CN106290645A

CN106290645A - 一种拉萨大黄指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

Info

Publication number: CN106290645A
Application number: CN201610707411.3A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 龚云麒; 方芳; 杨兆祥
Original assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Current assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-08-23
Filing date: 2016-08-23
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2036-08-23
Also published as: CN106290645B

Abstract

本发明提供拉萨大黄指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。通过十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱对拉萨大黄样品进行高效液相色谱分析，以曲札茋苷为参照峰构建指纹图谱，在此基础上对指纹图谱进行评价。得到的拉萨大黄指纹图谱能够全面、系统、特征性地反映拉萨大黄中的组成成分，能够全面有效地评价拉萨大黄的质量，客观反映产品的真伪优劣，有利于产品质量监控。该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。

Description

一种拉萨大黄指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

技术领域

本发明属于中药分析领域，尤其涉及一种拉萨大黄指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。

背景技术

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制和评价中药材或中成药的质量具有重要的意义。

拉萨大黄为蓼科植物拉萨大黄Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao的干燥根及根茎，收载于《西藏植物志》，具有泻热毒，破积滞，行瘀血等功效，用于治疗食积腹胀，水火烫伤，口舌生疮。野生拉萨大黄主产于我国产西藏中部偏东，海拔4200～4600米山坡草地。

现代研究表明，拉萨大黄含有丰富的二苯乙烯苷类化合物，曲札茋苷是其代表性成分和特征性成分(中国专利，授权公告号CN102659861B)。昆药集团股份有限公司研究证实，曲札茋苷具有抗氧化清除自由基、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、舒张血管等多方面的活性。因此，拉萨大黄有较高的开发利用价值和广阔的应用前景。

目前为止，针对拉萨大黄的质量评价研究尚不充分，标准的缺失成为制约拉萨大黄产业化的关键问题和瓶颈问题。安利贞等用超高效液相色谱法建立了拉萨大黄中虎杖苷、甲基虎杖苷、曲札茋苷的含量测定方法(安利贞等，超高效液相色谱法测定拉萨大黄中三种化学成分的含量，云南中医学院学报，2013，36(1)：31-34.)，但其质量评价的方法局限于数个指标成分的含量测定，难以全面反映药材质量。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种符合拉萨大黄特点的指纹图谱构建方法及其标准指纹图谱，本发明提供的指纹图谱能够全面、有效的评价拉萨大黄的质量。

本发明提供了一种拉萨大黄指纹图谱的建立方法，包括：

将拉萨大黄制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，以曲札茋苷作为参照峰，得到拉萨大黄指纹图谱；

所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料。

优选的，所述高效液相色谱检测的流动相包括有机相与水相；所述有机相为乙腈；所述水相为磷酸水溶液、甲酸水溶液或水。

优选的，所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.01％～3％；所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.01％～3％。

优选的，所述流动相的洗脱为梯度洗脱；所述梯度洗脱中，以有机相作为A相，以水相作为B相，洗脱程序为：0～18min，15～20％A；18～30min，20～30％A；30～45min，30～50％A；45～50min，50～30％A；50～55min，30～15％A。

优选的，所述检测的流速为0.3～1.5ml/min。

优选的，所述检测的波长为220～390nm。

优选的，所述色谱柱的柱温为10℃～45℃。

本发明还提供了一种拉萨大黄的标准指纹图谱，以曲札茋苷作为参照峰，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08。

优选的，以曲札茋苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627。

优选的，所述相对保留时间为1.157±0.08与1.972±0.08的峰对应的化合物依次为虎杖苷与去氧土大黄苷。

与现有技术相比，本发明提供的拉萨大黄指纹图谱的构建方法，即通过十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱对拉萨大黄样品进行高效液相色谱分析，以曲札茋苷作为参照峰构建指纹图谱，在此基础上对指纹图谱进行评价。该方法符合拉萨大黄组成成分的特点，供试品溶液制备简单，色谱条件容易实现。得到的拉萨大黄指纹图谱能够全面、系统、特征性地反应拉萨大黄中的组成成分，能够全面有效的评价拉萨大黄的质量，可客观地反映产品的真伪优劣，有利于产品质量监控。该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。

本发明提供的标准指纹图谱以曲札茋苷作为参照峰，即使其相对保留时间为1.00，进而确定指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08，以曲札茋苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627，使得得到的指纹图谱能够全面有效的评价拉萨大黄的质量。

附图说明

图1为本发明提供的16批拉萨大黄药材指纹图谱；

图2为本发明提供的拉萨大黄的标准指纹图谱；

图3为曲札茋苷对照品、虎杖苷对照品、去氧土大黄苷对照品与拉萨大黄供试品色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种拉萨大黄指纹图谱的建立方法，包括：

将拉萨大黄制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，以曲札茋苷作为参照峰，得到拉萨大黄指纹图谱；其中，所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料。

按照本发明，所述拉萨大黄制备的供试品溶液优选按照以下方法制备：将拉萨大黄用提取液提取，过滤后，得到供试品溶液；所述提取液为本领域技术人员熟知的提取液即可，并无特殊的限制，本发明中优选提取溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液或水；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为70％～80％，再优选为75％；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为70％～80％，再优选为75％；所述拉萨大黄与提取液的比例优选为1g：(10～1000)ml，更优选为1g：(100～800)ml，再优选为1g：(300～700)ml，最优选为1g：(400～600)ml；所述提取的时间优选为20min～8h，更优选为20min～4h，再优选为20min～2h，再优选为20min～60min，再优选为30min～50min，最优选为30min～40min；所述提取的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选为超声提取。本发明提供的供试品溶液制备简单。

将拉萨大黄的供试品溶液通过高效液相色谱检测，以曲札茋苷作为参照峰，得到拉萨大黄指纹图谱；其中，所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，优选为Grace Apollo C₁₈column、Phenomenex Luna Su C₁₈(2)column或AgilentZORBAX Eclipse Plus C₁₈column；所述色谱柱的规格优选为250mm×4.6mm,5μm；所述高效液相色谱检测的进样量优选为0.5～40μl，更优选为1～20μl，再优选为5～20μl，再优选为10～20μl，最优选为10～15μl。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的流动相优选包括有机相与水相；所述有机相为乙腈；所述水相为磷酸水溶液、甲酸水溶液或水。其中，所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数优选为0.01％～3％，更优选为0.01％～2％，再优选为0.05％～1％，再优选为0.05％～0.5％，最优选为0.1％～0.5％；在本发明提供的一些实施例中，所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数优选为0.1％；所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数优选为0.01％～3％，更优选为0.01％～2％，再优选为0.05％～1％，再优选为0.05％～0.5％，最优选为0.1％～0.5％。

所述流动相的洗脱优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱的时间优选为20～180min，更优选为30～150min，再优选为40～120min，再优选为40～100min，最优选为40～60min；在本发明中，所述梯度洗脱中，以有机相作为A相，以水相作为B相，洗脱程序优选为：0～18min，15～20％A；18～30min，20～30％A；30～45min，30～50％A；45～50min，50～30％A；50～55min，30～15％A；所述检测的流速优选为0.3～1.5ml/min，更优选为0.5～1.5ml/min，再优选为0.8～1.5ml/min，再优选为0.8～1.2ml/min，最优选为1.0ml/min；所述检测优选采用紫外检测器检测；所述检测的波长优选为220～390nm，更优选为254～365nm，更优选为270～325nm，更优选为315～325nm，最优选为319nm；所述检测时色谱柱的柱温优选为10℃～45℃，更优选为10℃～40℃，再优选为20℃～35℃，再优选为20℃～30℃，最优选为20℃～25℃；在本发明提供的一些实施例中，所述检测时色谱柱的柱温优选为20℃。

其中，洗脱程序中，％A指的是体积比，如15～20％A是指每100ml洗脱剂中含有15～20ml的A。

按照本发明，所述参照峰曲札茋苷的确定优选为与曲札茋苷对照品溶液色谱图对照保留时间的方法确定；所述曲札茋苷对照品溶液优选按照以下方法制备：将曲札茋苷与甲醇水溶液混合，得到曲札茋苷对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为50％～90％，再优选为60％～80％，再优选为70％～80％，最优选为75％；所述曲札茋苷对照品溶液中曲札茋苷的浓度优选为10～1000μg/ml，更优选为10～800μg/ml，再优选为50～500μg/ml，再优选为50～200μg/ml，再优选为50～150μg/ml，最优选为100μg/ml。

为提高拉萨大黄指纹图谱的准确性，优选还加入虎杖苷对照品溶液和/或去氧土大黄苷对照品溶液。

所述虎杖苷对照品溶液优选按照以下方法制备：将虎杖苷与甲醇水溶液混合，得到虎杖苷对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为50％～90％，再优选为60％～80％，再优选为70％～80％，最优选为75％；所述虎杖苷对照品溶液中虎杖苷的浓度优选为10～1000μg/ml，更优选为10～800μg/ml，再优选为50～500μg/ml，再优选为50～200μg/ml，再优选为50～150μg/ml，最优选为100μg/ml。

所述去氧土大黄苷对照品溶液优选按照以下方法制备：将去氧土大黄苷与甲醇水溶液混合，得到去氧土大黄苷对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为50％～90％，再优选为60％～80％，再优选为70％～80％，最优选为75％；所述去氧土大黄苷对照品溶液中去氧土大黄苷的浓度优选为10～1000μg/ml，更优选为10～800μg/ml，再优选为50～500μg/ml，再优选为50～200μg/ml，再优选为50～150μg/ml，最优选为100μg/ml。

此外，本发明优选根据10批次以上代表性供试品的检测结果，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成拉萨大黄的标准指纹图谱；本发明优选将供试品指纹图谱采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价。

按照本发明，优选地，所述拉萨大黄指纹图谱按照以下方法建立：

(1)对照品溶液的制备：

曲札茋苷对照品溶液的制备：精密称取曲札茋苷对照品适量，用50％～100％甲醇(体积百分比，以下甲醇浓度均为体积百分比)，优选75％甲醇，配制成每1ml含曲札茋苷10～1000μg的溶液，优选每1ml含曲札茋苷100μg。

虎杖苷对照品溶液的制备：精密称取虎杖苷对照品适量，用50％～100％甲醇，优选75％甲醇，配制成每1ml含和虎杖苷10～1000μg的溶液，优选每1ml含曲札茋苷100μg。

去氧土大黄苷对照品溶液的制备：精密称取去氧土大黄苷对照品适量，用50％～100％甲醇，优选75％甲醇，配制成每1ml含去氧土大黄苷10～1000μg的溶液，优选每1ml含曲札茋苷100μg。

(2)供试品溶液的制备：精密称取拉萨大黄0.01～5g，用甲醇-水或乙醇-水或水提取，药材与提取液的比例为1g：(10～1000)ml，提取时间为20分钟～8小时，提取液滤过，滤液作为供试品溶液。

(3)高效液相色谱仪进样量0.5～40μl，采用高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，梯度洗脱的流动相A为乙腈，流动相B为0.01％～3％(体积百分比)磷酸水溶液或0.01％～3％(体积百分比)甲酸水溶液或水；梯度洗脱时间为20～180min，流速0.3～1.5ml/min；柱温10℃～45℃；紫外检测波长220～390nm。

(4)标准指纹图谱的建立：根据10批次以上代表性供试品的检测结果，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成拉萨大黄的标准指纹图谱。所述的代表性供试品需为专家鉴定质量合格且相互独立的药材样本。

(5)相似度评价：供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度需大于0.90。

更优选地，上述步骤(2)按照以下方法进行：取拉萨大黄粉末置具塞锥形瓶中，按照拉萨大黄与提取液1g：500ml的比例精密加入75％甲醇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

更优选地，上述步骤(3)中梯度洗脱程序如表1所示进行。

表1梯度洗脱程序表

更优选地，所述拉萨大黄指纹图谱按照以下方法建立：

(1)对照品溶液的制备：

曲札茋苷对照品溶液的制备：精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，即为曲札茋苷对照品溶液。

虎杖苷对照品溶液的制备：精密称取虎杖苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，即为虎杖苷对照品溶液。

去氧土大黄苷对照品溶液的制备：精密称取去氧土大黄苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，即为去氧土大黄苷对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：精密称取拉萨大黄粉末(过三号筛)0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，超声处理(功率250w，频率35kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(3)采用高效液相色谱法进行测定：分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录55分钟色谱图，即得。色谱条件：色谱柱：Grace ApolloC₁₈column(250mm×4.6mm,5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；流速：1.0ml/min；紫外检测波长：319nm；柱温：20℃；按表1的洗脱程序进行梯度洗脱。

用前述拉萨大黄指纹图谱的实验方法建立12批次代表性拉萨大黄样品的HPLC指纹图谱，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成拉萨大黄标准指纹图谱，其中有9个共有峰，峰号依次记为1～9号。在标准指纹图谱中，以1号峰(曲札茋苷)为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±0.08之内，所述第一规定值分别为：1.000(1号峰)、1.157(2号峰)、1.322(3号峰)、1.440(4号峰)、1.467(5号峰)、1.664(6号峰)、1.972(7号峰)、2.059(8号峰)、2.493(9号峰)。其中1号峰为曲札茋苷，2号峰为虎杖苷，7号峰为去氧土大黄苷。这些共有特征峰构成了拉萨大黄的HPLC指纹图谱，可作为拉萨大黄的标准指纹图谱。

本发明提供的拉萨大黄指纹图谱的构建方法，通过在高效液相色谱检测时以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以曲札茋苷作为参照峰构建指纹图谱，使得得到的拉萨大黄指纹图谱能够全面、系统、特征性地反应拉萨大黄中的组成成分，能够全面有效的评价拉萨大黄的质量，可客观的反映产品的真伪优劣，有利于产品质量监控。该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。

本发明还提供了一种拉萨大黄标准指纹图谱，以曲札茋苷作为参照峰，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08；优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.03、1.322±0.03、1.440±0.03、1.467±0.03、1.664±0.03、1.972±0.03、2.059±0.03、2.493±0.03；更优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.01、1.322±0.01、1.440±0.01、1.467±0.01、1.664±0.01、1.972±0.01、2.059±0.01、2.493±0.01；在本发明的一些实施例中，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157、1.322、1.440、1.467、1.664、1.972、2.059、2.493。

以曲札茋苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627；优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.024～0.418、0.003～0.644、0.010～0.558、0.006～0.300、0.021～0.308、0.193～1.892、0.003～0.462、0.002～0.418；更优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.048～0.209、0.006～0.322、0.020～0.279、0.011～0.150、0.042～0.154、0.386～0.946、0.005～0.231、0.004～0.209；在本发明的一些实施例中，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.048～0.209、0.006～0.322、0.020～0.279、0.011～0.150、0.042～0.154、0.386～0.946、0.005～0.231、0.004～0.209。

优选的，所述相对保留时间为1.157±0.08与1.972±0.08的峰对应的化合物依次为虎杖苷与去氧土大黄甘。

本发明提供的指纹图谱通过选择以曲札茋苷作为参照峰，即使其相对保留时间为1.00，进而确定指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08，以曲札茋苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627，使得得到的指纹图谱能够全面有效的评价拉萨大黄的质量。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1仪器与材料

1.1主要仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器)(安捷伦公司)、CP225D分析天平(Sartorius公司)、BP221S分析天平(Sartorius公司)、Milli-Q超纯水机(Millipore公司)、5510E-DTH超声波清洗器(美国必能信公司)、BuchiR-3旋转蒸发仪(Buchi公司)。

1.2实验材料

试剂：色谱纯乙腈(德国默克股份两合公司)、色谱纯甲醇(德国默克股份两合公司)、色谱纯乙醇(赛默飞世尔科技有限公司)、甲酸(分析纯)、磷酸(分析纯)、超纯水、曲札茋苷(昆药集团股份有限公司药物研究院自制，纯度≥98％)、虎杖苷(昆药集团股份有限公司药物研究院自制，纯度≥98％)、去氧土大黄苷(昆药集团股份有限公司药物研究院自制，纯度≥98％)。

色谱柱：

Grace Apollo C₁₈column(250mm×4.6mm,5μm)

Phenomenex Luna Su C₁₈(2)column(250mm×4.60mm,5μm)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈column(250mm×4.60mm,5μm)

数据处理软件：

国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)。

2药材的收集与鉴定

共收集拉萨大黄药材16批，样品情况见表2。

表2 16批拉萨大黄药材信息表

3供试品溶液和对照品溶液的制备

以主要色谱峰的提取率为指标，对提取方法(超声提取40分钟、回流提取5小时、索氏提取8小时)进行了考察，结果表明用超声作为提取方法的提取率较高，且前处理时间较短，故优选超声作为提取方式。

以主要色谱峰的提取率为指标，对提取溶剂(水、50％乙醇、75％乙醇、90％乙醇、乙醇、50％甲醇、75％甲醇、90％甲醇、甲醇)进行了考察，结果表明用含甲醇的溶剂提取率较高，为兼顾不同极性成分的提取效率，优选75％甲醇作为提取溶剂。

以主要色谱峰的提取率为指标，对超声提取时间(20分钟、30分钟、45分钟、60分钟)进行了考察，结果表明四种不同提取时间得到的结果无明显差异，为确保提取完全，兼顾提取效率，优选超声提取30分钟。

以主要色谱峰的提取率为指标，对超声提取溶剂(75％甲醇)体积进行了考察(25ml、50ml和75ml)，结果显示对于0.1g药材，50ml溶剂提取一次即可提取完全，优选75％的甲醇50ml提取一次。

基于以上研究，规定供试品溶液制备条件如下：

取本品粉末(过三号筛)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黄苷可溶于不同比例的50％～100％甲醇，考虑到与药材提取溶剂一致，优选75％甲醇。不同对照品溶液浓度(10～1000μg/ml)配合不同进样量(0.5～40μl)均可满足分析要求。兼顾信号强度与对照品用量，优选曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黄苷对照品溶液浓度均为100μg/ml(即0.1mg/ml)。曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黄苷对光照敏感，优选棕色容量瓶。因此规定对照品溶液的制备方法：精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，即为曲札茋苷对照品溶液。精密称取虎杖苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，即为虎杖苷对照品溶液。精密称取去氧土大黄苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，即为去氧土大黄苷对照品溶液。

4色谱条件

色谱柱考察：为保证分析方法的通用性，本发明采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的(C₁₈)色谱柱，对多个厂家(Grace、Phenomenex、Agilent等)的C₁₈色谱柱进行了考察，结果显示不同厂家的C₁₈色谱柱均能满足分析要求，方法重现性良好，以Grace ApolloC₁₈column(250mm×4.6mm，5μm)为最佳。

流动相选择：对流动相组成进行了考察(乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-甲酸-水)，因拉萨大黄成分复杂，梯度洗脱效果好于等度洗脱，磷酸和甲酸的加入有利于改善峰形。在此基础上，考察了不同浓度(0.01％～3％，体积百分比)的磷酸-水和甲酸-水对分离效果的影响，以0.1％磷酸-水为最佳。

检测波长的选择：本研究采用二极管阵列紫外检测器对检测波长(210～400nm)进行了考察，220～390nm各主要色谱峰均有一定的吸收，319nm的色图谱中峰面积普遍较大，色谱峰较多，同时各色谱峰分离较好，因此优选319nm作为检测波长。

此外对流速(0.3～1.5ml/min)、柱温(10℃～45℃)、进样量(0.5～40μl)进行了考察和优化。

综合以上研究，规定色谱条件为：

Grace Apollo C₁₈column(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；流速：1.0ml/min；紫外检测波长：319nm；柱温：20℃；按表1的洗脱程序进行梯度洗脱。

分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录55分钟色谱图，即得。

5方法学考察

5.1精密度考察

取同一批号样品(批号：S16)，根据供试品溶液制备方法的规定制备供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法连续进样6次，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中数法生成参照指纹图谱(R)，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。各色谱图的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，方法的精密度良好。

5.2重复性考察

取同一批号样品(批号：S16)，根据供试品溶液制备方法的规定平行制备6份供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法进样分析，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中数法生成参照指纹图谱(R)，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度，各色谱图的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，方法的重复性良好。

5.3稳定性考察

取同一份批号样品(批号：S16)，根据供试品溶液制备方法的规定制备供试品溶液，分别于制备后的0、1、2、3、9、22、26、39h按照色谱条件规定的分析方法进样分析，采将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中数法生成参照指纹图谱(R)，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度，各色谱图的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，样品于39h内稳定。

以上方法学考察表明：目前建立的指纹图谱操作方法可行，适合拉萨大黄药材指纹图谱的建立和分析。

6拉萨大黄药材对照图谱的建立

取不同批次拉萨大黄药材共16批(样品详情见表2)，分别按照已建立的拉萨大黄指纹图谱分析方法进行分析，得到各批药材的HPLC指纹图谱，结果见图1。

上述16批拉萨大黄药材中，批次S1～S5、S7～S12和S16的样品(共12批)来源确切，经专家鉴定质量合格，且为相互独立的药材样本，可作为代表性样品。因此以上述12批次样品的色谱指纹图谱为基础，使用药典会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.130723进行数据处理得到共有模式指纹图谱，即为拉萨大黄标准指纹图谱，如图2所示。

通过比较12批药材的色谱图，确定了9个共有峰。在标准指纹图谱中，以1号峰(曲札茋苷)为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，分别为：1.000(1号峰)、1.157(2号峰)、1.322(3号峰)、1.440(4号峰)、1.467(5号峰)、1.664(6号峰)、1.972(7号峰)、2.059(8号峰)、2.493(9号峰)。通过与对照品对照保留时间，确定1号峰为曲札茋苷，2号峰为虎杖苷，7号峰为去氧土大黄苷。

16批拉萨大黄药材指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别见表3和表4。

表3 16批拉萨大黄药材指纹图谱共有峰的相对保留时间

表4 16批拉萨大黄药材指纹图谱共有峰的相对峰面积

以拉萨大黄标准指纹图谱为参照，分别计算16批药材的相似度，结果见表2。所有代表性样品(S1～S5、S7～S12和S16，共12批)与标准指纹图谱的相似度均在0.90以上。

批次S6、S13～S15(共4批)为引种栽培样品，为综合评价其质量，以拉萨大黄标准指纹图谱为参照，对批次S6、S13～S15样品的指纹图谱进行了相似度分析，分析结果见表5。结果显示上述样品的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度均在0.90以上，和代表性样品的化学成分相似，具有较好的化学等同性。

表5 16批拉萨大黄药材指纹图谱的相似度分析结果

R为拉萨大黄标准指纹图谱。

以上研究表明本发明有良好的精密度、重复性和稳定性，有良好的实用性，能够用于拉萨大黄的综合质量控制。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种拉萨大黄指纹图谱的建立方法，包括：

将拉萨大黄制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，以曲札茋苷作为参照峰，建立拉萨大黄指纹图谱；

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的流动相包括有机相与水相；所述有机相为乙腈；所述水相为磷酸水溶液、甲酸水溶液或水。

3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.01％～3％；所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.01％～3％。

4.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述流动相的洗脱为梯度洗脱；所述梯度洗脱中，以有机相作为A相，以水相作为B相，洗脱程序为：0～18min，15～20％A；18～30min，20～30％A；30～45min，30～50％A；45～50min，50～30％A；50～55min，30～15％A。

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述检测的流速为0.3～1.5ml/min。

6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述检测的波长为220～390nm。

7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为10℃～45℃。

8.一种拉萨大黄指纹图谱，其特征在于，以曲札茋苷作为参照峰，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08。

9.根据权利要求8所述的指纹图谱，其特征在于，以曲札茋苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627。

10.根据权利要求8所述的指纹图谱，其特征在于，所述相对保留时间为1.157±0.08与1.972±0.08的峰对应的化合物依次为虎杖苷与去氧土大黄苷。