的空白，在该药材品种真伪鉴定、品种质量评价方面具有重要意义和推广应用前景。

附图说明

图1是10号药材图谱(蓝盆花药材标准指纹图谱)；

图2是对照指纹图谱；

图3是蓝盆花HPLC标准指纹图谱色谱峰的鉴别。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

1仪器与材料

1.1仪器与试剂

高效液相色谱仪日立L-2000系列：二元高压梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器；AB135-S电子天平(METTLERTOLEDO)；KH3200E超声清洗机(昆山禾创超声清洗有限公司)；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；乙醇为分析纯(天津威晨化学试剂科贸有限公司)；色谱用水为哇哈哈纯净水(过0.45μm滤膜)其他试剂均为分析纯。

1.2材料

实验所用色谱柱：

(a)Kromasil5μC₁₈(250nm×4.6nm)

(b)AgilentXDBC₁₈(250mm×4.6mmD，5μm)

(c)YMC-PackODS-A(250×4.6mmD，5μm，12nm)

(d)Phenomenex(250mm×4.6mmD，5μm)

1.3试药：对照品均为本课题组从兰盆花中分离并通过综合光谱解析鉴定结构。

1.木犀草素-6-C葡萄糖苷

2.华北蓝盆花素

3.芹菜素7-O-β-芦丁糖苷芹

4.菜素-7-O-葡萄糖苷

5.木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

1.4药材

表313批蓝盆花药材

1.5数据处理软件

国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)

2蓝盆花的指纹图谱操作方法的建立

以12号药材作为供试品溶液制备方法研究和方法学考察所用药材。

2.1供试品溶液的优选：

2.1.1提取溶剂及浓度的选择

由于蓝盆花中所含成分主要为黄酮及其苷类，而黄酮类化合物具有相对较高的亲水性，多溶于乙醇，同时考虑到甲醇对苷类溶解度较好，结合文献，选择用不同浓度的甲醇和乙醇比较的方法，确定提取溶媒。

将干燥的蓝盆花药材粉碎，过40目筛，取两份药材粉末，每份约1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，分别加入20mL甲醇溶液和20mL乙醇溶液，超声提取30min，滤过，减压回收溶剂至干，用甲醇溶解转移至25mL量瓶中，稀释至刻度。精密吸取1mL，置5mL量瓶中，用甲醇稀释到刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

将所得供试品溶液，按确定的色谱条件分别进样10μL，得到各色谱指纹图谱。可以看出，两种溶剂所提取成分信息量差异较小，通过HPLC计算各图谱中色谱峰的数目、峰高及峰面积得出结论，甲醇与乙醇提取效率相似，因考虑到甲醇具有毒性，所以选择乙醇作为提取溶剂。

2.1.2提取方法及提取时间的选择

分别考察了常用的二种提取方法：超声提取、回流提取。

称取蓝盆花药材粉末4份，每份约1.0g，置具塞三角瓶中，加入20mL乙醇溶液。

①超声提取30min，滤过，以无水乙醇洗涤药渣，合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣以甲醇溶解并转移至25mL量瓶中，稀释至刻度，精密吸取1mL置5mL量瓶中，稀释至刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

②回流提取1h，以无水乙醇洗涤药渣，合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣以甲醇溶解并转移至25mL量瓶中，稀释至刻度，精密吸取1mL置5mL量瓶中，稀释至刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

将①、②所得供试品溶液，按确定的色谱条件分别进样10μL，得到各色谱指纹图谱。两种方法所提取成分信息量效果相当，考虑到超声提取操作简便，且不破坏植物有效成分，故选用操作相对简单的超声提取法制备供试品溶液。

2.1.3提取条件的优化

为了全面的反映蓝盆花化学成分的信息，需要将提取方法进行优化。选择4个因素对乙醇超声提取方法进行了进一步考察，4个因素分别为，乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、溶剂体积(D)，每个因素设置4个水平，选取L16(4⁵)正交表进行实验(见表4、表5)

表4提取条件因素水平表

表5正交实验表

通过正交试验，综合各个色谱峰峰面积的变化，得到最佳提取条件是：A₃B₃C₁D₄，即：80％的乙醇溶液50mL，提取1次，提取时间为1.0h。将上述样品按确定的色谱条件进样10μL，得到的色谱指纹图基线不平稳，小的杂质峰较多，固相萃取柱可以极大的改善基线不平、杂质峰多的问题。

2.1.4固相萃取条件考察

2.1.4.1梯度洗脱浓度考察

吸取4份0.5mL上述备用样品溶液加入处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，分别加入5％、10％、15％和20％甲醇2mL进行洗脱，控制流速，弃去洗脱液，再精密加入2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，按确定的色谱条件进样10μL，得到色谱指纹图。

表明，5％洗脱时，样品中的杂质峰较多，基线不平稳，用15％和20％洗脱时，可以除去一些杂质峰，但同时也带走了较多的样品峰，使峰面积明显降低，而10％甲醇洗脱时，既可以除去一些杂质峰，同时不影响样品峰的峰面积，所以选择10％为洗脱浓度。

2.1.4.2梯度洗脱体积考察

吸取4份0.5mL上述备用样品溶液加入处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，分别加入10％甲醇0.5、1.0、1.5、2mL进行洗脱，控制流速，弃去洗脱液，再精密加入2mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，将上述样品溶液分别取10μl，进HPLC分析。

可知，洗脱体积为0.5mL时可以将杂质峰除去，随着洗脱体积的增加，样品峰的峰面积明显减小，所以选择洗脱体积为0.5mL。

2.1.4.3洗脱浓度考察

吸取4份0.5mL上述备用样品溶液加入处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，分别加入10％甲醇0.5mL进行洗脱，控制流速，弃去洗脱液，再分别加入70％、80％、90％、100％甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，将上述样品溶液分别取10μl，进HPLC分析。

可以看出，洗脱浓度为100％甲醇时，色谱峰的峰面积最大，色谱峰数目最多，所以选择100％甲醇为洗脱浓度。

综上所述，优化后的蓝盆花供试品品溶液制备方法为：称取蓝盆花干燥粉末1.0g，精密称定，置于100mL具塞三角瓶中，精密加入80％乙醇溶液50mL，摇匀，密塞，超声(功率150W)提取1.0h，滤过，以无水乙醇洗净药渣，合并滤液，减压回收溶剂至干，以20％甲醇溶解转移至25mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL置5mL量瓶中，以20％甲醇稀释到刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL加入预处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，加10％甲醇0.5mL洗脱，控制流速，弃去洗脱液，加甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

2.2对照品溶液的制备：

取各对照品适量，用20％甲醇溶解制成0.1mg/mL样品溶液，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

2.3色谱条件的优选：

2.3.1检测波长的选择

本研究采用二极管阵列检测器(DAD)对所有色谱峰在220-400nm波长范围内进行全波长扫描，通过比较不同波长下的图谱中色谱峰的数目、高度及峰面积，最终确定了265nm为最佳检测波长。

2.3.2流动相的选择

本实验考察了甲醇-水、甲醇-水-磷酸、乙腈-水、乙腈-水-磷酸四种流动相系统。比较四种方法，用乙腈-水-磷酸系统能使蓝盆花中的成分得到很好的分离。所以最终选定乙腈-水-磷酸系统作为流动相。

由于蓝盆花中所含的化学成分种类繁多复杂，采用常规的等度洗脱难以使各色谱峰获得分离。为了使色谱图获得更好的分离度，提供更多的色谱峰信息，本实验采用洗脱梯度。

以乙腈-水-磷酸系统为流动相，以10％B(0min)～100％B(95min)为洗脱梯度进行分析，供试品色谱图中色谱峰分离效果欠佳，在此基础上对洗脱梯度进行调整，最终确定为：10％B(0min)～10％B(5min)～18％B(10min)～20％B(50min)～35％B(65min)～70％B(95min)。

2.3.3色谱柱的选择

本实验选择了四种不同型号的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，(a)Kromasil5μC₁₈(250nm×4.6nm)；(b)AgilentXDBC₁₈(250mm×4.6mmD，5μm)；(c)YMC-PackODS-A(250×4.6mmD，5μm，12nm)；(d)Phenomenex(250mm×4.6mmD，5μm)，用同样的色谱条件，不同型号的色谱柱分别分析同一份样品，结果来自四种不同品牌色谱柱的色谱图有一定的差别。不同品牌的色谱柱会带来保留时间的漂移，且色谱峰也会有差别。综合考虑，最终选择了YMC-PackODS-A(250×4.6mmD，5μm，12nm)。

2.3.4柱温的选择

不同的温度会影响流动相溶剂的密度、粘度的改变，从而会影响到色谱图中各峰的分离效果及出峰时间，本实验分别考察了25℃、30℃、35℃下的色谱图，通过比较，最终确定了柱温为30(℃。

2.2.5流速的选择

流动相速度的变化会引起色谱图中各峰的保留时间和分离度发生变化，本实验考察了流动相的三种不同流速：0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min，结果证实，0.8mL/min为最佳流速。

综上，确定蒙药蓝盆花HPLC指纹图谱分析的最优色谱条件为：色谱柱：YMC-PackODS-A(250×4.6mmD，5μm，12nm)；流动相：水-乙腈-磷酸，洗脱梯度10％B(0min)～10％B(5min)～18％B(10min)～20％B(50min)～35％B(65min)～70％B(95min)；检测波长：265nm；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL。

3指纹图谱研究方法的验证

按照已建立的蓝盆花指纹图谱的色谱条件，比较空白流动相及供试品溶液的色谱图情况，试验结果表明在相应的时间内能得到完整的蓝盆花指纹图谱。

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南》，将所得的色谱图转换成AIA格式后输入相似度评价软件，通过对所得图谱的相似度比较进行方法学考察。

3.1精密度考察

按照“蓝盆花供试品溶液的制备方法”制备样品，按照已建立的指纹图谱色谱条件，连续进样6次，进样量为10μL，将所得的色谱图导入相似度评价软件进行相似度比较，(以平均数建立对照指纹图谱)，结果如表6。

表6精密度考察相似度评价数据

由上表可以看出，与对照指纹图谱相比，连续进样6次所得的个色谱指纹图谱的相似度数值均大于0.95，且RSD小于2.0％，表明仪器精密度良好。

3.2重复性考察

按“蓝盆花供试品溶液的制备方法”制备6份样品，按照已建立的指纹图谱色谱条件，分别进样分析，将所得的色谱图导入相似度评价软件进行相似度比较，(以平均数建立对照指纹图谱)，结果如表7。

表7重现性考察相似度评价数据

上表显示，6个色谱图的相似度均大于0.95，且RSD小于2.0％，说明该方法的重现性较好。

3.3稳定性考察

取同一份供试品溶液分别在0、2、4、8、12h进样分析，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，(以平均数建立对照指纹图谱)，结果如表8。

表8稳定性考察相似度评价数据

上表结果表明，该样品溶液在12h内是稳定的。

以上方法学考察表明：目前建立的指纹图谱操作方法可行，可用于蓝盆花指纹图谱的建立和分析。

4样品测定及标准指纹图谱的确定

4.1蓝盆花样品的测定

取采集的内蒙古大青山等地药材，共13批，分别按照已建立的“蓝盆花指纹图谱的操作方法”进行分析，得到各批药材的HPLC指纹图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”对各色谱图进行分析评价，以中位数建立对照指纹图谱进行相似度比较(表9)。

表913批蓝盆花药材相似度

4.2蓝盆花标准指纹图谱的建立

标准指纹图谱代表了药材中化学成分的基本特征，为药材之间的比较提供了参考依据。

本实验利用相似度评价软件分析评价了13批蓝盆花药材样品的指纹图谱。由表中的相似度比较可以看出，10号药材指纹图谱的相似度较大，接近于共有模式，可将此药材指纹图谱作为蓝盆花药材的标准指纹图谱，对照指纹图谱与10号药材图谱的比较如图2和图1。

该标准指纹图谱中包含共有指纹峰15个，以10号峰为对照，其相对保留时间和相对峰面积为1，其它指纹峰的相对保留时间和相对峰面积见表10。

表10蓝盆花标准指纹图谱中共有指纹峰的保留时间和峰面积

4.3标准指纹图谱中色谱峰的指认：

将2.2项下各对照品溶液，按照2.3项下色谱条件进样分析，利用DAD检测器，将标准指纹图谱中各共有峰的Rt、紫外吸收等与各对照品的Rt、紫外吸收等进行比较分析，鉴定标准指纹图谱中各峰的化学结构，共鉴定5个共有峰的结构。

3号峰：木犀草素-6-C葡萄糖苷

4号峰：华北蓝盆花素

7号峰：芹菜素7-O-芦丁糖苷

9号峰：芹菜素-7-O-葡萄糖苷

10号峰：木犀草素-7-O-葡萄糖苷

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种蒙药蓝盆花的指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)供试品溶液的制备：称取蓝盆花干燥粉末1.0g，精密称定，置于100mL具塞三角瓶中，精密加入80％乙醇溶液50mL，摇匀，密塞，功率150W下，超声提取1.0h，滤过，以无水乙醇洗净药渣，合并滤液，减压回收溶剂至干，以20％甲醇溶解转移至25mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL置5mL量瓶中，以20％甲醇稀释到刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL加入预处理后的固相萃取柱，控制流速使样品溶液缓慢通过固相萃取柱，加10％甲醇0.5mL洗脱，控制流速，弃去洗脱液，加甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；

(b)对照品溶液的配制：分别取下列五种对照品，并分别编号，用20％甲醇溶解制成0.1mg/mL样品溶液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；

1号木犀草素-6-C葡萄糖苷

2号华北蓝盆花素

3号芹菜素7-O-芦丁糖苷

4号芹菜素-7-O-葡萄糖苷

5号木犀草素-7-O-葡萄糖苷

(c)色谱条件：色谱柱采用YMC-PackODS-A，其规格为250×4.6mm D，5μ m，12nm；流动相采用水-乙腈-磷酸，其中洗脱梯度的变化是，洗脱时间为0～5min时流动相中乙腈的体积分数为10％，5～10min时流动相中乙腈的体积分数从10％匀速增加至18％，10～50min时流动相中乙腈的体积分数从18％匀速增加至20％，50～65min时流动相中乙腈的体积分数从20％匀速增加至35％，65～95min时流动相中乙腈的体积分数从35％匀速增加至70％；检测波长为265nm；柱温为30℃；流速为0.8mL/min；进样量为10μL；

(d)标准指纹图谱：以10号药材指纹图谱作为蓝盆花药材的标准指纹图谱，其中10号药材产自内蒙古了目山庄，采集时间为2009年8月。

2.权利要求1所述的方法建立的蒙药蓝盆花标准指纹图谱在蒙药蓝盆花品种鉴别中的应用。