CN104458993B

CN104458993B - 壮药材滇桂艾纳香hplc指纹图谱的建立方法

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Publication number: CN104458993B
Application number: CN201410767029.2A
Authority: CN
Inventors: 蒋冰清; 罗盛东; 陈良
Original assignee: GUANGXI MEDICTOP PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: GUANGXI MEDICTOP PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN104458993A

Abstract

本发明公开了一种壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱，以滇桂艾纳香中的主要成分原儿茶酸和原儿茶醛为参照物，据此获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的指纹图谱。指纹图谱共有色谱峰13个，它能充分反应滇桂艾纳香药材中的化学成分，信息量丰富，方法重现性良好，对控制药材质量和鉴别药材优劣提供了更有力的理论依据，提高了壮药滇桂艾纳香药材的质量控制和真伪鉴别的水平，实现了快速、准确地鉴别滇桂艾纳香的真伪优劣。

Description

壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于药物分析中的中药材指纹图谱技术领域，尤其涉及一种壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术

滇桂艾纳香为菊科艾纳香属植物Blumeariparia(Bl)DC的干燥全草，在广西尤其是在百色地区有较长的使用历史。滇桂艾纳香主产于广西西南部(百色、德保、凌云)、广东南部、云南西南至东南部，具有活血、止血、利水的功效，用于经期提前、产后血崩、产后浮肿，不孕症，阴疮。

中药指纹图谱是指中药材或中成药经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体共有特征的图谱或图象。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。从中药全面质量控制的角度看，高效液相色谱(HPLC)指纹图谱在国际上容易获得认可，包括美国、英国、法国、加拿大、德国、日本和印度在内的许多国家更愿意接受HPLC指纹图谱。

近年来的生药学、化学中记载的壮药滇桂艾纳香主要有性状鉴别、显微鉴别及理化鉴别方法，其质量标准起草说明中也用到了薄层鉴别方法，但这些方法都存在提供的信息量小，样品化学成分体现不完全，可鉴别的成分数量较少等问题，因而不能很好地代表壮药滇桂艾纳香的整体质量。LeelakittisinBenjakarn等(滇桂艾纳香的高效液相色谱指纹图谱的鉴别方法的研究，中国临床新医学，2014年，第5期)对滇桂艾纳香指纹图谱鉴别研究进行了有益尝试，他采用原儿茶酸、绿原酸为参照物进行标定，共标定11个共有峰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、稳定、精密度高、重现性好的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，以实现快速、准确地鉴别滇桂艾纳香的真伪优劣。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：加甲醇配制成每1ml分别含原儿茶酸、原儿茶醛25μg的混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：精密称取壮药滇桂艾纳香药材粗粉，加水浸泡后，煎煮3次，每次1.5h，滤过，合并滤液并浓缩至约40ml，用稀盐酸调pH后，用乙醚萃取，合并乙醚液蒸干后用甲醇溶解残渣，滤过，即可；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰醋酸组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长为200～300nm；

(4)测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

步骤(2)按以下操作进行：精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约2～8g，精密稳定，加水煎煮3次，每次加水200ml煎煮1.5h，其中第一次加水200ml，先浸泡10～40min后，煎煮；滤过，合并3次煎煮的滤液并浓缩至约40ml，放冷，用稀盐酸调pH＝2-3，用乙醚萃取4次，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，并转移至10ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即可。

步骤(2)按以下操作进行：精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约5g，精密稳定，加水煎煮3次，每次加水200ml煎煮1.5h，其中第一次加水200ml，先浸泡30min后，煎煮；滤过，合并3次煎煮的滤液并浓缩至约40ml，放冷，用稀盐酸调pH＝2-3，用乙醚萃取4次，每次20ml、15ml、15ml、15ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，并转移至10ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续液即可。

步骤(3)的色谱条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为1％的冰醋酸(色谱用)与甲醇组成的梯度洗脱液，柱温25℃，紫外检测：波长为256nm，流速为1.0ml/min，分析时间为85min。

梯度洗脱的程序设为时间梯度0min→4min→10min→20min→35min→40min→85min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B1％冰醋酸组成，流动相A的体积百分数梯度10％→10％→18％→23％→25％→40％→40％，流动相B的体积百分数梯度90％→90％→82％→77％→75％→60％→60％。

步骤(4)按以下操作进行：精密吸取供试品溶液10～20μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

指纹图谱共有色谱峰有13个，其保留时间分别为5.919min、14.515min、17.867min、21.74min、24.579min、25.785min、29.338min、31.880min、37.903min、49.410min、51.148min、53.373min、60.022min。

为提高壮药滇桂艾纳香药材的质量控制和真伪鉴别的水平，发明人采用高效液相色谱，以滇桂艾纳香中的主要成分原儿茶酸和原儿茶醛为参照物，研发了一种壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，据此获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的指纹图谱，指纹图谱共有色谱峰13个，它能充分反应滇桂艾纳香药材中的化学成分，信息量丰富，方法重现性良好，对控制药材质量和鉴别药材优劣提供了更有力的理论依据。相对于现有技术，本发明具有以下突出优势：

(1)将不同产地和不同采集时间的壮药滇桂艾纳香药材，在同一指纹图谱条件下分别建立指纹图谱，然后将其进行融合，达到信息互补，增加指纹图谱的信息量，从而提高其指纹鉴定能力，以实现指纹图谱的全面和整体评价。

(2)供试品制备方便，分析时间短，色谱条件容易实现。

(3)方法简便、稳定，精密度高、重现性好。

(4)适于对壮药滇桂艾纳香药材真伪、产地和品质的鉴别和控制，弥补了现有质量控制技术的不足，使滇桂艾纳香药材的质量控制更加完善和科学。

附图说明

图1是对照品HPLC图谱，图中：1原儿茶酸，2原儿茶醛。

图2是壮药滇桂艾纳香药材的HPLC指纹图谱。

图3是各批壮药滇桂艾纳香药材的HPLC指纹图谱整合叠加图。

具体实施方式

发明人将13批不同来源的滇桂艾纳香药材，在同一指纹图谱条件下分别建立指纹图谱，然后将这些指纹图谱进行融合，确定其共用指纹特征图，增加指纹图谱的信息量，从而提高其指纹鉴定能力，以实现指纹图谱的全面和整体评价。为了更一步阐述本发明的研究过程，以下通过实例来说明。

实施例1

1实验材料和仪器

1.1药材：产地及采收时间如表1。

表1滇桂艾纳香药材的产地及采收时间

1.2仪器：Agilent1100高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1314AVWD检测器，G1316A柱温箱，Agilengt1100色谱工作站(美国安捷伦科技公司))电子分析天平：BP211D(德国赛多利斯)；PS-60AL超声波清洗仪(40kHz，360W)；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版(国家药典委员会)。

1.3试剂：原儿茶酸对照品(购于中国药品生物制品检定所)批号110809-200604；原儿茶醛对照品(购于中国药品生物制品检定所)批号110810-200506，流动相甲醇、冰醋酸为色谱纯，其它试剂都是分析纯。

2高效液相色谱

2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷合硅胶为填料(SinoChromODS-BP5um的依利特ODSC18色谱柱4.6×250mm)；采用梯度洗脱，洗脱程序如表2。

表2色谱流动相洗脱程序

流动相A为：甲醇；流动相B为：1％冰醋酸；检测波长256nm，流速1mL/min；柱温25℃；进样量10μl；检测时间为85min，理论塔板数以原儿茶酸、原儿茶醛计应分别不低于3000。

2.2对照品溶液的制备：取原儿茶酸对照品6.26mg、原儿茶醛对照品6.68mg，分别置50ml的容量瓶，加甲醇溶解并定容，制得浓度分别为原儿茶酸0.1252mg/ml、原儿茶醛0.1336mg/ml的对照品储备液。精密吸取原儿茶酸储备液5ml、原儿茶醛储备液5ml置25ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得原儿茶酸25.04μg/ml、原儿茶醛26.72μg/ml的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备：精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约5g，精密稳定，加水煎煮3次，每次加水200ml煎煮1.5h，其中第一次加水200ml，先浸泡30min后，煎煮；滤过，合并3次煎煮的滤液并浓缩至约40ml，放冷，用稀盐酸调pH＝2-3，用乙醚萃取4次(20ml、15ml、15ml、15ml)，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，并转移至10ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续液即得；

2.4测定：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱(图1、图2)。

实施例2

取壮药滇桂艾纳香药材13批次，按照实施例1的条件进行检测，得到13批样品的HPLC指纹图谱的叠加图，如图3所示。通过对这13批HPLC图谱的比较，进行相识度评价，确定其特征共有峰：指纹图谱中有13个特征共有峰，其保留时间、峰面积的平均值以及占总峰面积的比例汇总如下：

1号峰，平均保留时间为5.919min，RSD％为0.23％，峰面积为294.446，RSD％为70.14％；占总峰面积的4.027％；

2号峰，平均保留时间为14.515min，RSD％为0.12％，峰面积为960.173，RSD％为26.12％；占总峰面积的13.131％；

3号峰，平均保留时间为17.867min，RSD％为0.08％，峰面积为305.170，RSD％为25.56％；占总峰面积的4.172％；

4号峰，平均保留时间为21.74min，RSD％为0.09％，峰面积为251.465，RSD％为26.74％；占总峰面积的3.439％；

5号峰，平均保留时间为24.579min，RSD％为0.10％，峰面积为173.950，RSD％为29.31％；占总峰面积的2.379％；

6号峰，平均保留时间为25.785min，RSD％为0.13％，峰面积为163.555，RSD％为44.38％；占总峰面积的2.237％；

7号峰，平均保留时间为29.338min，RSD％为0.12％，峰面积为1625.124，RSD％为32.00％；占总峰面积的22.225％；

8号峰，平均保留时间为31.880min，RSD％为0.11％，峰面积为89.740，RSD％为29.41％；占总峰面积的1.227％；

9号峰，平均保留时间为37.903min，RSD％为0.18％，峰面积为151.487，RSD％为50.00％；占总峰面积的2.072％；

10号峰，平均保留时间为49.410min，RSD％为0.08％，峰面积为1216.851，RSD％为65.94％；占总峰面积的16.641％；

11号峰，平均保留时间为51.148min，RSD％为0.11％，峰面积为715.884，RSD％为66.62％；占总峰面积的9.790％；

12号峰，平均保留时间为53.373min，RSD％为0.14％，峰面积为163.202，RSD％为79.27％；占总峰面积的2.232％；

13号峰，平均保留时间为60.022min，RSD％为0.18％，峰面积为1201.212，RSD％为75.50％；占总峰面积的16.428％。

可见，壮药滇桂艾纳香药材的指纹图谱中有13个特征峰，2号为原儿茶酸参照峰，3号为原儿茶醛参照峰，图谱总长度为85min。其中，单峰面积超总峰面积1％的峰有13个，它们是1～13号峰；单峰面积超总峰面积5％的峰有5个，它们是2号峰、7号峰、10号峰、11号峰、13号峰；单峰面积超总峰面积10％的峰有4个，它们是2号峰、7号峰、10号峰、13号峰。

相似度评价：采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004A版，对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见表3。

表3HPLC指纹图谱相似度评价

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	S11	S12	S13
														相似度	0.974	0.917	0.944	0.953	0.986	0.900	0.991	0.923	0.948	0.936	0.964	0.957	0.965

10批壮药滇桂艾纳香药材的HPLC指纹图谱的相似度均大于0.90。

实施例3

1、方法学考察

1.1精密度实验

取编号为6号的供试品，按实施例1中供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下记录指纹图谱。结果表明，各色谱图的相对保留时间RSD值为0.068％～0.204％，各峰相对峰面积RSD值在0.045～1.76％。表明仪器的精密度良好。

1.2稳定性实验

取编号为6号的供试品，按实施例1供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下，分别在0、4、8、12、16、24h检测指纹图谱，考察实验方法的重复性。结果表明，6份样品和色谱峰的相对保留时间RSD在0.038～0.336％，各峰相对峰面积RSD值在0.073～1.35％。

1.3重复性实验

精密称取滇桂艾纳香药材粉末(6号药材)6份，按实施例1供试品溶液制备方法制备，考察实验方法的重复性。结果表明，6份样品和色谱峰的相对保留时间RSD在0.042～0.212％，各峰相对峰面积RSD值在0.081～2.26％。

Claims

1.一种壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为1％的色谱用冰醋酸与甲醇组成的梯度洗脱液，柱温25℃，紫外检测：波长为256nm，流速为1.0ml/min，分析时间为85min；所述梯度洗脱的程序设为时间梯度0min→4min→10min→20min→35min→40min→85min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B1％冰醋酸组成，流动相A的体积百分数梯度10％→10％→18％→23％→25％→40％→40％，流动相B的体积百分数梯度90％→90％→82％→77％→75％→60％→60％；

2.根据权利要求1所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(2)按以下操作进行：精密称取滇桂艾纳香药材粗粉2～8g，加水煎煮3次，每次加水200ml煎煮1.5h，其中第一次加水200ml，先浸泡10～40min后，煎煮；滤过，合并3次煎煮的滤液并浓缩至40ml，放冷，用稀盐酸调pH＝2-3，用乙醚萃取4次，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，并转移至10ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即可。

3.根据权利要求2所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(2)按以下操作进行：精密称取滇桂艾纳香药材粗粉5g，加水煎煮3次，每次加水200ml煎煮1.5h，其中第一次加水200ml，先浸泡30min后，煎煮；滤过，合并3次煎煮的滤液并浓缩至40ml，放冷，用稀盐酸调pH＝2-3，用乙醚萃取4次，每次20ml、15ml、15ml、15ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，并转移至10ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续液即可。

4.根据权利要求1所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(4)按以下操作进行：精密吸取供试品溶液10～20μl注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

5.根据权利要求1所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述指纹图谱共有色谱峰有13个，其保留时间分别为5.919min、14.515min、17.867min、21.74min、24.579min、25.785min、29.338min、31.880min、37.903min、49.410min、51.148min、53.373min、60.022min。