CN106153805B - 一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，分别针对元胡止痛胶囊的组方药材延胡索和白芷两味药材进行指纹图谱的构建，包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、对照药材溶液的制备、阴性对照溶液的制备、液相测定，以及用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即分别得到反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱。构建的元胡止痛胶囊指纹图谱能有效避免各组方药材成分之间的相互干扰，能够方便地检验制剂投料药材的真实性和质量，更加准确从部分到整体对元胡止痛胶囊进行质量评价，使元胡止痛胶囊的质量标准和控制方法得到提升和完善。

Description

一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及中药制剂指纹图谱分析方法，特别是涉及元胡止痛胶囊HPLC指纹图谱的建立方法以及由此方法得到的元胡止痛胶囊的指纹图谱，并用于不同厂家、不同批次元胡止痛胶囊样品的质量评价。
背景技术
中药指纹图谱，是指某种或某产地中药材或中成药经过适当的处理后，采用一定的分析方法，得到的能够标志这种中药材或中成药特征的色谱图(或者光谱图)。其中色谱方法为主流方法。中药指纹图谱特点首先通过指纹图谱的指纹特征性，能有效鉴别样品的真伪；其次通过其主要特征峰的面积和比例，有效控制样品的质量，保证质量相对稳定。对于中药及其制剂，只采用一、二种成分指标来说明其内在质量具有片面性。中药指纹图谱是基于中药化学成分系统研究基础上，对所含化学成分进行表征，能够从整体上表征其内在特征，具有整体性。
元胡止痛胶囊处方中由延胡索和白芷两味药组成。其中延胡索为君药，白芷为臣药。延胡索具有活血、利气、止痛之功，辅以白芷可散风寒，宣湿痹，行气血以除头痛、身痛。用于治疗气滞血淤的胃痛、肋痛、头痛和痛经等。该方组方药材只有两味，简单，疗效确切，目前2015版药典中鉴别采用薄层色谱方法，含量测定项目中只有延胡索乙素的HPLC含量测定方法。本品为中药成方制剂，成分众多、复杂，现有质量控制手段和质控指标不能全面反映药品的内在质量。
目前，关于元胡止痛制剂指纹图谱的研究已有报道，但这些研究工作均采用统一的供试品制备方法和色谱分离条件。由于组方药材所含成分复杂，且液相色谱的分离能力有限，成分之间相互有干扰，致使在同一样品制备方法和同一色谱条件下得到的指纹图谱中有些色谱峰重叠严重，很难说清楚该色谱峰的药材成分来源(即来自哪一味药材)。这样建立的指纹图谱对某一组方药材的质量控制和评价，以及检验制剂投料的真实性将受到一定的限制，对于整个成方制剂的质量控制和评价也有一定的影响。因此，为了提升和完善本品的质量标准和控制方法，开发一种简单易行、准确性高、避免组方药材干扰、重复性好且稳定的针对组方药材的指纹图谱构建方法对于元胡止痛胶囊的质量控制及评价具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法及其应用。本发明先针对元胡止痛胶囊的组方药材延胡索和白芷，采用不同的供试品制备方法和色谱条件，分别构建反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱，并与相应对照药材和阴性对照液的HPLC色谱图进行比较；并将构建的反应组方药材的指纹特征的指纹图谱进行数据整合，得到元胡止痛胶囊整合指纹图谱，这样构建的元胡止痛胶囊指纹图谱能有效避免各组方药材成分之间的相互干扰，能够方便地检验制剂投料药材的真实性和质量，更加准确地从部分到整体对元胡止痛胶囊进行质量评价，使元胡止痛胶囊的质量标准和控制方法得到提升和完善。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，该方法分别针对元胡止痛胶囊的组方药材延胡索和白芷两味药材进行指纹图谱的构建，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：分别制备针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液和针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：配制延胡索乙素对照品溶液；
(3)对照药材溶液的制备：分别制备延胡索对照药材溶液和白芷对照药材溶液；
(4)阴性对照溶液的制备：分别制备延胡索阴性对照溶液和白芷阴性对照溶液；
(5)测定：分别精密量取针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液、对照品溶液、延胡索对照药材溶液和延胡索阴性对照溶液，以及针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液、白芷对照药材溶液和白芷阴性对照溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；
(6)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即分别得到反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱。
进一步的，上述元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，还包括：将反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱进行数据整合，得到元胡止痛胶囊整合指纹图谱。
优选的，步骤(1)中，所述针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法为：
取元胡止痛胶囊，倾出内容物，加入氨水浸润，密闭15-30min，以甲醇作为溶剂，进行超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，移至分液漏斗中，调节pH为2-3，石油醚提取，石油醚层弃去，水层加浓氨试液调pH，石油醚萃取，石油醚层合并，水洗，将水洗后的石油醚层蒸干，残渣用甲醇溶解并转移到量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，即得。
超声提取时，元胡止痛胶囊内容物与甲醇加入量的比为1g:(10-15)ml，超声频率为20-40KHz，超声时间为30-40min。
步骤(1)中，所述针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法为：
取元胡止痛胶囊，倾出内容物，以甲基叔丁基醚作为溶剂，进行回流提取，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移到量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，即得。
回流提取时，元胡止痛胶囊内容物与甲基叔丁基醚加入量的比为1g：(10-15)ml。
步骤(2)中，配制的延胡索乙素对照品溶液的浓度为0.04-0.05mg/ml。
步骤(3)中，所述延胡索对照药材溶液按针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法进行制备；所述白芷对照药材溶液按针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法进行制备。
步骤(4)中，所述延胡索阴性对照溶液是将除去延胡索的阴性样品按针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法进行制备；所述白芷阴性对照溶液是将除去白芷的阴性样品按针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法进行制备。
步骤(5)中，针对延胡索测定的液相色谱条件为：色谱柱为Kromasil 100C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长为280nm；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样体积10μL；流动相A为乙腈，流动相B为5％(体积分数)冰乙酸和3％(体积分数)乙酸铵按体积比1:(1-2)混合的溶液；
步骤(5)中，针对延胡索测定的洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-5min，流动相A10％-20％，流动相B 90％-80％；5-50min，流动相A20％-20％，流动相B80％-80％；50-60min，流动相A20％-90％，流动相B80％-10％。
步骤(5)中，针对白芷测定的液相色谱条件为：色谱柱Kromasil 100C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长为300nm；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样体积10μL；流动相A为乙腈；流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液；
步骤(5)中，针对白芷测定的洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-15min，流动相A10％-30％，流动相B 90％-70％；15-35min，流动相A30％-65％，流动相B70％-35％；35-50min，流动相A65％-90％，流动相B35％-10％；50-60min，流动相A90％-95％，流动相B10％-5％。
步骤(5)中，精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
上述方法构建得到的针对延胡索的元胡止痛胶囊指纹图谱，其共有峰为9个；针对白芷的元胡止痛胶囊指纹图谱，其共有峰为9个。经过数据整合后得到的元胡止痛胶囊整合指纹图谱的总共有峰数为18个。
需要说明的是，本发明的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本发明主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。
其中：1)供试品溶液制备方法的考察：
由于延胡索和白芷中所含成分复杂，成分之间液相色谱的分离能力有限，成分之间相互有干扰，致使在同一样品制备方法和同一色谱条件下得到的指纹图谱中有些色谱峰重叠严重，因此，本发明针对延胡索和白芷，分别进行了供试品溶液的制备。
对于针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备，本发明采用氨水浸润后，再用甲醇作为提取溶剂，结合超声提取方法，并对超声提取的频率和时间等参数进行优化，更方便适合从元胡止痛胶囊中有效提取延胡索的有效成分，并在此基础上建立针对延胡索的元胡止痛胶囊指纹图谱，因而对元胡止痛胶囊的质量控制更有针对性和实用性。
同样，对于针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备，本发明对多种提取溶剂进行了优化考察，结果发现以甲基叔丁基醚作为提取溶剂能对元胡止痛胶囊中白芷的有效成分进行提取，最大限度的避免延胡索组分对其指纹图谱构建的干扰。
2)洗脱条件的选择及优化：
洗脱条件是指纹图谱构建的关键参数条件，本发明对指纹图谱构建的洗脱条件进行了优化和选择，对于针对延胡索测定的洗脱程序和针对白芷测定的洗脱条件，本发明设计了多组流动相体系和洗脱程序，例如，将针对延胡索测定的流动相体系设计为：流动相A为乙腈，流动相B为7％冰乙酸-4％乙酸铵(32∶33)溶液；洗脱过程为：流动相A和流动相B的变化为：0-60min，流动相A20％-20％，流动相B为80％-80％。将针对白芷测定的流动相体系设计为：流动相A为乙腈；流动相B为水；洗脱过程为：流动相A和流动相B的变化为：0-50min，流动相A5％-90％，流动相B为95％-10％；50-60min，流动相A90％-90％，流动相B为10％-10％。结果发现，与之相比，采用本发明的流动相体系和洗脱条件，各色谱峰的保留时间适中，且基线平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于色谱指纹图谱的检测和分析。
3)检测波长的考察：
对于反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱检测波长的选择：考察以270nm、280nm和290nm为检测波长，通过比较相应检测波长测定的色谱图，发现检测波长为280nm时，色谱图不仅基线平稳，色谱峰较多，信息量大，各色谱峰的分离效果较好，峰面积也较大。因此，选280nm作为反映延胡索特征的元胡止痛胶囊指纹图谱的检测波长。
对于反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱检测波长的选择：考察以254nm、286nm和300nm为检测波长，通过比较相应检测波长测定的色谱图，发现检测波长为300nm时，色谱图不仅基线平稳，色谱峰较多，信息量大，各色谱峰的分离效果较好，峰面积也较大。因此，选300nm作为白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱的检测波长。
4)柱温的选择：分别对柱温20℃、25℃、30℃、35℃进行考察，结果显示柱温为25℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为25℃。
5)流速的选择：试验了四个流速(0.8ml/min,0.9ml/min,1.0ml/min和1.1ml/min)对指纹图谱检测结果的影响。结果表明：流速为1.0ml/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为1.0ml/min。
6)专属性考察：
反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱的考察：
按本发明的方法制备供试品溶液、延胡索对照药材溶液和其阴性对照溶液，以及延胡索乙素对照品溶液各10μL，注入色谱仪，按照步骤(5)针对延胡索测定的色谱条件进行测定，记录相应色谱图并比较。考察结果表明：供试品溶液的主峰保留时间与对照品溶液的主峰保留时间一致；供试品溶液的主要特征峰与对照药材溶液的对应特征峰保留时间一致，且图谱非常相似；和阴性对照溶液对比，无其它组方药材对指纹图谱测定结果的干扰，因此所构建的反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱专属性好。
反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱的考察
按本发明的方法制备供试品溶液、白芷对照药材溶液和其阴性对照溶液各10μL，注入色谱仪，按照步骤(5)针对白芷测定的色谱条件进行测定，记录相应色谱图并比较。考察结果表明：供试品溶液的主要特征峰保留时间与白芷对照药材溶液的相应特征峰的保留时间一致，且图谱非常相似；和阴性对照溶液对比，无其它组方药材对指纹图谱测定结果的干扰，因此所构建的反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱专属性好。
上述构建的指纹图谱在元胡止痛胶囊质量评价中的应用也是本发明的保护范围。具体应用方法如下：
(1)待测元胡止痛胶囊指纹图谱的构建：取待测的元胡止痛胶囊，按上述方法分别构建待测的反映延胡索和白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱，然后将上述组方药材指纹图谱进行整合，得到元胡止痛胶囊整合指纹图谱；
(2)将待测元胡止痛胶囊各组方药材指纹图谱及整合指纹图谱与相应对照指纹图谱进行相似性比较，以评价待测元胡止痛胶囊组方药材和整体制剂的质量，计算方法为相关系数法，相似度不低于0.900的元胡止痛胶囊样品质量一致性较好。若相似度小于0.900，表明批次样品质量差异较大。
步骤(2)中，所述对照指纹图谱的构建方法为：各个样品指纹图谱的平均图谱即为对照指纹图谱。
本发明的有益效果：
(1)本发明针对元胡止痛胶囊组方药材延胡索和白芷，分别采用不同的样品制备方法和色谱分离条件，构建能够反映延胡索的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷的元胡止痛胶囊指纹图谱，并与相应对照药材和阴性对照液的色谱图进行比较，使构建的元胡止痛胶囊指纹图谱有效避免各组方药材成分之间的相互干扰，能够方便地检验制剂投料药材的真实性，更加直接、准确地评价元胡止痛胶囊所用组方药材的质量。
(2)本发明构建的元胡止痛胶囊整合指纹图谱既能针对组方药材部分进行质量评价，也能从整体上进行整个制剂的质量评价，评价结果较全面。
(3)本发明针对组方药材分别构建反映组方药材指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱，指纹峰特征专属性好，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好。
(4)由于指纹图谱是针对组方药材而构建的，不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映组方药材所含的化学成分信息，因此，本发明针对组方药材分别选择各自药材适宜的吸收波长进行检测(延胡索和白芷的检测波长分别为280nm和300nm)，这样检测的色谱峰较多，各个峰吸收值较高，灵敏度高，基线平稳。
(5)本发明采用元胡止痛胶囊的指纹图谱作为元胡止痛胶囊的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。同时，也可方便、准确的检验是否采用假冒药材。通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价元胡止痛胶囊的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
附图说明
图1为代表性的反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊HPLC指纹图谱，延胡索对照药材图谱，延胡索阴性对照液图谱及对照品图谱；
图2为各批次反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊HPLC指纹图谱(叠加图显示)；
图3为代表性的反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊HPLC指纹图谱，白芷对照药材图谱及白芷阴性对照液图谱；
图4为各批次反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊HPLC指纹图谱(叠加图显示)；
图5为代表性的基于组方药材元胡止痛胶囊整合指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱的构建及方法学验证
样品信息：市售药品，有关样品信息详见表1。
表1：
具体步骤为：
(1)供试品溶液的制备：取元胡止痛胶囊，倾出内容物，加入氨水浸润，密闭15min，以甲醇作为溶剂，元胡止痛胶囊与甲醇加入量的比为1g:12ml，超声频率为30KHz，超声时间为30min。进行超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，移至分液漏斗中，调节pH为2-3，石油醚(60～90℃)提取2次，每次40mL，石油醚层弃去，水层加浓氨试液调pH为9～10，石油醚(60～90℃)分别萃取4次，每次40mL，石油醚层合并，用水洗2次，每次15mL，石油醚层放到水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移到10mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.22μm的微孔滤膜滤过，用作供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：精密称取延胡索乙素对照品10.23mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取上述对照品贮备液5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，即得(含延胡索乙素0.04092mg/mL)。
(3)对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1g，照步骤(1)供试品溶液的制备方法同法制成对照药材溶液。
(4)阴性对照溶液的制备：取除去延胡索的阴性样品3g，照步骤(1)供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
(5)测定：分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图，并进行方法学考察。
色谱柱为Kromasil 100C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长为280nm；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样体积10μL；流动相A为乙腈，流动相B为5％(体积分数)冰乙酸和3％(体积分数)乙酸铵按体积比1:1.8混合的溶液；
步骤(3)中，针对延胡索测定的洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-5min，流动相A10％-20％，流动相B 90％-80％；5-50min，流动相A20％-20％，流动相B80％-80％；50-60min，流动相A20％-90％，流动相B80％-10％。
方法学考察主要包括专属性、稳定性、重现性和精密度考察，考察方法和结果如下：
(1)专属性实验
分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液与对照药材溶液各10μL，注入色谱仪，测定，记录色谱图，结果见图1。由图1可见供试品溶液的主峰保留时间与对照品溶液的主峰保留时间一致；供试品溶液的主要特征峰与对照药材溶液的对应特征峰保留时间一致，且图谱非常相似；和阴性对照溶液对比，无其它组方药材对指纹图谱测定结果的干扰，因此，所构建的反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱专属性好。
(2)精密度实验
取同一批次元胡止痛胶囊样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，连续测定6次，记录色谱图，结果见表2和表3(表中S表示参考峰)。可见，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.033％～0.11％和0.0％～1.6％，RSD＜5.0％，说明仪器的精密度良好。
表2反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对保留时间精密度考察
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 平均值 RSD(％)
1 0.641 0.642 0.642 0.642 0.642 0.642 0.642 0.064
2 0.873 0.873 0.872 0.873 0.872 0.873 0.873 0.059
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
4 1.068 1.069 1.066 1.068 1.067 1.066 1.067 0.11
5 1.243 1.244 1.244 1.244 1.244 1.244 1.244 0.033
6 1.872 1.873 1.872 1.874 1.875 1.876 1.874 0.087
7 2.032 2.033 2.031 2.032 2.030 2.034 2.032 0.070
8 2.220 2.224 2.223 2.222 2.218 2.221 2.221 0.097
9 2.491 2.490 2.492 2.491 2.496 2.496 2.493 0.11
表3反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对峰面积精密度考察
(3)稳定性实验
取同一批次元胡止痛胶囊样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，分别于0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h和28h进样分析，记录色谱图，结果见表4和表5(表中S表示参考峰)。可见，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.081％～0.18％和0.28％～1.5％，说明供试品溶液的成分在24h内是稳定的。
表4反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对保留时间稳定性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 平均值 RSD(％)
1 0.644 0.644 0.642 0.643 0.644 0.642 0.643 0.643 0.643 0.13
2 0.873 0.873 0.871 0.873 0.873 0.872 0.871 0.870 0.872 0.14
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
4 1.065 1.068 1.066 1.066 1.068 1.067 1.064 1.064 1.066 0.15
5 1.244 1.243 1.243 1.242 1.245 1.245 1.244 1.244 1.244 0.083
6 1.870 1.872 1.871 1.875 1.873 1.872 1.875 1.871 1.872 0.10
7 2.032 2.033 2.035 2.036 2.035 2.036 2.034 2.032 2.034 0.081
8 2.223 2.224 2.219 2.219 2.224 2.222 2.225 2.225 2.223 0.11
9 2.489 2.488 2.498 2.486 2.486 2.485 2.484 2.487 2.488 0.18
表5反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对峰面积稳定性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 平均值 RSD(％)
1 0.183 0.189 0.184 0.188 0.189 0.187 0.185 0.185 0.186 1.2
2 0.283 0.280 0.281 0.283 0.278 0.279 0.283 0.280 0.281 0.70
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
4 0.109 0.108 0.110 0.107 0.108 0.108 0.109 0.108 0.108 0.85
5 0.311 0.311 0.311 0.310 0.311 0.313 0.311 0.312 0.311 0.28
6 0.049 0.050 0.050 0.049 0.050 0.048 0.049 0.050 0.049 1.5
7 0.047 0.048 0.047 0.047 0.048 0.047 0.048 0.047 0.047 1.1
8 0.229 0.226 0.226 0.224 0.227 0.228 0.226 0.230 0.227 0.85
9 0.087 0.087 0.086 0.087 0.088 0.088 0.087 0.087 0.087 0.74
(4)重复性实验
取6份同一批次的元胡止痛胶囊样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，分别进样分析，记录色谱图，结果见表6和表7。各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.042％～0.16％和1.1％～2.6％，RSD＜5.0％，说明该实验方法的重复性较好。
表6反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对保留时间重复性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 平均值 RSD(％)
1 0.643 0.643 0.643 0.642 0.642 0.643 0.643 0.080
2 0.872 0.873 0.871 0.870 0.871 0.873 0.872 0.14
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
4 1.064 1.066 1.066 1.064 1.065 1.066 1.065 0.092
5 1.243 1.244 1.244 1.244 1.244 1.243 1.244 0.042
6 1.871 1.878 1.876 1.876 1.871 1.872 1.874 0.16
7 2.033 2.034 2.034 2.033 2.035 2.035 2.034 0.044
8 2.221 2.225 2.224 2.224 2.224 2.217 2.223 0.14
9 2.490 2.491 2.492 2.492 2.492 2.491 2.491 0.033
表7反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对峰面积重复性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 平均值 RSD(％)
1 0.183 0.189 0.186 0.182 0.184 0.184 0.185 1.4
2 0.316 0.316 0.321 0.307 0.313 0.305 0.313 1.9
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.0
4 0.111 0.110 0.113 0.111 0.113 0.112 0.112 1.1
5 0.287 0.285 0.284 0.277 0.284 0.280 0.283 1.3
6 0.050 0.051 0.051 0.052 0.050 0.050 0.051 1.6
7 0.049 0.050 0.050 0.049 0.050 0.049 0.050 1.1
8 0.216 0.218 0.212 0.204 0.214 0.206 0.212 2.6
9 0.088 0.088 0.089 0.087 0.087 0.087 0.088 0.93
(6)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱。不同批次的元胡止痛胶囊样品的指纹图谱如图2所示。
实施例2：反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱的构建及方法学验证
样品信息同实施例1中的表1。
具体步骤为：
(1)供试品溶液的制备：取元胡止痛胶囊，倾出内容物，研细，过六号筛，取1g，精密称定，置索氏提取器中，加甲基叔丁基醚15mL，回流提取6小时，放冷，回收醚液，残渣加甲醇溶解并转移至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.22μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
(2)对照药材溶液的制备：取白芷对照药材1g，照步骤(1)供试品溶液的制备方法同法制成对照药材溶液。
(3)阴性对照溶液的制备：取除去白芷的阴性样品2g，照步骤(1)供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
(4)测定：分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图，并进行方法学考察。
色谱柱Kromasil 100C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长为300nm；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样体积10μL；流动相A为乙腈；流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液；
步骤(3)中，针对白芷测定的洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-15min，流动相A10％-30％，流动相B 90％-70％；15-35min，流动相A30％-65％，流动相B70％-35％；35-50min，流动相A65％-90％，流动相B35％-10％；50-60min，流动相A90％-95％，流动相B10％-5％。
方法学考察主要包括专属性、稳定性、重现性和精密度考察，考察方法和结果如下：
(1)专属性实验
分别精密吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各10μL，注入色谱仪，测定，记录色谱图，结果见附图3。由附图3可见供试品溶液的主峰保留时间与对照品溶液的主峰保留时间一致；供试品溶液的主要特征峰与对照药材溶液的对应特征峰保留时间一致，且图谱非常相似；和阴性对照溶液对比，无其它组方药材对指纹图谱测定结果的干扰，因此所构建的反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱专属性好。
(2)精密度实验
取同一批次元胡止痛胶囊样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，连续测定5次，记录色谱图，结果见表8和表9(表中S表示参考峰)。可见，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.030％～0.22％和0.98％～1.7％，RSD＜5.0％，说明仪器的精密度良好。
表8反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对保留时间精密度考察
表9反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对峰面积精密度考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 平均值 RSD(％)
1(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
2 0.405 0.417 0.415 0.406 0.404 0.409 1.5
3 0.253 0.243 0.252 0.253 0.249 0.250 1.7
4 0.361 0.353 0.359 0.354 0.359 0.357 0.98
5 1.906 1.891 1.909 1.928 1.940 1.915 1.0
6 0.863 0.884 0.888 0.877 0.889 0.880 1.2
7 0.733 0.727 0.718 0.741 0.742 0.732 1.4
8 0.465 0.465 0.456 0.467 0.476 0.466 1.5
9 0.734 0.714 0.735 0.721 0.738 0.728 1.4
(3)稳定性实验
取同一批次元胡止痛胶囊样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，分别于0h，5h，10h，15h和20h进样分析，记录色谱图，结果见表10和表11(表中S表示参考峰)。可见，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.11％～0.29％和0.93％～1.6％，说明供试品溶液的成分在20h内是稳定的。
表10反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对保留时间稳定性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 平均值 RSD(％)
1(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
2 1.035 1.037 1.038 1.032 1.031 1.035 0.29
3 1.259 1.254 1.256 1.257 1.255 1.256 0.15
4 1.381 1.383 1.387 1.381 1.389 1.384 0.26
5 1.761 1.763 1.765 1.763 1.769 1.764 0.17
6 1.812 1.814 1.813 1.817 1.816 1.814 0.11
7 1.877 1.878 1.875 1.871 1.873 1.875 0.15
8 1.952 1.955 1.958 1.959 1.956 1.956 0.14
9 2.504 2.502 2.508 2.502 2.501 2.503 0.11
表11反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对峰面积稳定性考察
(4)重复性实验
取5份同一批次的元胡止痛胶囊样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，分别进样分析，记录色谱图，结果见表12和表13。各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.031％～0.29％和1.3％～1.8％，RSD＜5.0％，说明该实验方法的重复性较好。
表12反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对保留时间重复性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 平均值 RSD(％)
1(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
2 1.041 1.040 1.041 1.042 1.041 1.041 0.068
3 1.263 1.264 1.266 1.266 1.265 1.265 0.10
4 1.388 1.381 1.382 1.389 1.381 1.384 0.29
5 1.761 1.762 1.761 1.761 1.762 1.761 0.031
6 1.817 1.814 1.811 1.815 1.817 1.815 0.14
7 1.869 1.872 1.871 1.877 1.871 1.872 0.16
8 1.951 1.952 1.951 1.959 1.959 1.954 0.22
9 2.511 2.512 2.513 2.511 2.510 2.511 0.045
表13反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱主要特征峰相对峰面积重复性考察
编号 S1 S2 S3 S4 S5 平均值 RSD(％)
1(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
2 0.409 0.412 0.411 0.425 0.412 0.414 1.5
3 0.255 0.251 0.258 0.259 0.253 0.255 1.3
4 0.359 0.347 0.355 0.358 0.352 0.354 1.4
5 1.915 1.939 1.920 1.928 2.003 1.941 1.8
6 0.877 0.882 0.856 0.891 0.874 0.876 1.5
7 0.735 0.736 0.742 0.719 0.746 0.736 1.4
8 0.461 0.463 0.463 0.462 0.478 0.465 1.5
9 0.738 0.710 0.718 0.719 0.722 0.721 1.4
(6)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得反映白芷指纹特征的延胡止痛胶囊指纹图谱。不同批次的元胡止痛胶囊样品的指纹图谱如图4所示。
实施例3：应用建立的元胡止痛胶囊指纹图谱对不同厂家、不同批次样品进行质量评价
利用指纹图谱进行元胡止痛胶囊的质量控制，具体方法包括以下步骤：
(1)待测元胡止痛胶囊样品指纹图谱的构建：取10批次待测的元胡止痛胶囊样品，按实施例1和实施例2的方法构建待测元胡止痛胶囊样品的指纹图谱；
(2)采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件对10批元胡止痛胶囊样品的HPLC指纹图谱色谱峰进行匹配。选择S1(编号为1的样品)作为参照图谱，生成的对照指纹图谱为R。各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱以及各样品之间指纹图谱的相似度结果见表14和表15。
表14反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊样品指纹图谱相似度评价结果
样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照指纹图谱
1 1.000 0.997 0.998 0.999 0.997 0.997 0.997 0.998 0.997 0.999 0.999
2 0.997 1.000 0.999 0.994 0.999 0.999 0.998 0.999 1.000 0.995 0.999
3 0.998 0.999 1.000 0.996 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.996 1.000
4 0.999 0.994 0.996 1.000 0.996 0.995 0.996 0.997 0.995 0.997 0.997
5 0.997 0.999 1.000 0.996 1.000 1.000 1.000 1.000 0.999 0.994 1.000
6 0.997 0.999 1.000 0.995 1.000 1.000 1.000 1.000 0.999 0.995 1.000
7 0.997 0.998 1.000 0.996 1.000 1.000 1.000 1.000 0.998 0.994 0.999
8 0.998 0.999 1.000 0.997 1.000 1.000 1.000 1.000 0.999 0.996 1.000
9 0.997 1.000 1.000 0.995 0.999 0.999 0.998 0.999 1.000 0.996 1.000
10 0.999 0.995 0.996 0.997 0.994 0.995 0.994 0.996 0.996 1.000 0.997
对照指纹图谱 0.999 0.999 1.000 0.997 1.000 1.000 0.999 1.000 1.000 0.997 1.000
注：1～10对应1～10个批次样品。
表15反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊样品指纹图谱相似度评价结果
样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照指纹图谱
1 1.000 0.656 0.844 0.976 0.716 0.904 0.928 0.758 0.997 0.904 0.981
2 0.656 1.000 0.928 0.630 0.978 0.671 0.747 0.970 0.649 0.671 0.782
3 0.844 0.928 1.000 0.776 0.969 0.889 0.810 0.981 0.827 0.889 0.926
4 0.976 0.630 0.776 1.000 0.662 0.806 0.970 0.703 0.982 0.806 0.949
5 0.716 0.978 0.969 0.662 1.000 0.780 0.741 0.991 0.697 0.780 0.834
6 0.904 0.671 0.889 0.806 0.780 1.000 0.744 0.818 0.878 1.000 0.928
7 0.928 0.747 0.810 0.970 0.741 0.744 1.000 0.775 0.937 0.744 0.935
8 0.758 0.970 0.981 0.703 0.991 0.818 0.775 1.000 0.740 0.818 0.868
9 0.997 0.649 0.827 0.982 0.697 0.878 0.937 0.740 1.000 0.878 0.973
10 0.904 0.671 0.889 0.806 0.780 1.000 0.744 0.818 0.878 1.000 0.928
对照指纹图谱 0.981 0.782 0.926 0.949 0.834 0.928 0.935 0.868 0.973 0.928 1.000
注：1～10对应1～10个批次样品。
以对照指纹图谱作为参考，由表14可见，不同厂家不同批次的元胡止痛胶囊样品中反映组方药材延胡索指纹特征的指纹图谱相似度值非常高，范围为0.997-1.000，说明组方药材延胡索的质量一致性非常好。然而，由表15可见，不同厂家不同批次的元胡止痛胶囊样品中反映组方药材白芷指纹特征的指纹图谱相似度值差异较大，范围为0.782-0.981，说明组方药材白芷的质量一致性不好，差异较大。
实施例4：元胡止痛胶囊整合指纹图谱的整体评价
样品信息：市售药品，有关样品信息详见实施例1的表1。
具体步骤为：
(1)基于组方药材的元胡止痛胶囊整合指纹图谱的构建
元胡止痛胶囊处方中由延胡索和白芷两味药组成，为了整体表征元胡止痛胶囊的整体成分特征，将元胡止痛胶囊中反映延胡索指纹特征的指纹图谱和反映白芷指纹特征的指纹图谱整合，构建基于组方药材的元胡止痛胶囊整合指纹图谱(见图5)，即将实施例1和实施例2的方法构建待测元胡止痛胶囊样品的指纹图谱进行整合；
(2)采用R统计软件计算各批次样品的整合指纹图谱与对照整合指纹图谱以及各样品之间整合指纹图谱的相似度结果见表16。
表16基于组方药材构建的元胡止痛胶囊样品整合指纹图谱相似度评价结果
样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照指纹图谱
1 1.000 0.896 0.941 0.953 0.928 0.949 0.976 0.909 0.960 0.967 0.963
2 0.896 1.000 0.989 0.740 0.988 0.983 0.951 0.998 0.982 0.960 0.982
3 0.941 0.989 1.000 0.810 0.998 0.995 0.975 0.994 0.991 0.984 0.996
4 0.953 0.740 0.810 1.000 0.794 0.816 0.905 0.759 0.847 0.851 0.848
5 0.928 0.988 0.998 0.794 1.000 0.989 0.970 0.993 0.984 0.976 0.991
6 0.949 0.983 0.995 0.816 0.989 1.000 0.970 0.989 0.993 0.991 0.996
7 0.976 0.951 0.975 0.905 0.970 0.970 1.000 0.959 0.985 0.966 0.986
8 0.909 0.998 0.994 0.759 0.993 0.989 0.959 1.000 0.985 0.969 0.988
9 0.960 0.982 0.991 0.847 0.984 0.993 0.985 0.985 1.000 0.984 0.998
10 0.967 0.960 0.984 0.851 0.976 0.991 0.966 0.969 0.984 1.000 0.989
对照指纹图谱 0.963 0.982 0.996 0.848 0.991 0.996 0.986 0.988 0.998 0.989 1.000
注：1～10对应1～10个批次样品。
以对照指纹图谱作为参考，由表16可见，不同厂家不同批次的元胡止痛胶囊样品整合指纹图谱相似度较高，除了第4号样品外，相似度值均大于0.960，说明元胡止痛胶囊从整体来看，其质量一致性较好。

Claims (4)

1.一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，其特征在于，分别针对元胡止痛胶囊的组方药材延胡索和白芷两味药材进行指纹图谱的构建，包括以下步骤：
( 1 )供试品溶液的制备：分别制备针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液和针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液；
( 2 )对照品溶液的制备：配制延胡索乙素对照品溶液；
( 3 )对照药材溶液的制备：分别制备延胡索对照药材溶液和白芷对照药材溶液； ( 4)阴性对照溶液的制备：分别制备延胡索阴性对照溶液和白芷阴性对照溶液； ( 5 )测定：分别精密量取针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液、对照品溶液、延胡索对照药材溶液和延胡索阴性对照溶液，以及针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液、白芷对照药材溶液和白芷阴性对照溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；
( 6 )用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即分别得到反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱；
步骤( 1 )中，所述针对延胡索的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法为： 取元胡止痛胶囊，倾出内容物，加入氨水浸润，密闭15-30min，以甲醇作为溶剂，进行超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，移至分液漏斗中，调节pH为2-3，石油醚提取，石油醚层弃去，水层加浓氨试液调pH，石油醚萃取，石油醚层合并，水洗，将水洗后的石油醚层蒸干，残渣用甲醇溶解并转移到量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，即得；
步骤( 1 )中，所述针对白芷的元胡止痛胶囊供试品溶液的制备方法为： 取元胡止痛胶囊，倾出内容物，以甲基叔丁基醚作为溶剂，元胡止痛胶囊内容物与溶剂加入量的比为1g：( 10-15 )ml，进行回流提取，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移到量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，即得；
步骤( 5 )中，针对延胡索测定的液相色谱条件为：色谱柱为Kromasil 100C18色谱柱；检测波长为280nm；流速1 .0mL/min；柱温25℃；进样体积10μL；流动相A为乙腈，流动相B为5％体积分数的冰乙酸和3％体积分数的乙酸铵按体积比1:(1-2 )混合的溶液；
步骤( 5 )中，针对延胡索测定的洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-5min，流动相A10％-20％，流动相B 90％-80％；5-50min，流动相A20％-20％，流动相B80％-80％；50-60min，流动相A20％-90％，流动相B80％-10％；
步骤( 5 )中，针对白芷测定的液相色谱条件为：色谱柱Kromasil 100C18色谱柱；检测波长为300nm；流速1 .0mL/min；柱温25℃；进样体积10μL；流动相A为乙腈；流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液；
步骤( 5 )中，针对白芷测定的洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-15min，流动相A10％-30％，流动相B 90％-70％；15-35min，流动相A30％-65％，流动相B70％-35％；35-50min，流动相A65％-90％，流动相B35％-10％；50-60min，流动相A90％-95％，流动相B10％-5％。
2.如权利要求1所述的元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，还包括：将反映延胡索指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱和反映白芷指纹特征的元胡止痛胶囊指纹图谱进行数据整合，得到元胡止痛胶囊整合指纹图谱。
3. 如权利要求1所述的元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，其特征在于，超声提取时，元胡止痛胶囊内容物与溶剂加入量的比为1g:( 10-15 )ml，超声频率为20-40KHz，超声时间为30-40min。
4.权利要求1-3任一项所述的构建方法构建的指纹图谱在元胡止痛胶囊质量评价中的应用。
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