CN109239220B

CN109239220B - 一种玉屏风颗粒的质量检测方法

Info

Publication number: CN109239220B
Application number: CN201811143090.4A
Authority: CN
Inventors: 高永坚; 袁春平; 毕晓黎; 区淑蕴; 汤春花; 胥爱丽; 李养学
Original assignee: Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital (guangzhou Province Engineering Technology Research Institute Of TCM); Sinopharm Group Guangdong Medi World Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital (guangzhou Province Engineering Technology Research Institute Of TCM); Sinopharm Group Guangdong Medi World Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109239220A

Abstract

本发明属于药材检测领域，具体涉及一种玉屏风颗粒的质量检测方法。所述玉屏风颗粒的质量检测包括性状检测、薄层色谱检测、指纹图谱检测和含量限定检测。本发明一种玉屏风颗粒的质量检测方法，采用薄层色谱通过一个方法可一次性鉴定黄芪和防风2种中药，准确性高、实用性强；采用超高效液相色谱可统一测定玉屏风颗粒的指纹图谱和成分含量，经过方法学考察，本发明含量测定方法精密度高、稳定性好、重复性优秀，并且显著的减少了分析检测的时间，对玉屏风颗粒质量标准的制定具有重要的意义。

Description

一种玉屏风颗粒的质量检测方法

技术领域

本发明属于属于药材检测领域，具体涉及一种玉屏风颗粒的质量检测方法。

背景技术

玉屏风颗粒是国家基本药物目录品种之一，也是国家中药保护品种，并收载于《中国药典》(2015年版一部)。其由黄芪、防风及白术三味药制成，具有益气，固表，止汗之功效，主要用于表虚不固，自汗恶风，面色晄白或体虚易感风邪者。另外的，现代研究表明玉屏风颗粒中黄芪的异黄酮类成分具有清除自由基、调节免疫、抗病毒等方面的药理作用；防风的色原酮类成分具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤等多种药效。

随着经济的不断发展，中医药凭借其较小的毒副作用和显著的治疗效果，受到全世界越来越多的瞩目，中药在传统的中医理论指导下也开始蓬勃发展。但中药的来源广泛、成分繁多、相互作用机理复杂，给中药组合物的质量检测、安全标准的制定带来了困难，也成为中药进入国际市场的一个难题。因此，制定、完善和提高我国中药产品的质量标准已迫在眉睫。

薄层色谱法(TLC)经常运用于中药制剂的鉴定中，《中国药典》(2015年版一部)记录了玉屏风颗粒的薄层色谱鉴别方法，其分别采用黄芪、白术和防风对照药材采用不同的方法分别鉴定玉屏风颗粒中的黄芪、白术和防风。但是该方法黄芪、白术和防风对照药材昂贵难获取、鉴定方法繁琐复杂，不适用于生产活动中对产品的质量检测。

高效液相色谱(HPLC)具有快速、灵敏、分离效能高等优点，在中药定性和定量分析中，采用HPLC法分离特征成分后，用检测器进行检测分析，是全面评价中药组合物质量的有效方法。中国专利申请CN105044260A公开了一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法，所述方法将玉屏风制剂提取后注入高效液相色谱，以乙腈和0.02～0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱110min，得到有22个共有峰的玉屏风制剂高效液相指纹图谱。该方法结果可靠，重复性好，但是检测时间非常长，应用于生产活动中对药物进行质量检测非常耗时。

因此，迫切需要一种步骤简单、检测时间短、灵敏有效、可适用于生产活动中的玉屏风颗粒的质量检测方法。

发明内容

本发明旨在提供一种步骤简单、检测时间短、灵敏有效、可适用于生产活动中的玉屏风颗粒的质量检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种玉屏风颗粒的质量检测方法，所述玉屏风颗粒的质量检测包括性状检测、薄层色谱检测、指纹图谱检测和含量限定检测，所述各项检测具体如下：

①、性状检测：浅黄色至棕红色的颗粒，味涩而后甘；

②、薄层色谱检测：以毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷、异黄芪皂苷Ⅰ和异黄芪皂苷Ⅱ为对照品对玉屏风颗粒中的黄芪进行鉴别；以升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷为对照品对玉屏风颗粒中的防风进行鉴别；

③、指纹图谱检测：以超高相液相测定玉屏风颗粒的指纹图谱，以16个共有峰为特征峰对玉屏风颗粒中的黄芪、防风和白术进行鉴别；

④、含量限定检测：采用超高效液相测定玉屏风颗粒中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷含量、毛蕊异黄酮含量、亥茅酚苷、芒柄花素和白术内酯Ⅲ的含量。

进一步地，所述②薄层色谱检测的方法包括以下步骤：

S1、供试品制备：取玉屏风颗粒0.8～1.2g，加入甲醇16～24ml，超声30min，过滤，滤液蒸干后加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取4～5次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，用水洗2～3次，每次40ml，收集乙酸乙酯层蒸干，定容至1ml，作为供试品1溶液；收集上述水层溶液，用水饱和正丁醇萃取4～5次，每次20ml，合并正丁醇层，用正丁醇饱和水溶液洗2～3次，每次40ml，收集正丁醇层蒸干，定容至1ml，作为供试品2；

S2、对照品制备：取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ、升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷溶于甲醇制成含量为1.5～18μg/ml的混合对照品溶液；

S3、薄层检测：取步骤S1所得供试品1、2及步骤S2所得对照品溶液10μl，以三氯甲烷-甲醇-水体积比为(15～25):(5～10):(2～5)的溶液为展开剂，在10℃条件下展开，以10％硫酸乙醇溶液作为显色剂，105℃烘至斑点显色清晰。

更进一步地，所述②薄层色谱检测的方法步骤S3中，以三氯甲烷-甲醇-水体积比为20:8:3的溶液为展开剂。

进一步地，所述③指纹图谱检测和④含量限定检测的方法包括以下步骤：

S1、供试品制备：取玉屏风颗粒粉末0.45～0.55g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇溶液10ml，称重，以250W功率，50KHz频率进行超声处理40～45min，冷却至室温，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品；

S2、对照品溶液制备：分别取升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、白术内酯Ⅲ对照品，精密称定，加甲醇溶解，分别制成升麻素苷480～520μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷400～450μg/ml、升麻素450～520μg/ml、毛蕊异黄酮550～620μg/ml、芒柄花苷500～580μg/ml、芒柄花素245～280μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷520～580μg/ml、亥茅酚苷480～520μg/ml、白术内酯Ⅲ80～120μg/ml的对照品溶液；

S3、混合对照品溶液制备：分别取步骤S2对照品溶液，加甲醇稀释制成含升麻素苷15～20μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10～15μg/ml、升麻素2～5μg/ml、毛蕊异黄酮3～6μg/ml、芒柄花苷2～6μg/ml、芒柄花素1～5μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷12～22μg/ml、亥茅酚苷1～5μg/ml、白术内酯Ⅲ1～5μg/ml的混合对照品溶液；

S4、色谱条件及检测：采用超高效液相色谱，以PDA作为检测器，以规格为1.8μm，2.1×150mm的ACQUITYUPLC@BEH C18作为色谱柱，设置柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为1μl，流速为0.2ml/min，以水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱30min。

更进一步地，所述步骤S4中梯度洗脱的条件为0～7min，流动相A为90～80％；7～18min，流动相A为80～70％；18～27min，流动相A为70～30％；27～30min，流动相A为30％。

进一步地，所述④含量限定检测中升麻素苷含量不得少于为0.15mg/g、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得少于0.15mg/g、升麻素含量不得少于0.03mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量不得少于0.2mg/g、芒柄花苷含量不得少于0.05mg/g、毛蕊异黄酮含量不得少于0.05mg/g、亥茅酚苷含量不得少于0.01mg/g、芒柄花素含量不得少于0.01mg/g、白术内酯Ⅲ含量不得少于0.01mg/g。

本发明中，采用目测、鼻嗅和口尝对玉屏风颗粒的性状进行检测，保证了玉屏风颗粒的感官性状；采用薄层色谱法对黄芪和防风进行鉴定鉴别，可通过一个统一的提取测定方法和相应的对照品鉴定2种药材；采用更加灵敏的超高效液相色谱(UPLC)测定玉屏风颗粒的指纹图谱和相应的含量，可通过对照品鉴别玉屏风颗粒中的黄芪、防风和白术，确定了16个特征峰，建立了玉屏风颗粒的指纹图谱，并且通过方法学考察确定其线性范围，精密度、稳定性、重复性均良好，可作为玉屏风颗粒成分含量的检测方法，精密测定玉屏风颗粒的成分含量。

本发明具有以下优点：

(1)本发明一种玉屏风颗粒的质量检测方法，分别测定了玉屏风颗粒的性状、薄层色谱、指纹图谱和成分含量，步骤少操作简单快捷，显著的减少了检测的时间，非常适用于生产生活中对于玉屏风颗粒的质量监控。

(2)本发明一种玉屏风颗粒的质量检测方法，采用薄层色谱通过一个方法可一次性鉴定黄芪和防风2种中药，准确性高、实用性强；采用超高效液相色谱可统一测定玉屏风颗粒的指纹图谱和成分含量，经过方法学考察，本发明含量测定方法精密度高、稳定性好、重复性优秀，并且显著的减少了分析检测的时间，对玉屏风颗粒质量标准的制定具有重要的意义。

附图说明

图1为供试品1显色后的薄层色谱图，其中：A为毛蕊异黄酮；B为升麻素；C为芒柄花苷；D为黄芪皂苷Ⅰ；E为异黄芪皂苷Ⅰ；F为异黄芪皂苷Ⅱ；G为黄芪皂苷Ⅱ；1～13分别为13批玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号：161015、161027、161201、161213、170308、170312、170526、171102、171219、180111、180203、180507、180515)；S为混合对照品。

图2为供试品2显色后的薄层色谱图，其中：A为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；B为5-O-甲基维斯阿米醇苷；C为升麻素苷；D为黄芪皂苷Ⅲ；E为黄芪甲苷；1～13分别为13批玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号：161015、161027、161201、161213、170308、170312、170526、171102、171219、180111、180203、180507、180515)；S为混合对照品。

图3为流动相体系考察结果图，其中：A为水-乙腈体系流动相；B为0.05％甲酸水溶液-乙腈流动相体系；C为水-甲醇流动相体系。

图4为色谱柱考察结果图，其中：A为色谱柱1 ACQUITY UPLC@BEH C18；B为色谱柱2Phenomenex Luna Omaga；C为色谱柱3 ACQUITYUPLC@HSS T3。

图5为色谱柱柱温考察结果图，其中：A为25℃；B为30℃；C为35℃。

图6为流速考察结果图，其中：A为0.18ml/min；B为0.20ml/min；C为0.22ml/min。

图7为提取溶剂考察结果图，其中：A的提取溶剂为乙醇；B的提取溶剂为水；C的提取溶剂为50％甲醇；D的提取溶剂为75％甲醇；E的提取溶剂为甲醇。

图8为提取方式考察结果图，其中：A为超声提取；B为回流提取。

图9为提取量考察结果图，其中：A的样品提取量为0.5g；B的样品提取量为1g；C的样品提取量为2g。

图10为提取时间考察结果图，其中：A的提取时间为30min；B的提取时间为45min；C的提取时间为60min。

图11为单味药材颗粒和玉屏风颗粒的UPLC指纹图谱，其中，A为白术单味药材颗粒图谱；B为防风单味药材颗粒图谱；C为黄芪单味药材颗粒图谱；D为玉屏风颗粒指纹图谱。

图12为玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102、171219、180111、180203)的指纹图谱，其中：A为批号171102的玉屏风颗粒；B为批号171219的玉屏风颗粒；C为批号180111的玉屏风颗粒；D为批号为180203的玉屏风颗粒；E为混合对照品溶液。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

其中所用试剂均为常用试剂，均可购于常规试剂生产销售公司，对照品均购于北京中科质检生物技术有限公司。

实施例1一种玉屏风颗粒的质量检测方法

1.性状检测

1.1检测方法：目测、鼻嗅和口尝。

1.2检测指标：浅黄色至棕红色的颗粒，味涩而后甘。

1.3检测对象：13批玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号(161015、161027、161201、161213、170308、170312、170526、171102、171219、180111、180203、180507、180515)。

1.4检测结果：均符合指标限定。

2.薄层色谱检测

2.1检测材料：13批玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号(161015、161027、161201、161213、170308、170312、170526、171102、171219、180111、180203、180507、180515)。

2.2检测步骤：

S1、供试品制备：取玉屏风颗粒1g，加入甲醇20ml，超声30min，过滤，滤液蒸干后加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，用水洗2次，每次40ml，收集乙酸乙酯层蒸干，定容至1ml，作为供试品1溶液；收集上述水层溶液，用水饱和正丁醇萃取4次，每次20ml，合并正丁醇层，用正丁醇饱和水溶液洗2次，每次40ml，收集正丁醇层蒸干，定容至1ml，作为供试品2；

S2、对照品制备：取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ、升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷溶于甲醇，制成含毛蕊异黄酮5μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷15μg/ml、芒柄花苷1.5μg/ml、黄芪皂苷Ⅰ15μg/ml、黄芪皂苷Ⅱ5μg/ml、黄芪皂苷Ⅲ5μg/ml、黄芪甲苷2μg/ml、异黄芪皂苷Ⅰ5μg/ml、异黄芪皂苷Ⅱ5μg/ml、升麻素5μg/ml、升麻素苷16μg/ml和5-O-甲基维斯阿米醇苷16μg/ml的混合对照品溶液；

S3、薄层检测：取步骤S1所得供试品1、2及步骤S2所得对照品溶液10μl，以三氯甲烷-甲醇-水体积比为20:8:3的溶液为展开剂，在10℃条件下展开，以10％硫酸乙醇溶液作为显色剂，105℃烘至斑点显色清晰。

2.3检测结果：

检测结果参见图1和图2，由图1可见，供试品1色谱中，在毛蕊异黄酮、升麻素、芒柄花苷、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅱ对照品相应的位置上，13批次玉屏风颗粒样品均显现相同颜色的斑点；由图2可见，供试品2色谱中，在毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪甲苷对照品相应的位置上，13批次玉屏风颗粒样品显现相同颜色的斑点，说明供试品玉屏风制剂均含有黄芪和防风成分。

3.指纹图谱检测

3.1检测方法条件筛选

3.1.1流动相体系考察：

取玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102)粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇溶液10ml，称重，以250W功率，50KHz频率进行超声处理45min，冷却至室温，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品；采用超高效液相色谱，以PDA作为检测器，以规格为1.8μm，2.1×150mm的ACQUITYUPLC@BEHC18作为色谱柱，设置柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为1μl，流速为0.2ml/min，分别采用表1和表2所示不同流动相体系及洗脱梯度进行检测。

表1流动相体系筛选

组别	1	2	3
				流动相A	水	0.05％甲酸水溶液	水
流动相B	乙腈	乙腈	甲醇

表2流动相及洗脱梯度

考察结果：试验结果参见图3，由图3可见，第1组体系以水-乙腈作为流动相所得色谱图各色谱峰分离度高，基线稳定，分离时间短，作为最终的色谱条件。

3.1.2色谱柱考察

取3.1.1流动相体系选择检测方法制备的供试品，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别采用色谱柱1：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.8μm，2.1×150mm)；色谱柱2：Phenomenex Luna Omaga(1.8μm，2.1×150mm)；色谱柱3：ACQUITYUPLC@HSS T3(1.8μm，2.1×150mm)，参考3.1.1流动相体系选择检测方法进行检测。

考察结果：试验结果参见图4，由图4可见，色谱柱1所得色谱图各色谱峰分离度高，峰较分散，基线较平稳，作为最终的色谱条件。

3.1.3色谱柱温考察

取3.1.1流动相体系选择检测方法制备的供试品，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别设置柱温为25、30、35℃参考3.1.1流动相体系选择检测方法进行检测。

考察结果：试验结果参见图5，由图5可见，在30℃条件下所得色谱图各色谱峰分离度高，可控性强，作为最终的色谱条件。

3.1.4色谱柱流速考察

取3.1.1流动相体系选择检测方法制备的供试品，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别设置流速为0.22、0.2、0.18ml/min参考3.1.1流动相体系选择检测方法进行检测。

考察结果：试验结果参见图6，由图6可见，流速为0.2ml/min所得色谱图各色谱峰分离度高，作为最终的色谱条件。

3.1.5提取溶剂考察

参考3.1.1流动相体系选择检测方法，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别采用乙醇、水、50％甲醇、75％甲醇和甲醇对玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102)进行提取检测。

考察结果：试验结果参见图7，由图7可见，75％甲醇提取所得色谱图色谱峰数量较多，各色谱峰分离度高，作为最终的提取条件。

3.1.6提取方式考察

参考3.1.1流动相体系选择检测方法，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别超声和回流对玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102)进行提取检测。

考察结果：试验结果参见图8，由图8可见，超声和回流提取所得色谱图没有显著的差别，考虑提取效率，选择超声提取作为最终的提取条件。

3.1.7提取量考察

参考3.1.1流动相体系选择检测方法，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别称取0.5、1、2g玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102)进行提取检测。

考察结果：试验结果参见图9，由图9可见，称量1g玉屏风颗粒提取所得色谱图峰面积大小适中，容易操作，作为最终的提取条件。

3.1.8提取时间考察

参考3.1.1流动相体系选择检测方法，以水-乙腈体系为流动相，以表2洗脱梯度，分别取玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102)提取30、45、60min后进行检测。

考察结果：试验结果参见图10，由图10可见，玉屏风颗粒经过45min提取已提取完全，作为最终的提取条件。

3.2样品检测：

S1、供试品制备：取玉屏风颗粒(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102、171219、180111、180203)粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇溶液10ml，称重，以250W功率，50KHz频率进行超声处理45min，冷却至室温，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品1～4；分别取黄芪、炒白术和防风药材粉末，按处方比例及制剂工艺制备成单味药材颗粒粉末，同上述玉屏风颗粒粉末提取得供试品5～7；

S2、对照品溶液制备：分别取升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、白术内酯Ⅲ对照品，精密称定，加甲醇溶解，分别制成升麻素苷502.23μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷431.04μg/ml、升麻素506.37μg/ml、毛蕊异黄酮591.21μg/ml、芒柄花苷551.17μg/ml、芒柄花素260.53μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷540.00μg/ml、亥茅酚苷502.23μg/ml、白术内酯Ⅲ98.00μg/ml的对照品溶液；

S3、混合对照品溶液制备：分别取步骤S2对照品溶液，加甲醇制成含升麻素苷16.569μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷13.966μg/ml、升麻素3.008μg/ml、毛蕊异黄酮4.257μg/ml、芒柄花苷3.969μg/ml、芒柄花素1.548μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷17.496μg/ml、亥茅酚苷2.259μg/ml、白术内酯Ⅲ1.544μg/ml的混合对照品溶液；

S4、色谱条件及检测：采用超高效液相色谱，以PDA作为检测器，以规格为1.8μm，2.1×150mm的ACQUITY UPLC@BEH C18作为色谱柱，设置柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为1μl，流速为0.2ml/min，以水为流动相A，乙腈为流动相B，参照表2梯度洗脱30min。

3.3检测结果

参见图11和图12，由图11可见，供试品1玉屏风颗粒所得指纹图谱中可标定16个共有峰，对比单味药材供试品2～4可知，其中1、3、6、8、9、11、13、14、15号峰来自黄芪药材，2、4、5、7、10号峰来自防风药材，16号峰来自炒白术药材。通过与混合对照品图谱对比，其中2号峰为升麻素苷、3号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、4号峰为升麻素、5号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷、6号峰为芒柄花苷、9号峰为毛蕊异黄酮、10号峰为亥茅酚苷、13号峰为芒柄花素、16号峰为白术内酯Ⅲ。

4.含量限定检测

4.1方法学考察

4.1.1线性范围考察

分别精密吸取3.2样品检测步骤S3制备的混合对照品溶液0.5、0.75、1.25、1.5、1.75ml定容至2ml，按3.2样品检测步骤S4色谱条件进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，具体数据参见表3。

表3对照品线性范围

成分	回归方程	R	线性范围(ng)
				升麻素苷	Y＝1.60×10<sup>4</sup>X-3.69×10<sup>3</sup>	0.9999	4.142～14.497
毛蕊异黄酮葡萄糖苷	Y＝2.12×10<sup>4</sup>X-4.76×10<sup>3</sup>	0.9999	3.492～12.220
				升麻素	Y＝2.47×10<sup>4</sup>X-8.67×10<sup>2</sup>	0.9998	0.752～2.632
5-O-甲基维斯阿米醇苷	Y＝1.42×10<sup>4</sup>X-3.17×10<sup>3</sup>	0.9998	4.374～14.497
				芒柄花苷	Y＝1.38×10<sup>4</sup>X-8.41×10<sup>2</sup>	0.9999	0.992～3.743
毛蕊异黄酮	Y＝2.67×10<sup>4</sup>X-5.66×10<sup>3</sup>	0.9998	1.064～3.725
				亥茅酚苷	Y＝1.32×10<sup>4</sup>X-1.56×10<sup>3</sup>	0.9997	0.565～1.976
芒柄花素	Y＝1.88×10<sup>4</sup>X-1.01×10<sup>3</sup>	0.9999	0.387～1.354
				白术内酯Ⅲ	Y＝1.49×10<sup>4</sup>X-6.61×10<sup>2</sup>	0.9997	0.386～1.341

4.1.2精密度考察

取3.2样品检测步骤S1制备的供试品1按3.2样品检测步骤S4色谱条件，连续进样6针进行测定，积分计算升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花素和白术内酯Ⅲ的峰面积及6次进样的RSD，具体数据参见表4。

表4精密度试验结果

由表4可见，连续进样6次各成分峰面积的RSD<2％，说明仪器精密度良好。

4.1.3稳定性考察

取3.2样品检测步骤S1制备的供试品1按3.2样品检测步骤S4色谱条件，分别于0、1、2、4、6、8、12h进样，积分计算升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花素和白术内酯Ⅲ的峰面积及7次进样的RSD，具体数据参见表5。

表5稳定性试验结果

由表5可见，1～12h样品的成分峰面积RSD<2％，说明样品溶液在12h内保持稳定。

4.1.4重复性考察

参考3.2样品检测步骤S1～S4平行制备6份玉屏风颗粒样品(国药集团广东环球制药有限公司，批号171102)并检测，积分计算其升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花素和白术内酯Ⅲ的含量及6份平行试验的RSD，具体数据参见表6。

表6重复性试验结果

由表6可见，本发明平行制备的6份玉屏风颗粒检测结果RSD<2％，个别峰稍大于3％，说明本发明方法重复性好。

4.2样品含量测定

参考3.2样品检测步骤S1～S4对4个批次的玉屏风颗粒样品(批号171102、171219、180111、180203)进行检测，积分计算其升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花素和白术内酯Ⅲ的含量，具体数据参见表7。

表7各批次玉屏风颗粒含量测定结果

由表7可见，玉屏风颗粒升麻素苷含量在0.2314～0.2760mg/g之间、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量在0.2196～0.2860mg/g之间、升麻素含量在0.0684～0.1073mg/g之间、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量在0.2998～0.3548mg/g之间、芒柄花苷含量在0.0747～0.1029mg/g之间、毛蕊异黄酮含量在0.0832～0.1071mg/g之间、亥茅酚苷含量在0.0278～0.0364mg/g之间、芒柄花素含量在0.0287～0.0349mg/g之间、白术内酯Ⅲ含量在0.0320～0.0440mg/g之间。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种玉屏风颗粒的检测方法，其特征在于，所述玉屏风颗粒的检测包括性状检测、薄层色谱检测、指纹图谱检测和含量限定检测，各项检测具体如下：

①、性状检测：浅黄色至棕红色的颗粒，味涩而后甘；

③、指纹图谱检测：以超高效液相色谱测定玉屏风颗粒的指纹图谱，以16个共有峰为特征峰对玉屏风颗粒中的黄芪、防风和白术进行鉴别；

④、含量限定检测：采用超高效液相色谱测定玉屏风颗粒中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷含量、毛蕊异黄酮含量、亥茅酚苷、芒柄花素和白术内酯Ⅲ的含量；

其中，所述②薄层色谱检测的方法包括以下步骤：

S1、供试品制备：取玉屏风颗粒0.8～1.2g，加入甲醇16～24ml，超声30min，过滤，滤液蒸干后加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取4～5次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，用水洗2～3次，每次40ml，收集乙酸乙酯层蒸干，定容至1ml，作为供试品1溶液；收集水层溶液，用水饱和正丁醇萃取4～5次，每次20ml，合并正丁醇层，用正丁醇饱和水溶液洗2～3次，每次40ml，收集正丁醇层蒸干，定容至1ml，作为供试品2；

S3、薄层检测：取步骤S1所得供试品1、2及步骤S2所得对照品溶液10μl，以三氯甲烷-甲醇-水体积比为(15～25):(5～10):(2～5)的溶液为展开剂，在10℃条件下展开，以10％硫酸乙醇溶液作为显色剂，105℃烘至斑点显色清晰；

所述③指纹图谱检测和④含量限定检测中，超高效液相色谱的条件为：采用超高效液相色谱，以PDA作为检测器，以规格为1.8μm，2.1×150mm的ACQUITY UPLC^@BEH C18作为色谱柱，设置柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为1μl，流速为0.2ml/min，以水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱的条件为0～7min，流动相A为90～80％；7～18min，流动相A为80～70％；18～27min，流动相A为70～30％；27～30min，流动相A为30％。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述②薄层色谱检测的方法步骤S3中，以三氯甲烷-甲醇-水体积比为20:8:3的溶液为展开剂。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述③指纹图谱检测和④含量限定检测的方法包括以下步骤：

S4、色谱条件及检测：采用超高效液相色谱，以PDA作为检测器，以规格为1.8μm，2.1×150mm的ACQUITY UPLC^@BEH C18作为色谱柱，设置柱温为30℃，检测波长为220nm，进样量为1μl，流速为0.2ml/min，以水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱30min。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述④含量限定检测中升麻素苷含量不得少于为0.15mg/g、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得少于0.15mg/g、升麻素含量不得少于0.03mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量不得少于0.2mg/g、芒柄花苷含量不得少于0.05mg/g、毛蕊异黄酮含量不得少于0.05mg/g、亥茅酚苷含量不得少于0.01mg/g、芒柄花素含量不得少于0.01mg/g、白术内酯Ⅲ含量不得少于0.01mg/g。