CN115372534B - 一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用 - Google Patents

一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用。所述艾叶制剂特征图谱的构建方法包括以下步骤：(1)配制艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液；(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测，得到特征图谱；其中，检测以十八烷基硅胶键合填充剂，以乙腈为流动相A、含酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱。本发明提供了一种艾叶及其制剂UPLC特征图谱的构建方法及其质量鉴别方法，加强艾叶配方颗粒专属性鉴别和整体质量控制，解决掺伪识别问题，从而进行全面质量控制。

Description

一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用
技术领域
本发明属于中药鉴别领域，具体涉及一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用。
背景技术
叶为菊科植物艾Artemisia argyi Lévi，et Vant.的干燥叶。具有温经止血，散寒止痛功能；常用于吐血，崩漏，月经过多，胎漏下血，少腹冷痛，经寒不调，宫冷不孕等，为我国传统常用中药。据考证，艾叶始载于《神农本草经》，列为下品。作为药物正式记载始见于梁代陶弘景《名医别录》，为中医临床常用中药。
通过药材市场调查发现，市场销售艾叶存在伪品或掺伪情况，常见为水蒿。水蒿为菊科蒿属植物Artemisia selengensis Turcz.ex Bess.的干燥叶。与艾叶属于同属，药材性状相似。目前常用鉴别方法为植物生态学鉴定、药材外观性状鉴定等，该方法需要鉴定人有丰富的药材鉴定经验。但经炮制后饮片状态下极为相像，掺伪后极难发现，尤其是配方颗粒经过水提取后，失去了药材原有的外观性状特征，提取物是否来源于艾叶原料或水蒿原料神仙难辨。造成艾叶配方颗粒质量难以监控，无法区分伪品或掺伪现象。
目前《中国药典》标准对艾叶药材控制以挥发油中桉油精、龙脑成分进行定性、定量分析，不适用于水提取制剂质量控制。现有技术对艾叶药材研究较多，如测定挥发油总含量、利用液相色谱法测定有机酸含量和黄酮类含量，还有液相指纹图谱控制等。
然而这些针对的是艾叶药材的质量控制，艾叶配方颗粒在水提取工艺后，其物质基础与药材成分不尽相同，目前尚未见有关于艾叶配方颗粒的质量控制方法的报道，无法满足艾叶配方颗粒产品真伪及掺伪鉴别质量监管的需求。
而现有技术中存在艾叶和野艾叶指纹图谱及多成分含量测定研究，以及通过特征图谱对蕲艾品质进行评价研究，现有技术中，艾叶与野艾叶表征的物质成分相同，区分差异点为指标成分含量高低，配方颗粒经水提取后物质成分及指标成分高低都会发生明显变化，不适用于艾叶配方颗粒的鉴别；而且现有技术方法通过指标成分高低区分艾叶与水蒿药材，但无法识别失去外观性状后的混掺现象，不能满足艾叶质量监控需求。最后这两种方法检测时间长，时效性不强；标准物质耗费操作耗时，人力物力成本高。
因此，亟待开发一种能够解决针对市场上常见的艾叶配方颗粒掺伪现象无法识别的问题，加强艾叶配方颗粒专属性鉴别和整体质量控制，从而进行全面质量控制的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用。本发明构建了一种艾叶水煎剂及配方颗粒的UPLC特征图谱，可以鉴别艾叶产品掺伪情况，为艾叶产品的质量控制及监控提供切实可行的技术手段。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，所述艾叶制剂特征图谱的构建方法包括以下步骤：
(1)配制艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液；
(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测，得到特征图谱；其中，检测以十八烷基硅胶键合填充剂，以乙腈为流动相A、含酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱。
在本发明中，针对市场上常见的艾叶配方颗粒掺伪现象无法识别的问题，提供了一种艾叶产品UPLC特征图谱的构建方法及其质量鉴别方法，加强艾叶配方颗粒专属性鉴别和整体质量控制，从而有效解决掺伪识别问题，实现对艾叶药材和/或艾叶制剂进行全面质量控制。
优选地，步骤(1)中，所述艾叶制剂包括艾叶饮片、艾叶冻干粉或艾叶配方颗粒中的任意一种。
优选地，步骤(1)中，所述艾叶药材的溶液或艾叶制剂的溶液的浓度各自独立地为5mg/mL-12mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL等。
优选地，所述艾叶制剂的溶液包括艾叶制剂粉末供试品溶液或艾叶制剂的水煎剂供试品溶液。
优选地，所述艾叶制剂粉末供试品溶液由以下方法制备得到：取待检测的艾叶制剂粉末和甲醇水溶液混合，超声处理，得到艾叶制剂粉末供试品溶液。
优选地，所述艾叶制剂的水煎剂供试品溶液由以下方法制备得到：取待检测的艾叶制剂粉末和水混合，加热回流，过滤得到滤液，再将所述滤液和甲醇水溶液混合，超声处理，得到艾叶制剂粉末供试品溶液。
优选地，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为50-80％，例如可以是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％等。
优选地，所述超声处理的功率为200-300W，例如可以是200W、220W、240W、260W、280W、300W等，超声处理的频率为35-45kHz，例如可以是35kHz、36kHz、38kHz、40kHz、42kHz、44kHz、45kHz等，超声处理的时间为20-60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、50min、60min等。
优选地，所述加热回流的时间为20-60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、50min、60min等。
优选地，步骤(2)中，所述含酸水溶液为体积百分含量为0.05-0.1％(例如可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％等)的甲酸水溶液。
优选地，步骤(2)中，所述检测的柱温为30-40℃(例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)，检测的波长为340-360nm(例如可以是340nm、345nm、350nm、355nm、360nm等)，检测的流速为0.25-0.35mL/min(例如可以是0.25mL/min、0.28mL/min、0.29mL/min、0.3mL/min、0.31mL/min、0.32mL/min、0.35mL/min等)。
优选地，步骤(2)中，所述梯度洗脱的程序如下所示：
第0min，洗脱液中流动相A的体积占比为6％，流动相B的体积占比为94％；后匀速变化至第15min，流动相A的体积占比为15％，流动相B的体积占比为85％；后在15-19min内恒定流动相A的体积占比为15％，流动相B的体积占比为85％；最后匀速变化至第35min，流动相A的体积占比为39％，流动相B的体积占比为61％。
优选地，所述的构建方法还包括采用艾叶对照品制备对照品溶液的步骤，以及按照上述的构建方法中的超高效液相色谱检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤。
第二方面，本发明提供一种艾叶及其制剂特征图谱，所述特征图谱由如所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法得到；所述特征图谱包括11个特征峰。
优选地，所述特征图谱包括11个特征峰，出峰对应物质名称分别为：峰1新绿原酸、峰2绿原酸、峰3新绿原酸、峰4 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、峰6异绿原酸B、峰7异绿原酸A、峰8异绿原酸C、峰10棕矢车菊素、峰11异泽兰黄素。
优选地，所述峰2、峰4、峰8应分别与绿原酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的对照品参照峰保留时间相对应；且以异绿原酸C所对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％(例如可以是-10％、-5％、0％、5％、10％等)之内。
优选地，所述峰2的对应相对保留时间为0.19min，峰4的对应相对保留时间为0.36min，峰8的对应相对保留时间为1.00min。
优选地，其余各特征峰对应相对保留时间规定值分别为：峰1为0.11min、峰3为0.22min、峰5为0.55min、峰6为0.81min、峰7为0.82min、峰9为1.33min、峰10为1.42min、峰11为1.60。
第三方面，本发明提供一种所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、所述的艾叶及其制剂特征图谱在艾叶相关产品的质量检测中的应用。
第四方面，本发明提供一种艾叶的质量检测方法，所述艾叶的质量检测方法分别采用如所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法对艾叶产品和水蒿产品进行检测；
其中，艾叶产品在峰2和峰4之间无明显特征峰，而水蒿产品在峰2和峰4之间存在明显特征峰。
优选地，所述检测还包括：采用下述公式计算的相对峰面积比值K23范围对艾叶有水蒿掺伪情况进行鉴定：
其中，S23为水蒿产品在峰2和峰4之间存在的明显特征峰的面积，S4为峰4的面积，即饮片水煎煮后转化生成峰的面积。
其中，待检测的样品的色谱图中峰2和峰3之间有具有明显特征峰，且K23≥0.35，则样品为水蒿；待检测样品的色谱图中峰2和峰3之间无明显特征峰，且K23＜0.10，则样品为艾叶；待检测样品峰2和峰3之间之间有特征峰，且0.10≤K23＜0.35，则艾叶有水蒿掺伪情况。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明构建了一种艾叶水煎剂及配方颗粒的UPLC特征图谱，充分展示了艾叶配方颗粒及其常见伪品提取物的化学成分特征，可以鉴别艾叶配方颗粒及其常见伪品水蒿提取物或水蒿提取物掺伪情况为艾叶配方颗粒质量控制及监控提供切实可行的技术手段；
(2)本发明建立的艾叶水煎剂及配方颗粒的UPLC特征图谱，适用于艾叶药材，且比艾叶药材多一个目标峰。为艾叶及其制剂提供一种快速、可靠、稳定的检测方法；
(3)本发明构建的特征图谱能够全面地反应艾叶与及其制剂的特征峰信息，且方法稳定，精密度高，重现性较好。
附图说明
图1为实施例1提供的艾叶与水蒿饮片水煎剂比较特征图谱。
图2为实施例2提供的艾叶与水蒿配方颗粒特征比较特征图谱。
图3为实施例3提供的艾叶饮片、水蒿饮片与艾叶配方颗粒、水蒿配方颗粒特征比较特征图谱。
图4为实施例5提供的方法一梯度条件下艾叶色谱图。
图5为实施例5提供的方法二梯度条件下艾叶色谱图。
图6为实施例5提供的方法三梯度条件下艾叶色谱图。
图7为实施例5提供的方法四梯度条件下艾叶色谱图。
图8为实施例5提供的方法五梯度条件下艾叶色谱图。
图9为实施例5提供的方法六梯度条件下艾叶色谱图。
图10为实施例5提供的方法七梯度条件下艾叶色谱图。
图11为实施例7提供的专属性验证中的艾叶阴性供试品特征谱图。
图12为实施例7提供的专属性验证中的艾叶供试品特征谱图。
图13为实施例7提供的延迟性验证中的艾叶供试品特征谱图。
图14为实施例7提供的耐用性中采用柱1检测的艾叶供试品特征谱图。
图15为实施例7提供的耐用性中采用柱2检测的艾叶供试品特征谱图。
图16为实施例7提供的耐用性中采用柱3检测的艾叶供试品特征谱图。
图17为实施例8提供的16批艾叶冻干粉的特征谱。
图18为实施例8提供的对照图谱。
图19为实施例8提供的峰1(新绿原酸)对应谱图。
图20为实施例8提供的峰2(绿原酸)、峰3(隐绿原酸)、峰4(1,3-O-二咖啡酰奎宁酸)、峰7(异绿原酸A)、峰11(异泽兰黄素)对应谱图。
图21为实施例8提供的峰6(异绿原酸B)、峰7(异绿原酸A)对应谱图。
图22为实施例8提供的峰8(异绿原酸c)对应谱图。
图23为实施例8提供的峰10(棕矢车菊素)对应谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
仪器、试剂与试药如下所示：
仪器：JY20002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；BSA124S电子天平(赛多利斯)；ME104E电子天平(梅特勒·托利多)；KQ-300DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；DHG-9245A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；调温电热套(ZDHW，北京中兴伟业仪器有限公司)；岛津GC-2010气相色谱仪(FID检测器)；色谱柱Wonda Cap 5(SN：18D93-07)；Waters ACQUITYUPLC H-Class超高效液相色谱仪(TUV Detector检测器)；
色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；Waters CORTECSC18(2.1×100mm，1.6μm)；Waters CORTECS/>T3(2.1×100mm，1.6μm)；
材料：艾叶饮片(16批)；水蒿饮片(5批)；艾叶配方颗粒(3批)；水蒿配方颗粒(3批)；详细信息见表1所示：
表1
异泽兰黄素对照品(批号：DST200423-001，成都乐美天医药有限公司，纯度≥98％)；
绿原酸(批号：110753-201716，中国食品药品检定研究院，纯度93％)；
1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(批号：111717-201402，中国食品药品检定研究院，纯度94.5％)；
异绿原酸C(批号：P25J6F1794，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98％)；
艾叶对照药材(批号121345-201804，中国食品药品检定研究院，1g/瓶)；
试剂：乙腈(色谱纯)；乙酸乙酯(分析纯)；甲酸(色谱纯)；蒸馏水。
参照物溶液制备：
对照药材参照物溶液制备：鉴于艾叶饮片水煮与否的差异性，结合艾叶供试品制备方法。艾叶对照药材参照物溶液制备方法如下：取艾叶对照药材0.8g，置具塞锥形瓶中，加热回路30min，滤液蒸干，残渣精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30min，放凉，70％甲醇补足减失重量，摇匀，取续滤液，作为艾叶对照药材参照物溶液。
对照品参照物溶液制备：选择峰4(水煮转化峰)、峰8(有机酸)和峰1(黄酮类)作为对照品参照物。制备方法如下：取1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸和异泽兰黄素适量，精密称定，加70％甲醇溶液，制备1ml各含20ug溶液，即得。
实施例1
本实施例提供一种艾叶的质量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)供试品制备：取艾叶饮片和水蒿饮片粉末(过二号筛)0.8g，加水30mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，精密加入70vol％甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放凉，700vol％甲醇补足减失重量，摇匀，取续滤液，得艾叶饮片水煎剂供试品溶液和水蒿饮片水煎剂供试品溶液；
(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测：
色谱柱为Waters CORTECSC18(2.1×100mm，1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸溶液为流动相B，按下表规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为350nm，流速为0.3mL/min；
具体洗脱程序如下所示：
分别精密吸取艾叶和水蒿水煎剂供试品溶液1μL注入液相色谱仪，得到UPLC特征图谱，比较艾叶与水蒿水煎剂特征图谱差异，结果见图1：其中，1为新绿原酸；2为绿原酸；3为新绿原酸；4为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸；6为异绿原酸B；7为异绿原酸A；8为异绿原酸C；10为棕矢车菊素；11为异泽兰黄素；S1～S16：艾叶饮片水煎剂(表1中序号1-16的产品)；S16～S21水蒿饮片水煎剂(表1中序号17-21的产品)。
如图1所示，与艾叶水煎剂特征图谱相比，水蒿水煎剂特征图谱峰2和峰3之间相比艾叶有明显特征峰，命名峰23。此鉴别点能快速、区分艾叶饮片水煎剂与水蒿饮片水煎剂，同时能区分是否有水蒿掺伪情况，为艾叶饮片的质量控制提供了更科学的依据。
实施例2
本实施例提供一种艾叶的质量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)供试品制备：取艾叶和水蒿配方颗粒和冻干粉适量，研细，取约0.2g，精密秤定，精密加入70vol％甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放凉，70vol％甲醇补足减失重量，摇匀，取续滤液，得艾叶配方颗粒供试品溶液和水蒿配方颗粒供试品溶液；
其中，配方颗粒制备方法：取艾叶/水蒿饮片，煎煮两次，一煎加14倍水量，沸腾提取90min；二煎加12倍水，沸腾提取90min；滤过，滤液70℃减压浓缩至相对密度1.10±0.5(65℃)，喷雾干燥，加入辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得；
其中，冻干粉的制备方法：取艾叶饮片，煎煮两次，加(14，11)倍水，煎煮时间(20，15)min，滤过，滤液65℃减压浓缩至相对密度1.10±0.5(65℃)，冷冻干燥，即得。
(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测：色谱条件与系统适用性与实施例1完全相同；
分别精密吸取艾叶和水蒿配方颗粒供试品溶液1μL注入液相色谱仪，得到UPLC特征图谱，比较艾叶与水蒿配方颗粒特征图谱差异，结果见图2：其中，1为新绿原酸；2为绿原酸；3为新绿原酸；4为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸；6为异绿原酸B；7为异绿原酸A；8为异绿原酸C；10为棕矢车菊素；11为异泽兰黄素；S1～S3：艾叶标准汤剂冻干粉；S4～S6艾叶配方颗粒；S7～S9：水蒿配方颗粒。
与艾叶配方颗粒特征图谱相比，水蒿配方颗粒特征图谱峰2和峰3之间相比艾叶有明显特征峰。此鉴别点能快速、区分艾叶配方颗粒与水蒿配方颗粒，同时能区分是否有水蒿掺伪情况，为艾叶配方颗粒的质量控制提供了更科学的依据。
实施例3
本实施例提供一种艾叶的质量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取艾叶和水蒿饮片粉末(过二号筛)适量，取约0.2g，精密秤定，精密加入70vol％甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放凉，70vol％甲醇补足减失重量，摇匀，取续滤液，得艾叶和水蒿饮片供试品溶液；
(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测：色谱条件与系统适用性与实施例1完全相同；
分别精密吸取艾叶和水蒿饮片供试品溶液1μL注入液相色谱仪，得到UPLC特征图谱，比较艾叶饮片、水蒿饮片、艾叶配方颗粒、水蒿配方颗粒特征图谱差异，结果见图3：其中，1为新绿原酸；2为绿原酸；3为新绿原酸；4为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸；6为异绿原酸B；7为异绿原酸A；8为异绿原酸C；10为棕矢车菊素；11为异泽兰黄素；S1：艾叶配方颗粒；S2：艾叶饮片；S3：水蒿饮片；S5：水蒿配方颗粒。
结果分析：艾叶与水蒿配方颗粒均呈现11个特征峰；艾叶与水蒿饮片呈现10个特征峰；饮片中峰4(1,3-O-二咖啡酰奎宁酸)峰高很低，几乎没有，经过水提取、浓缩、干燥等工艺后，配方颗粒峰4出峰明显。以峰8(异绿原酸C)为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，规定值为：0.11(峰1)、0.22(峰3)、0.55(峰5)、0.81(峰6)、0.82(峰7)、1.33(峰9)、1.42(峰10)、1.60(峰11)，允许误差±10％。该特征图谱方法适用于艾叶饮片，与艾叶饮片特征图谱相比，艾叶配方颗粒峰4为明显转化生成，几乎从无到有。
实施例4
本实施例提供一种艾叶的质量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
结合实施例1艾叶与水蒿鉴别峰，选择峰23与峰4相对峰面积，鉴别艾叶饮片及配方颗粒与水蒿，同时鉴别是否有水蒿掺伪情况；分别对上述提供的艾叶饮片水煎剂、艾叶冻干粉、艾叶配方颗粒、水蒿水煎剂、水蒿冻干粉、水蒿配方颗粒中峰23和峰4相对峰面积K23进行计算，结果如下表2、表3
表2
表3
结果分析：分析数据发现，艾叶饮片水煎剂、冻干粉和配方颗粒K23范围为0.006～0.082；水蒿饮片水煎剂、冻干粉和配方颗粒K23范围为0.369～0.844；两者差异明显。故根据次数值结果可区分艾叶及水蒿。
若待鉴别样品峰23之间有明显色谱峰且K23≥0.35，则样品为水蒿；若待鉴别样品峰23之间无明显色谱峰且K23＜0.10，则样品为艾叶；若待鉴别样品峰23之间有色谱峰且0.10≤K23＜0.35，则艾叶有水蒿掺伪情况。
实施例5
本实施例提供一种特征图谱的构建方法中流动相梯度优化
以下个方法均采用同一样品进行检测，该测试样品为：艾叶冻干粉200514-474450-17。
方法一：采用Waters ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)为色谱柱，乙腈和0.1％甲酸为流动相，按如下程序进行梯度洗脱；检测波长为350nm，柱温35℃，流速0.2mL/min；
结果如图4所示，谱图结果显示，色谱峰数目较多，主要集中在5-28min出峰，但是峰形不佳，色谱峰分离度不好，需在此基础上进行优化。
方法二：采用Waters ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱，流动相为乙腈和0.1％甲酸，按如下程序进行梯度洗脱；检测波长为350nm，柱温35℃，流速0.2mL/min；
结果如图5所示，谱图结果显示，方法二的色谱峰出峰时间主要集中在前面，且色谱峰分离不好，需继续进行优化。
方法三：采用Waters ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱，流动相为乙腈和0.1％甲酸，按如下程序进行梯度洗脱；检测波长为350nm，柱温35℃，流速0.2mL/min；
结果如图6所示，由色谱图可知，相比于方法二，色谱峰分离稍有改善，但是8-16min的色谱峰依然无法分离，考虑可能是色谱柱粒径的原因，因此考虑更换1.6μm色谱柱继续进行优化。
方法四：更换色谱柱为Waters CORTECSC18(2.1×100mm，1.6μm)色谱柱，流动相为乙腈和0.05％甲酸，按如下程序进行梯度洗脱；检测波长为350nm，柱温35℃，流速0.2mL/min；
结果如图7所示，由色谱图可知，更换色谱柱后，色谱峰分离有了明显的改善，可在此基础上继续进行优化，以达到更好的分析。
方法五：将方法四中的流速改为0.3mL/min，其它不变。
结果如图8所示，由色谱图可知，升高流速后，色谱峰没有变化，因此后续继续以0.3mL/min的流速继续进行优化。
方法五：Waters CORTECSC18(2.1×100mm，1.6μm)色谱柱，流动相为乙腈和0.05％甲酸，按如下程序进行梯度洗脱；检测波长为350nm，柱温35℃，流速0.3mL/min；
结果如图9所示，由色谱图可知，整体色谱峰比较靠前，且中间24-35min没有色谱峰，考虑继续进行优化，使色谱峰更好的分离且使色谱峰分布更美观、合理。
方法七：Waters CORTECSC18(2.1×100mm，1.6μm)色谱柱，流动相为乙腈和0.05％甲酸，按如下程序进行梯度洗脱；检测波长为350nm，柱温35℃，流速0.3mL/min；
结果如图10所示，由色谱图可知，色谱图中各个色谱峰都得到了良好的分离，且峰形较好，色谱图美观、合理，因此，最终选择此色谱分析条件作为特征图谱的液相分析方法。
实施例6
本实施例提供一种特征图谱的构建方法中供试品溶液的制备考察
以下个方法均采用同一样品进行检测，该测试样品为：艾叶冻干粉200514-474450-17。
供试品溶液制备方法根据《国家药品标准工作手册》第4版关于供试品溶液制备相关规定，结合样品本身溶解性对提取溶剂的类型、溶液的浓度、提取方式和提取时间进行考察。
(1)提取方法的考察
取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇25mL，称定重量，分别90℃回流、超声处理(功率250W，频率40kHz)40min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μL，注入液相色谱仪，按正文方法测定，测定各峰峰面积，结果不同提取方式峰面积见表4：
表4
按取样量、折算同一条件峰面积进行比较，并做柱形图，得同一条件下不同提取方式峰面积见表5：
表5
由上表4和表5结果可知，两种提取方法下，各特征图谱峰面积差异不大，考虑样品操作简便性及经济性，选择超声作为艾叶特征图谱供试品制备提取方法。
(2)提取溶剂的选择
取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入溶剂水、乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇各25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40min，取出，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μL，注入液相色谱仪，按正文方法测定，测定各峰峰面积，结果见表6：
表6
按取样量、折算同一条件峰面积进行比较，结果如下表7所示：
表7
由上表6和表7结果可知，两种提取方法下，各特征图谱峰面积差异不大，考虑样品操作简便性及经济性，选择超声作为艾叶特征图谱供试品制备提取方法。
(3)提取时间的考察
取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)20min、40min、60min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μL，注入液相色谱仪，按正文方法测定，测定各峰峰面积，结果如下表8所示：
表8
按取样量、折算同一条件峰面积进行比较，结果如表9所示：
表9
/>
由上表8和表9结果可知，20min时各个特征峰已经提取完全，三个提取时间结果无差异，选择常规时间30min作为供试品制备提取时间。
(4)提取时间的考察
取本品适量，研细，分别取0.3g、0.2g、0.1g、0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL、25mL、15mL、20mL；称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密吸取续滤液1μL，注入液相色谱仪，按正文方法测定，测定各峰峰面积，结果如下表10所示：
表10
按取样量、样品浓度折算同一条件峰面积进行比较，结果如下表11所示：
表11
由上表10和表11结果可知，不同提取浓度下各特征峰无差异，说明样品在0.3-25时已经提取完全，考虑到批次间的差异性，最终选择0.2g/25mL作为最终的提取浓度。
综上所述，艾叶供试品溶液的处理方法为：取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例7
本实施例提供方法学验证
1、精密度
(1)重复性：组员一采用仪器一Waters UPLC H-Class，TUV检测器，取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)样品适量，研细，取0.2g，共6份，按正文色谱条件测定，获得其特征图谱，以8号峰(异绿原酸C)为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果艾叶重复性考察保留时间及相对保留时间表如下表12所示：
表12
艾叶重复性考察峰面积及相对峰面积表如下表13所示：
表13
重复性实验结果显示六个重复性实验样品的11个特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，相对峰面积的RSD均小于3％，表明该特征图谱的重复性较好。
(2)中间精密度：组员二采用仪器二超高效液相色谱仪，取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)样品适量，研细，取0.2g，取6份，按正文色谱条件测定，获得其特征图谱，以8号峰(异绿原酸C)为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。艾叶中间精密度考察保留时间及相对保留时间如表14所示：
表14
艾叶中间精密度考察峰面积及相对峰面积表如表15所示：
表15
中间精密度结果显示，采集获得的特征峰图谱中11个标识峰的相对保留时间RSD均小于1％，相对峰面积的RSD均小于2％，不同仪器间特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5％，表明该特征图谱的中间精密度符合分析要求。
2、稳定性
取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)样品适量，研细，取0.2g，按正文方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按正文方法进行测定，获得其特征图谱，以8号峰(异绿原酸C)为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果稳定性相对保留时间表如下表16所示：
表16
稳定性相对峰面积表如下表17所示：
表17
稳定性实验结果显示，经过考察24h溶液稳定性，各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％；相对峰面积的RSD均小于4％，表明本实验所采用的特征图谱供试品制备方法在24h内较稳定。
3、专属性
取艾叶标准汤剂冻干粉供试品溶液、70％甲醇溶剂阴性对照溶液按正文方法获得其色谱图。其中，艾叶阴性供试品特征谱图如图11所示，艾叶供试品特征谱图如图12所示，由色谱图可知，在供试品溶液出峰位置，阴性对照溶液中无色谱峰出现，该方法的专属性较好。
4、延迟性
取艾叶标准汤剂冻干粉供试品溶液进行检测，在洗脱最终梯度条件下继续运行一倍采集时间，得到的色谱图见图13所示，由色谱图可知，35min后没有色谱峰出现，建立的分析方法对后续样品分析没有影响。
5、耐用性
(1)不同5流速考察：取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品。分别采用0.28mL/min、0.30mL/min及0.32mL/min的流速按正文方法进行测定，考察实验方法对于不同流速的耐用性。
不同流速特征图谱保留时间测定结果如下表18所示：
表18
不同流速特征图谱峰面积测定结果如下表19所示：
表19
不同流速条件下，特征图谱中11个特征峰的相对保留时间RSD值均小于4％；相对峰面积的RSD值均小于3％，说明该方法在0.28-0.32ml/min之间对流速的耐用性较好。
(2)不同柱温的考察：
取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)，按正文供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于33℃、35℃及37℃的柱温下，按正文方法进行测定。考察实验方法对于不同柱温的耐用性。
不同柱温特征图谱保留时间测定结果如下表20所示：
表20
不同柱温特征图谱保留时间测定结果如下表21所示：
表21
不同柱温条件下，特征图谱中11个特征峰的相对保留时间RSD值均小于3％；相对峰面积RSD值均小于4％，说明该方法对33-37℃之间柱温的耐用性较好。
(3)不同波长的考察：
取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)，按正文方法制备供试品。分别采用348nm、350nm及352nm的波长，用正文方法测定，考察实验方法对于不同检测波长的耐用性。
不同波长特征图谱保留时间测定结果如下表22所示：
表22
不同波长特征图谱保留时间测定结果如下表23所示：
表23
小结：不同波长条件下，特征图谱中11个特征峰的相对保留时间RSD值均小于1％；相对峰面积RSD值除峰5、峰10、峰11外，均小于4％。说明该方法峰5、峰10、峰11对波长耐用性稍差，其余特征峰在348-352nm之间波长的耐用性较好。
(4)不同甲酸浓度的考察：
取艾叶标准汤剂冻干粉(批号：200514-474450-17)，按正文方法制备供试品。分别采用流动相0.03％甲酸、0.05％甲酸、0.07％甲酸，用正文方法测定，考察实验方法对于不同甲酸浓度的耐用性。
不同甲酸浓度特征图谱保留时间测定结果如下表24所示：
表24
不同甲酸浓度特征图谱峰面积测定结果如下表25所示：
表25
小结：不同甲酸浓度条件下，特征图谱中11个特征峰的相对保留时间RSD值均小于4％；相对峰面积RSD值除峰3外均小于5％。说明峰3对该方法甲酸浓度耐用性稍差，其余特征峰在甲酸0.03％-0.07％之间的耐用性较好。
(4)不同甲酸浓度的考察：：
取艾供试品(批号：200514-474450-17)，按正文色谱方法制备供试品。分别用不同固定相色谱柱：
柱1：Waters ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)
柱2：Waters CORTECSC18(2.1×100mm，1.6μm)
柱3：Waters CORTECST3(2.1×100mm，1.6μm)
其中，柱1特征图谱如图14所示，柱2特征图谱如图15所示，柱3特征图谱如图16所示，如图所示，色谱柱1中色谱峰峰形不佳，峰6和峰7色谱峰未分离，色谱柱3中峰5分叉，峰形不好，综合比较上述三个色谱柱，以色谱柱2的特征峰峰形更好，该方法对其它两个色谱柱耐用性稍差。
如上所述：通过对艾叶标准汤剂冻干粉特征图谱方法供试品制备、方法学验证和耐用性考察，本次研究建立的艾叶特征图谱方法符合分析要求。
实施例8
本实施例提供对16批艾叶冻干粉的质量检测方法：
1、样品检测方法及结果分析
(1)供试品制备：分别取16批艾叶冻干粉，按照实施例2的方法配制供试品溶液；
(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测：色谱条件与系统适用性与实施例1完全相同；得到16批艾叶冻干粉的特征谱图17，再使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，以液相图谱为参照图谱，按中位数时间窗，进行共有峰的标识，并生成对照图谱见图18。
计算各特征峰与8号峰(异绿原酸C)的相对保留时间和相对峰面积，对16批艾叶标准汤剂冻干粉特征图谱进行数据处理，其结果如表26所示：
表26
由16批艾叶标准汤剂冻干粉特征图谱可知，艾叶标准汤剂特征图谱中确认共有峰应为11个特征峰，由特征图谱可以看出8号峰分离度、峰形较好，标为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间RSD％范围为0.11％～1.60％，均小于10％，比较稳定，故对艾叶特征图谱相对保留时间进行规定。规定值为：0.11(峰1)、0.19(峰2)、0.22(峰3)、0.36(峰4)、0.55(峰5)、0.81(峰6)、0.82(峰7)、1.33(峰9)、1.42(峰10)、1.60(峰11)。误差范围±10％。
2、特征峰确认：
对照品溶液制备：收集新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、棕矢车菊素、异泽兰黄素9个对照品，加70％甲醇溶液，制备1ml各含20ug溶液，即得
取对照品溶液、供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，按照确定色谱条件测定，结果如图19-23所示。谱图确认结果显示：1号峰为新绿原酸，2号峰为绿原酸，3号峰为隐绿原酸，4号峰为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸，6号峰为异绿原酸B，7号峰为异绿原酸A，8号峰为异绿原酸C，9号峰为棕矢车菊素，11号峰为异泽兰黄素。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述艾叶及其制剂特征图谱的构建方法包括以下步骤：
(1)配制艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液；
(2)采用超高效液相色谱对艾叶药材和/或艾叶制剂的溶液进行检测，得到特征图谱；其中，检测色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述色谱柱参数为2.1×100mm，1.6μm，以乙腈为流动相A、含酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；
其中，步骤(2)中，所述含酸水溶液为体积百分含量为0.05-0.1％的甲酸水溶液；
步骤(2)中，所述梯度洗脱的程序如下所示：
第0min，洗脱液中流动相A的体积占比为6％，流动相B的体积占比为94％；后匀速变化至第15min，流动相A的体积占比为15％，流动相B的体积占比为85％；后在15-19min内恒定流动相A的体积占比为15％，流动相B的体积占比为85％；最后匀速变化至第35min，流动相A的体积占比为39％，流动相B的体积占比为61％；
所述艾叶制剂的溶液包括艾叶制剂粉末供试品溶液或艾叶制剂的水煎剂供试品溶液；
所述艾叶制剂粉末供试品溶液由以下方法制备得到：取待检测的艾叶制剂粉末和甲醇水溶液混合，超声处理，得到艾叶制剂粉末供试品溶液；
所述艾叶制剂的水煎剂供试品溶液由以下方法制备得到：取待检测的艾叶制剂粉末和水混合，加热回流，过滤得到滤液，再将所述滤液和甲醇水溶液混合，超声处理，得到艾叶制剂粉末供试品溶液；
所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为50-80％；
所述特征图谱包括11个特征峰，出峰对应物质名称分别为：峰1新绿原酸、峰2绿原酸、峰3新绿原酸、峰4 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、峰6异绿原酸B、峰7异绿原酸A、峰8异绿原酸C、峰10棕矢车菊素、峰11异泽兰黄素。
2.根据权利要求1所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述艾叶制剂包括艾叶饮片、艾叶冻干粉或艾叶配方颗粒中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述艾叶药材的溶液或艾叶制剂的溶液的浓度各自独立地为5mg/mL-12mg/mL。
4.根据权利要求1所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超声处理的功率为200-300W，超声处理的频率为35-45kHz，超声处理的时间为20-60min。
5.根据权利要求1所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述加热回流的时间为20-60min。
6.根据权利要求1所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述检测的柱温为30-40℃，检测的波长为340-360nm，检测的流速为0.25-0.35mL/min。
7.根据权利要求1所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用艾叶对照品制备对照品溶液的步骤，以及检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法在艾叶相关产品的质量检测中的应用。
9.一种艾叶的质量检测方法，其特征在于，所述艾叶的质量检测方法分别采用如权利要求1-7中任一项所述的艾叶及其制剂特征图谱的构建方法对艾叶产品和水蒿产品进行检测，得到艾叶及其制剂的特征图谱；
所述特征图谱包括11个特征峰，出峰对应物质名称分别为：峰1新绿原酸、峰2绿原酸、峰3新绿原酸、峰4 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、峰6异绿原酸B、峰7异绿原酸A、峰8异绿原酸C、峰10棕矢车菊素、峰11异泽兰黄素；
所述峰2、峰4、峰8应分别与绿原酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的对照品参照峰保留时间相对应；且以异绿原酸C所对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％之内；
所述各特征峰对应相对保留时间规定值分别为：峰1为0.11min、峰2为0.19min、峰3为0.22min、峰4为0.36min、峰5为0.55min、峰6为0.81min、峰7为0.82min、峰8为1.00min、峰9为1.33min、峰10为1.42min、峰11为1.60min；
其中，艾叶产品在峰2和峰4之间无明显特征峰，而水蒿产品在峰2和峰4之间存在明显特征峰。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，所述检测还包括：采用下述公式计算的相对峰面积比值K23范围对艾叶有水蒿掺伪情况进行鉴定：
其中，S23为水蒿产品在峰2和峰4之间存在的明显特征峰的面积，S4为峰4的面积，即饮片水煎煮后转化生成峰的面积；
其中，待检测的样品的色谱图中峰2和峰3之间有具有明显特征峰，且K23≥0.35，则样品为水蒿；待检测样品的色谱图中峰2和峰3之间无明显特征峰，且K23＜0.10，则样品为艾叶；待检测样品峰2和峰3之间有特征峰，且0.10≤K23＜0.35，则艾叶有水蒿掺伪情况。
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