CN103792303B - 翼首草药材的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了翼首草药材的检测方法，它是通过超快速液相色谱法UFLC进行测定的。本发明UFLC色谱检测法，可以有效地将翼首草中化学成分分离，所得色谱图中，特征峰多，各批药材指纹图谱相似度高，分离度、精密度、稳定性和重现性良好，且色谱检测时间在20min以内，检测效率高，为检测翼首草药材质量提供了新的方法。

Description

翼首草药材的检测方法

技术领域

本发明涉及翼首草药材的检测方法。

背景技术

翼首草为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)的干燥全草，是一种藏族习用药材。具有解毒除瘟、清热止痢、祛风通痹之功效，可治疗真布病、瘟毒；现代化学及药理研究表明，翼首草中含有齐墩果烷型五环三萜皂苷类、环烯醚萜苷类、生物碱、多糖等化合物，其中环烯醚萜苷类和齐墩果烷型五环三萜皂苷是其治疗类风湿性关节炎（与藏医“真布病”相当）的主要有效成分。

中药指纹图谱是指某种中药材及其制剂所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有得到明确，指纹图谱的建立对于有效控制中药材的质量具有十分重要的意义。对于翼首草药材，由于其成分复杂，具体某几个成分不能真正的反应药材的质量，而综合研究指纹图谱以控制其质量还未有统一标准。

发明内容

本发明的目的在于提供翼首草药材的UFLC检测方法。

本发明提供了翼首草药材的检测方法，它是通过超快速液相色谱法UFLC进行测定的，包括如下操作步骤：

（1）取待测翼首草药材，以甲醇或甲醇水溶液提取，制备供试品溶液；

（2）将供试品溶液注入超快速液相色谱仪中，检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，填料粒径为1.7～3.5μm；

检测波长：238±5nm；

流动相：流动相A为0.2%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，其梯度程序如下：0→10min，10％→19％B；10→17min，19％→30％B；17→25min，30％→100％B。

进一步地，步骤（1）所述甲醇水溶液中，甲醇浓度为60～80%v/v，优选为70%±2%v/v。

进一步地，所述色谱柱型号为：4.6×100mm，2.7μm。

优选地，所述色谱柱为Agilent proshell120SB-C18色谱柱。

进一步地，所述流动相流速为1.0ml/min。

进一步地，色谱柱柱温为30℃。

其中，所述超快速液相色谱法中，以绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷、大花双参苷A中的一种或两种以上的组合物为对照品，通过通过外标法或供试品与对照品指纹图谱相似度，对待测翼首草药材进行检测。

进一步地，所述对照品为绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷和大花双参苷A的组合物。

其中，所述超快速液相色谱法中，采用指纹谱图技术对待测翼首草药材进行检测，其具体操作为：将供试品指纹图谱与标准指纹图谱对比，计算相似度；

所述标准指纹图谱中，有15个共有特征峰，它们的相对保留时间（以10号峰吴茱萸苷为参照峰计算）分别为：0.193，0.235，0.288，0.387，0.401，0.561，0.595，0.892，0.937，1，1.028，1.132，1.147，1.172，1.205。

进一步地，所述标准指纹图谱如图2所示。

本发明UFLC色谱检测法，可以有效地将翼首草中化学成分分离，所得色谱图中，特征峰多，各批药材指纹图谱相似度高，分离度、精密度、稳定性和重现性良好，且色谱检测时间在20min以内，检测效率高，为检测翼首草药材质量提供了新的方法。

附图说明

图1对照品图谱。

图2本发明翼首草药材的UFLC标准指纹图谱，其中从左到右分别为15个共有的特征峰

图3流动相为乙腈：四氢呋喃（99:1）-0.2%磷酸水的色谱图

图4本发明的21批次翼首草药材的UFLC指纹图谱。

具体实施方式

本发明所用仪器与试剂如下：

仪器：LC-20AD XR色谱仪（日本岛津公司）；CQ-250超声波清洗器[必能信超声（上海）有限公司]；中药粉碎机（浙江省永康市金穗机械厂）；BP211D十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）。

试剂：乙腈（色谱纯，Fisher）；磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

实施例1：藏药翼首草UFLC检测方法（外标法）

（1）供试品溶液的制备：取翼首草药材粉末0.5g，精密称定，置于100mL锥形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理（功率：200W，频率：40kHz）30min，放至室温，再称定重量，以70%甲醇溶液补足减失重量，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

（2）对照品溶液的制备：对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷、大花双参苷A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至25mL，作为对照品储备液。分别精密吸取适量上述对照品储备液于同一容量瓶，定容至25mL，配制成质量浓度分别为28.20mg/L、22.28mg/L、38.35mg/L、487.00mg/L、31.10mg/L的混合对照品溶液。

（3）精密吸取供试品溶液和对照品溶液各4μL，分别注入色谱仪中，在如下色谱条件下进行检测：

色谱条件：Agilent proshell120SB-C18色谱柱，4.6×100mm，2.7μm；检测波长200～400nm全波长扫描，流动相的流速为1.0ml/min，柱温为30℃；流动相A为0.2%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，其梯度程序如下：0～10min，10％→19％B；10～17min，19％→30％B；17～25min，30％→100％B。

通过外标法，以对照品检测数据建立标准曲线，即计算出待测翼首草药材中各指标成分的含量。

实施例2：藏药翼首草UFLC检测方法（对照品指纹图谱对照法）

（1）供试品溶液的制备：取翼首草药材粉末0.5g，精密称定，置于100mL锥形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理（功率：200W，频率：40kHz）30min，放至室温，再称定重量，以70%甲醇溶液补足减失重量，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

（2）对照品溶液的制备：对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷、大花双参苷A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至25mL，作为对照品储备液。分别精密吸取适量上述对照品储备液于同一容量瓶，定容至25mL，配制成质量浓度分别为28.20mg/L、22.28mg/L、38.35mg/L、487.00mg/L、31.10mg/L的混合对照品溶液。

（3）精密吸取对照品溶液4μL，注入色谱仪中，在如下色谱条件下进行检测，即得对照品指纹图谱，如图1所示。

色谱条件：Agilent proshell120SB-C18色谱柱，4.6×100mm，2.7μm；检测波长200～400nm全波长扫描，流动相的流速为1.0ml/min，柱温为30℃；流动相A为0.2%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，其梯度程序如下：0～10min，10％→19％B；10～17min，19％→30％B；17～25min，30％→100％B。

（4）精密吸取供试品溶液4μL，注入色谱仪中，按照步骤（3）色谱条件进行检测，再将所得供试品指纹图谱与图1所示的对照品指纹图谱进行比较，计算相似度，即可实现对待测翼首草药材的检测。

实施例3：藏药翼首草UFLC检测方法（标准指纹图谱对照法）

（1）供试品溶液的制备：取翼首草药材粉末0.5g，精密称定，置于100mL锥形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理（功率：200W，频率：40kHz）30min，放至室温，再称定重量，以70%甲醇溶液补足减失重量，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

（2）精密吸取供试品溶液4μL，注入色谱仪中，在如下色谱条件下进行检测，再将所得供试品指纹图谱与图2所示的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，即可实现对待测翼首草药材的检测。若相似度在0.9以上，则待测药材即为合格的翼首草药材。

色谱条件：Agilent proshell120SB-C18色谱柱，4.6×100mm，2.7μm；检测波长200～400nm全波长扫描，流动相的流速为1.0ml/min，柱温为30℃；流动相A为0.2%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，其梯度程序如下：0～10min，10％→19％B；10～17min，19％→30％B；17～25min，30％→100％B。

标准指纹图谱中，确定了15个共有特征峰，其保留时间分别为：2.590min，3.154min，3.871min，5.193min，5.393min，7.527min，7.983min，11.992min，12.595min，13.447min，13.818min，15.228min，15.430min，15.757min，16.202min。

实施例4流动相的筛选试验

在前期检测预实验中，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈：四氢呋喃（99:1）-0.2%磷酸水流动相系统，结果发现，只有乙腈：四氢呋喃（99:1）-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水分离效果较好，但是前者从12.5min开始基线漂移（见图3），而采用乙腈-0.2%磷酸水溶液系统时，各峰的分离度较好，基线较平稳（见图2），有利于指纹图谱的建立，因此，确定以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相系统。

实施例5：翼首草药材UFLC标准指纹图谱

（1）标准指纹图谱的建立

取不同来源的21批翼首草药材，按实施例3的条件进行检测，得到21批样品的UFLC指纹图谱，如图4所示。运用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”对上述21批药材指纹图谱进行分析，提取共有峰生成标准图谱，共确定了15个共有特征峰，以10号峰即吴茱萸苷为S峰，计算各共有特征峰与S峰的相对保留时间见表1，其相对保留时间的RSD值应小于5%。

表121批翼首草药材的相对保留时间

（2）相似度评价：采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2004A版）对图谱进行评价，相似度评价结果见表2。

表2UFLC指纹图谱相似度评价结果

由21批次药材与对照指纹图谱的相似度比较结果可见，除了S13、S18、S20批次样品的相似度<0.9，其余批次的翼首草药材相似度均在0.9以上，说明大部分批次样品的化学成分具有一致性。从色谱图中可见，S13批次样品色谱图中第11、13号峰的峰高高于参照峰，S18批次样品色谱图中8号峰的峰高明显高于色谱图中其他峰，S20批次样品色谱图中3、9号峰的峰高明显高于谱图中的其他峰，说明不同批次间共有峰的含量存在差异。

Claims (9)

1.翼首草药材的检测方法，其特征在于：它是通过超快速液相色谱法UFLC进行测定的，包括如下操作步骤：

(1)取待测翼首草药材，以甲醇或甲醇水溶液提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入超快速液相色谱仪中，检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，填料粒径为1.7～3.5μm；

检测波长：238±5nm；

流动相：流动相A为0.2％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，其梯度程序如下：0→10min，10％→19％B；10→17min，19％→30％B；17→25min，30％→100％B；

所述超快速液相色谱法中，采用指纹图谱技术对待测翼首草药材进行检测，其具体操作为：将供试品指纹图谱与标准指纹图谱对比，计算相似度；

所述标准指纹图谱中，有15个共有特征峰，以吴茱萸苷为参照峰计算共有特征峰的相对保留时间分别为：0.193，0.235，0.288，0.387，0.401，0.561，0.595，0.892，0.937，1，1.028，1.132，1.147，1.172，1.205。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述甲醇水溶液中，甲醇浓度为60～80％v/v。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：甲醇浓度为70％±2％v/v。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱型号为：4.6×100mm，2.7μm。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱为Agilent proshell 120SB-C18色谱柱。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相流速为1.0ml/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：色谱柱柱温为30℃。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述超快速液相色谱法中，以绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷、大花双参苷A中的一种或两种以上的组合物为对照品，通过供试品与对照品指纹图谱相似度，对待测翼首草药材进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述对照品为绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷和大花双参苷A的组合物。