CN103969355A - 一种黄芪药材的指纹图谱的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的测定、对照指纹图谱的确定和黄芪药材指纹图谱的鉴别。通过对黄芪药材进行HPLC指纹图谱测定和分析，确定了9个黄芪药材的特征峰，这些共有特征峰构成了黄芪药材的指纹特征，可作为黄芪药材的对照指纹图谱；对需要鉴别的黄芪药材可以与对照指纹图谱进行比对，检查共有特征峰的情况，以鉴别质量。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰明显、准确可靠等特点，有利于鉴别黄芪药材的质量。

Description

一种黄芪药材的指纹图谱的鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种黄芪药材指纹图谱的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱法来对黄芪药材的有效成分进行质量控制的一种鉴别方法。

背景技术

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge. var. mongholicus(Bge)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch)Bge.的干燥根。黄芪含黄酮、皂苷类成分；黄酮类成分如芒柄花素、3'-羟基芒柄花黄素（毛蕊异黄酮）及其葡萄糖苷、2',3'-二羟基-7,4'-二甲氧基异黄酮、7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷及其葡萄糖苷、7,3'-二羟基- 4',5'- 二甲氧基异黄烷、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷及其葡萄糖苷等；皂苷类成分有黄芪皂苷Ⅰ～Ⅷ及大豆皂苷Ⅰ；黄芪甲苷（即黄芪皂苷IV）与黄芪乙苷。中国药典2010版黄芪以黄芪甲苷(C₂₂H₂₂0₁₀)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)为指标进行含量测定；李颜建立高效液相色谱法测定黄芪饮片中4个异黄酮成分毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量方法（中国药师,2012年 02期）；王宗权采用HPLC-ELSD法测定不同产地黄芪药材中的黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ的含量（药物分析杂志, 2010年 07期）。中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。中国食品药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而掀起了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。目前，对中药材质量控制较成熟的方法有单个成分含量测定或一类成分如总皂苷、总黄酮等的紫外分光光度测定法，不能对制剂进行全面直观的质量控制。采用指纹图谱技术除了能反映几乎全部成分的含量、种类外，尚能反映成分的比例、未知成分（含量测定方法中可能已被作为无效或干扰成分扣除）的产生，更多的是从药物稳定性、安全性上进行监测。《中国药典》2010年版，采用薄层色谱法对黄芪进行鉴别，由于薄层鉴别法本身受温度、湿度、薄层板厚度以及载样量等诸多因素影响，存在样品的化学成分体现不完全，可鉴别的成分数量较少，同一样品的重现性不佳的缺点，而已有文献报道的黄芪指纹图谱技术，图谱中体现的化学成分较少，提供的信息量小，不能很好地代表黄芪药材的整体质量，不能对黄芪药材的质量进行有效的鉴别。而采用本发明方法则可充分展示黄芪化学成分的指纹图谱，信息量丰富，方法重现性良好，可有效鉴别黄芪药材的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，通过指纹图谱测定对黄芪药材进行全面而有效的鉴别。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

本发明黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤：

(a)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇、乙腈甲醇混合溶剂为流动相A，以甲酸水溶液或冰醋酸水溶液、磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液为流动相B。检测器为紫外检测器、示差检测器或蒸发光检测器；

(b)供试品溶液的制备 取黄芪药材粉末（过筛），精密称定，加水浸泡，加热回流，提取液离心,滤过，用水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液水浴浓缩，加入乙醇，静置一夜。吸取上清液，热空气吹干，加水溶解，滤过，取续滤液，备用。

(c)测定法 吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

进一步优选的测定条件为：

(a)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10~25cm，内径3~5cm，粒径为1~10μm)；以乙腈为流动相A，以0.01~2%冰醋酸水溶液为流动相B；紫外检测器，检测波长200~400nm；柱温20~50℃，流速为每分钟0.2~2ml。

(b)供试品溶液的制备：取黄芪药材粉末（过30~50目筛）8~12g，精密称定，加水120~180ml，浸泡20~40分钟，加热回流1~3小时，提取液3000~5000rpm离心5~15分钟,滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液90~100℃水浴浓缩至10~20ml，加入80%~95%乙醇30~50ml，2~5℃静置一夜。吸取上清液2~5ml，50~70℃空气吹干，加水1~3ml溶解，用微孔滤膜（0.22~0.45μm）滤过，取续滤液，备用。

(c)测定法 吸取供试品溶液5~40μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

最佳测定条件:

(a)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温30℃；流速为每分钟0.9ml。

(b) 供试品溶液的制备：取本品粉末（过40目筛）约10g，精密称定，加水150ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，滤液浓缩至15ml，加入95%乙醇42ml，4℃静置一夜。吸取上清液3ml，60℃空气吹干，加水1ml溶解，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，备用。

测定法

(c) 测定法 精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰。峰5为毛蕊异黄酮苷；峰6为Calycosin-7-O-β-D-glu-6′′-O-malonate；峰7为芒柄花苷；峰8为9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷；峰9为毛蕊异黄酮。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.90，得到黄芪药材的对照指纹图谱如图1所示。

相对保留时间分别为：1号峰：0.16 , 2号峰：0.17 , 3号峰：0.20 , 4号峰：0.35 ，5号S峰：1.00，6号峰：1.32 ，7号峰：1.43，8号峰：1.50，9号峰：1.56 。

本发明与背景技术相比具有的有益效果

1.黄芪是常用的补气要药, 具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效。研究表明，其主要成分包括多糖类、黄酮类、皂苷类和γ- 氨基丁酸、生物碱、甾醇类物质、叶酸等其他化学成分，具有增强免疫功能、抗肿瘤、保肝、增强心肌收缩力及广泛的抗菌等药理作用。（邱勇波、刘锦等，黄芪化学成分及药理作用研究进展，中国疗养医学2011年第20卷第5期：435-436）。本发明对肾康注射液中的黄芪进行化学分析， 建立了对照高效液相指纹图谱，完善了现有技术的不足，使之更具有科学性，有助于阐明肾康注射液的活性成分及作用机理。

2.本发明针对黄芪药材水溶性提取物进行检测，而绝大多数水溶性成分在280nm处均表现出了良好的吸收，故选用280nm作为其检测波长，可以充分反映其化学信息。

3.本发明与已公开的文献《黄芪的高效液相色谱指纹图谱及主成分含量测定》（《中药材》2004年11月第27卷第11期）中所述的方法相比较，不同之处和有益效果在于：二者的供试品溶液制备方法、色谱条件都不相同。二者相比，依照本发明供试品溶液制备方法，药材提取液经过在4℃低温下经95%乙醇沉淀处理，可有效除去药材中的糖类、黏液质等大分子杂质，减小杂质对图谱的干扰，并防止大分子杂质堵塞色谱柱。

4.本发明使用的流动相比例未见报道。其特点是：流动相中A（乙腈）所占的比例随时间由低逐渐升高，流动相B（0.3%冰醋酸）比例随时间逐渐下降，采用梯度洗脱的方式，使得流动相的极性随时间变化，针对黄芪药材中各种成分极性不同的特点，从而实现良好的分离。

附图说明

图1是黄芪药材的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

图2是本发明提供的黄芪药材的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

实施例一：黄芪药材指纹图谱测定

1、仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A ，G1315D，DAD检测器， Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson, Honeywell International Inc., USA）、冰醋酸色谱纯（Tedia company Inc.,USA）、水（Millipore, Bedford, MA, USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷对照品购自中国生物制品有限公司。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

2、色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

梯度洗脱时间

3、供试品溶液的制备 取本品粉末（过40目筛）约10g，精密称定，加水150ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，滤液浓缩至15ml，加入95%乙醇42ml，4℃静置一夜。吸取上清液3ml，60℃空气吹干，加水1ml溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法 精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰，无缺峰现象。

4、黄芪药材样品测定结果

表 1 黄芪药材指纹图谱测定结果

以17批黄芪药材建立对照图谱如图2所示

相对保留时间：

1号峰：0.16 2号峰：0.17 3号峰：0.20 4号峰：0.35

5号S峰：1.00 6号峰：1.32 7号峰：1.43 8号峰：1.50

9号峰：1.56

6 方法学考察

6.1仪器精密度试验

取批号为20110404样品，按照供试品溶液制备方法制备，连续进样6次，考察指纹图谱精密度。将精密度实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，结果表明有较高的相似度（相似度在0.99以上，见表2）。结果表明仪器精密度较高。

表2 黄芪药材HPLC指纹图谱精密度相似度

6.2指纹图谱重复性试验

供试品制备和分析方法如前所述，取同一批号黄芪药材（批号20110404），平行制备6份供试品，考察指纹图谱的变化情况。将重复性实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，如表3所示，结果表明有较高的相似度（相似度均在0.99以上）。

表3 黄芪药材HPLC指纹图谱重复性相似度

6.3指纹图谱稳定性试验

按照前述方法制备黄芪药材（批号20110404）供试品一份，于常温下保存，分别在0、4、8、12、16、24小时测定供试品溶液，考察稳定性，指纹图谱相似度计算结果见表4。黄芪药材供试品溶液在24小时内稳定。

表4 黄芪药材HPLC指纹图谱稳定性相似度

实施例二：黄芪药材指纹图谱测定

1.仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A ，G1315D，DAD检测器， Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson, Honeywell International Inc., USA）、冰醋酸色谱纯（Tedia company Inc.,USA）、水（Millipore, Bedford, MA, USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷对照品购自中国生物制品有限公司。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

2.色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm；柱温20℃；流速为每分钟0.5ml。

梯度洗脱时间

3.供试品溶液的制备 取本品粉末（过40目筛）约10g，精密称定，加水150ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，滤液浓缩至15ml，加入95%乙醇42ml，4℃静置一夜。吸取上清液3ml，60℃空气吹干，加水1ml溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法 精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰，无缺峰现象。

4.测定结果见表5

表5 17批黄芪药材相似度结果

实施例三：黄芪药材指纹图谱测定

1.仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A ，G1315D，DAD检测器， Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson, Honeywell International Inc., USA）、冰醋酸色谱纯（Tedia company Inc.,USA）、水（Millipore, Bedford, MA, USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷对照品购自中国生物制品有限公司。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

2.色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.35%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为370nm；柱温45℃；流速为每分钟1.2ml。

梯度洗脱时间

3.供试品溶液的制备 取本品粉末（过40目筛）约10g，精密称定，加水150ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液滤过，滤液浓缩至15ml，加入95%乙醇42ml，4℃静置一夜。吸取上清液3ml，60℃空气吹干，加水1ml溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法 精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰，无缺峰现象。

4.测定结果见表6

表6 17批黄芪药材相似度结果

实验证实，采用本发明的方法，可有效的鉴别黄芪药材的质量。

Claims (4)

1.黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取黄芪药材粉末（过30~50目筛）8~12g，精密称定，加水120~180ml，浸泡20~40分钟，加热回流1~3小时，提取液3000~5000rpm离心5~15分钟,滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液90~100℃水浴浓缩至10~20ml，加入80%~95%乙醇30~50ml，2~5℃静置一夜，吸取上清液2~5ml，50~70℃空气吹干，加水1~3ml溶解，用微孔滤膜（0.22~0.45μm）滤过，取续滤液，备用；

（2）指纹图谱测定：取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录75分钟以内的色谱图，得到由其共有特征峰构成的黄芪药材对照高效液相指纹图谱；其中高效液相色谱分析的条件如下：用十八烷基键合硅胶为填充剂；Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱4.6×250mm；乙腈-0.01-2%冰醋酸为流动相梯度洗脱，梯度程序为：0min→5min→30min→45min→60min→62min→75min：对应流动相：乙腈：2%→7%→15%→20%→35%→50%→50%；0.01-2%冰醋酸：98%→93%→85%→80%→65%→50%→50%，检测波长为200nm-400nm；流速为0.2ml/min-2ml/min；柱温为20℃-50℃；所得到的黄芪药材的对照指纹图谱有9个共有特征峰，其相对保留时间分别为：1号峰：0.16 , 2号峰：0.17 , 3号峰：0.20，4号峰：0.35， 5号S峰：1.00，6号峰：1.32 ，7号峰：1.43，8号峰：1.50，9号峰：1.56 。

2.根据权利要求1所述的黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：取黄芪药材粉末（过40目筛）约10g，精密称定，加水150ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液4000rpm离心10min，滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液100℃水浴浓缩至15ml，加入95%乙醇42ml，4℃静置一夜，吸取上清液3ml，60℃空气吹干，加水1ml溶解，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，备用。

3.根据权利要求1所述的黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中所述的检测波长为280nm；流速为0.9ml/min；柱温为25℃。

4.根据权利要求1所述的黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中的流动相乙腈-0.01-2%冰醋酸用乙腈-0.03%磷酸溶液或乙腈-0.03%甲酸溶液代替。