CN109187810B - 一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药组合物领域，具体涉及一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法。本发明所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物由昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子组成，该检测方采用一测多评法，建立了同时测定黄酮类化合物：金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ的检测方法，以金丝桃苷为内参物，有效地控制了昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子产品质量，方法简单便捷，为更好地保证治疗类风湿性关节炎中药组合物临床疗效奠定基础，也为富含黄酮类化合物的中药检测提供参考。

Description

一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法

技术领域

本发明属于中药组合物领域，具体涉及一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法。

背景技术

类风湿关节炎是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失，治疗类风湿性关节炎的药主要为非甾体抗炎药、糖皮质激素、生物制剂和中药制剂，中药以及中药制剂治疗表现出整体调节、多层次、多靶点的特点，而且还能缓解和对抗西药毒副作用，近年来越来越受到人们的重视。

在治疗类风湿性关节炎中药组合物中，多以含有黄酮类化合物发挥疗效，如处方由昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子四味中药组成的治疗类风湿性关节炎中药组合物，其具有补肾通络、祛风除湿的功效，主治类风湿关节炎属风湿痹阻兼肾虚证，现代药理学和临床研究还表明，该组合物具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制等作用，用于免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎等。

随着对中药组合物的使用增多，对其质量评价方法也备受关注，治疗类风湿性关节炎中药组合物的单味药材中化学成分有黄酮类、生物碱、萜类、糖苷类等多种有效成分，其中以黄酮类化合物居多，可用来评价中药组合物的质量。专利文献CN201711130716.3公开了一种检测鱼腥草黄酮类成分含量的HPLC方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取鱼腥草粉末，用低级醇提取，过滤得供试品溶液；(2)对照品溶液制备：取金丝桃苷和槲皮苷对照品，混合，加低级醇配置成混合对照品溶液；(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：C18色谱柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；洗脱程序：等度洗脱30min，A与B的体积比为18～22：82～78；检测波长：205nm；(4)根据检测结果计算得到鱼腥草中金丝桃苷和槲皮苷的含量。

该方法中采用标准曲线法，分别建立了金丝桃苷和槲皮苷的标准曲线，该检测方法准确可靠，简便快速，为提高鱼腥草质量控制水平奠定了基础，但对于中药组合物的质量控制并不简便，需测定多种黄酮类化合物的标准曲线，耗费人力、物力、财力，并且有些有效成分因难以提取纯化，难以获得纯度符合建立标准曲线的对照品，使实际含量检测难以执行，不建议作为中药组合物的质量控制。

本领域公知，现有技术多采用外标法或内标法测定中药组合物中多指标成分含量，但外标法或内标法需要提供多种指标成分的对照品以及内标物，检测过程中耗费大量物资，为实现绿色环保节约的产业化目标，有必要提供一种简便、可同时检测多种有效成分的治疗类风湿性关节炎中药组合物的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，所述治疗类风湿性关节炎中药组合物的由昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子组成，本发明以金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ10种黄酮类化合物作为检测指标，可同时测定10种黄酮类成分的含量，以评价治疗类风湿性关节炎中药组合物中昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子的质量，提高其应用的可行性和适用性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物由昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子组成；

该检测方法以金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ作为昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子的检测指标，检测步骤如下：

S1混合对照品溶液的制备：精密称定金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ对照品，80％甲醇溶液溶解定容、摇匀，得含有96.8μg/ml金丝桃苷、119.04μg/ml朝藿定B、213.2μg/ml朝藿定A、257.32μg/ml朝藿定C、390μg/ml淫羊藿苷、4.136μg/ml木犀草素、42.24μg/ml槲皮素、16.69μg/ml川陈皮素、24.416μg/ml山奈酚和17.984μg/ml宝藿苷Ⅰ的混合对照品溶液；

S2待测样品的制备：精密称量治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇溶液20ml，所述治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末与乙醇溶液物液比为1g:(66-68)ml，称定重量，超声20-40min，超声功率240-260W，室温冷却，称定重量，乙醇溶液补足减轻的重量，摇匀，转速为10000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得待测样品；

S3色谱条件：高效液相检测法，流动相A相为乙腈，B相为0.2％磷酸溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，取步骤S1中混合对照品溶液和S2中待测样品10μL，进样，梯度洗脱，检测，洗脱时间和条件如下：

方法中，以金丝桃苷为内参物，分别计算朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚、宝藿苷Ⅰ的相对校正因子f，f的计算公式如下：

f_s/i＝f_s/f_i＝(A_s×C_i)/(A_i×C_s)

式中A_s为内参物对照品S的峰面积，C_s为内参物对照品S的浓度，A_i为某待测成分对照品i的峰面积，C_i为某待测成分对照品i的浓度，按照外标法测定内参物峰面积A_s，利用各成分的f和内参物的实测值，计算待测样品成分的含量。

进一步地，所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法中步骤S2中超声时间为30min。

进一步地，所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法中步骤S2中的乙醇溶液为80％(v/v)乙醇水溶液。

进一步地，所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法中步骤S3的高效液相检测法的检测器为多波长选择的安捷伦二极管阵列(DAD)检测器，型号1200。

进一步地，所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法中步骤S3中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料孔径5μm，厂家为美国沃特世公司，型号为symmetry Shield^TM。

进一步地，所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法中步骤S3中对照品混合液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ检测波长为270nm，川陈皮素检测波长为325nm，金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚检测波长为360nm。

本发明的治疗类风湿性关节炎中药组合物中含有大量的黄酮类成分，本发明利用高效液相检测法，采用一测多评法，利用中药组合物中有效成分内在函数关系和比例关系，只测定1个有效成分(性质稳定且易得到的对照品)来实现多个成分(性质不稳定且难得到的对照品)的同时测定。

本发明的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法具体以金丝桃苷为内参物，对昆仙胶囊中黄酮类成分：金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ进行含量测定，其中以金丝桃苷为内参物，建立朝藿定A、朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ的相对校正因子，利用相对校正因子计算昆仙胶囊样品中成分的含量，按照中药新药质量标准研究的技术要求，建立治疗类风湿性关节炎中药组合物的综合质量评价方法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的治疗类风湿性关节炎中药组合物得检测方法中采用一测多评法，建立了同时测定黄酮类化合物：金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ的检测方法，以金丝桃苷为内参物，有效地控制了昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子产品质量，方法简单便捷，为更好地保证治疗类风湿性关节炎中药组合物临床疗效奠定基础，也为富含黄酮类化合物的中药检测提供参考。

附图说明

图1：混合对照品高效液相色谱图，1为金丝桃苷、2为朝藿定B、3为朝藿定A、4为朝藿定C、5为淫羊藿苷、6为木犀草素、7为槲皮素、8为川陈皮素、9为山奈酚、10为宝藿苷Ⅰ。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

其中对照品金丝桃苷(质量分数99.9％，批号11521-200303)、淫羊藿苷(质量分数99.9％，批号110737-200415)、木犀草素(质量分数99.9％，批号11520-200201)、槲皮素(质量分数99.9％，批号0081-9304)、山奈酚(质量分数99.9％，批号110861-200405)均购于中国药品生物制品检定所、朝藿定A(质量分数98.13％，批号18031106)、朝藿定C(质量分数98％，批号BP0547)和朝藿定B(质量分数98％，批号BP0546)均购于成都莱宝科技有限公司；宝藿苷Ⅰ(质量分数99.9％，批号201603)购于中国食品药品检定研究院；川陈皮素(质量分数99.46％，批号14100814)购于北京恒元启天化工技术研究院；乙腈为色谱乙腈，磷酸为分析纯，水为超纯水，乙醇为分析纯；10批治疗类风湿性关节炎中药组合物为昆仙胶囊，由陈李济药厂有限公司生产。

实施例1、治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测

采用高效液相检测法的一测多评法，步骤如下：

S1混合对照品溶液的制备：精密称定金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ对照品，80％甲醇溶液溶解定容、摇匀，得含有96.8μg/ml金丝桃苷、119.04μg/ml朝藿定B、213.2μg/ml朝藿定A、257.32μg/ml朝藿定C、390μg/ml淫羊藿苷、4.136μg/ml木犀草素、42.24μg/ml槲皮素、16.69μg/ml川陈皮素、24.416μg/ml山奈酚和17.984μg/ml宝藿苷Ⅰ的混合对照品溶液；

S2色谱条件：检测器安捷伦二极管阵列检测器，型号1200；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm，厂家为美国沃特世公司，型号为symmetry Shield ^TM；流动相A相为乙腈，B相为0.2％磷酸溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，取混合对照品溶液和待测样品2、5、8、10、15、18、20和25μL，进样，梯度洗脱，检测，洗脱时间和条件如下：

记录峰面积，以金丝桃苷为内参物，按照下式分别计算朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚、宝藿苷Ⅰ的相对校正因子f，结果见表1，计算公式如下：

f_s/i＝f_s/f_i＝(A_s×C_i)/(A_i×C_s)

式中A_s为内参物对照品S的峰面积，C_s为内参物对照品S的浓度，A_i为某待测成分对照品i的峰面积，C_i为某待测成分对照品i的浓度。按照外标法测定内参物峰面积A_s，利用各成分的f和内参物的实测值，即可计算待测成分的含量。

表1.各成分的相对校正因子

实施例2、治疗类风湿性关节炎中药组合物的样品处理

待测样品的制备：精密称量治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇20ml，所述治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末与无水乙醇物液比1g:66ml，称定重量，超声20min，室温冷却，称定重量，无水乙醇补足减轻的重量，摇匀，转速为10000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得待测样品。

样品按照实施例1中方法进样测定，进样量10μl。

实施例3、治疗类风湿性关节炎中药组合物的样品处理

待测样品的制备：精密称量治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％乙醇溶液20ml，所述治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末与80％乙醇溶液物液比1g:68ml，称定重量，超声40min，室温冷却，称定重量，80％乙醇补足减轻的重量，摇匀，转速为10000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得待测样品。

样品按照实施例1中方法进样测定，进样量10μl。

实施例4、治疗类风湿性关节炎中药组合物的样品处理

待测样品的制备：精密称量治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％乙醇溶液20ml，所述治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末与80％乙醇溶液物液比1g:67ml，称定重量，超声30min，室温冷却，称定重量，80％乙醇溶液补足减轻的重量，摇匀，转速为10000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得待测样品。

样品按照实施例1中方法进样测定，进样量10μl。

对比例1、治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测

采用高效液相检测法的外标法，步骤如下：

在实施例1中的步骤S1制得的混合对照品和步骤S2中的色谱条件下进样，进样量2、5、8、10、15、18、20和25μL，记录金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ成分的峰面积，利用外标法，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)绘制标准曲线，得对照品金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ的回归方程及线性范围，见表2。

表2. 10种黄酮类成分的线性回归方程

指标成分	回归方程	线性范围/μg	r
				金丝桃苷	Y＝3.4559X+0.1726	0.1936～2.4200	0.9999
朝藿定B	Y＝5.5866X+0.5220	0.2380～2.9760	0.9999
				朝藿定A	Y＝3.4646X+0.2840	0.4264～5.3300	1.0000
朝藿定C	Y＝7.4684X+0.5105	0.5145～6.4330	0.9999
				淫羊藿苷	Y＝13.824X+1.2028	0.7800～9.7500	0.9999
木犀草素	Y＝0.2426X-0.0210	0.0082～0.1034	0.9997
				槲皮素	Y＝2.6432X-0.1182	0.0844～1.0560	0.9998
川陈皮素	Y＝1.2142X+0.1337	0.0333～0.4173	0.9999
				山奈酚	Y＝1.6159X-0.1391	0.0487～0.6104	0.9997
宝藿苷Ⅰ	Y＝0.9585X+0.0024	0.0358～0.4496	0.9999

试验例一、样品的含量测定

(一)、一测多评法和外标法对比

1.试验对象：广州白云山陈李济药厂制得的治疗类风湿性关节炎中药组合物(昆仙胶囊)的样品10批，批号分别为H31001、H31002、H31003、H31004、H31005、f31007、f31008、J31001、J31002和J31006。

2.试验方法：一测多评法和外标法，将实施例2-4制得的治疗类风湿性关节炎中药组合物的样品分别按照实施例1(一测多评法)和对比例1(外标法)进行含量测定，进样量10μl，根据实施例1中一测多评法的相对矫正因子计算各成分含量，根据对比例1中的外标法的回归方程计算各成分含量，比较一测多评与外标法计算的含量的相对误差，并利用SPSS22.0统计软件进行t检验。

3.试验结果：

试验结果如表3。

表3.一测多评法与外标法测得昆仙胶囊中10种黄酮的含量(n＝3)

结果显示各成分两种计算方法的相关系数均大于0.9999，表明一测多评法与外标法计算结果无显著差异，一测多评法可作为该治疗类风湿性关节炎中药组合物(昆仙胶囊)的含量测定，该方法有效准确，利用价廉、易得的典型成分与样品其余成分间的相对校正因子以计算样品中其他成分的量，使检测成本低，分析效率高，适合药厂大批量含量检测。

(二)、一测多评法测定实施例2-4的样品含量。

1.试验对象：实施例2-4制备的待测样品(进样量10μl)。

2.试验方法：按照实施例1(一测多评法)中方法步骤测定的各成分相对校正因子f，计算各成分含量。

3.试验结果：

实施例2-4制备的待测样品中各成分的含量如表4。

表4.各成分的含量(Mean±SD，n＝3)

由表4中结果可知，本发明提供的实施例2、实施例3和实施例4的治疗类风湿性关节炎中药组合物的样品处理方法稳定可行，均可有效测定朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ的含量，值得推广使用。

其中，实施例3的治疗类风湿性关节炎中药组合物的样品利用本发明实施例1的检测方法测得的朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ的含量均略高于实施例2和实施例4的样品含量，说明该样品处理方法中使用80％乙醇溶液、所述治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末与80％乙醇溶液物液比1g:68ml，超声时间为40min的提取效果更优。

试验例二、相对校正因子f的耐用性考察

1.不同柱温对f的影响：考察不同柱温25，28，30，32和35℃对各成分f的影响，结果朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰf的RSD依次为0.57％、1.18％、0.98％、1.08％、2.08％、1.90％、0.76％、2.45％和2.81％，表明柱温的波动对各成分f无显著影响，试验结果如表5。

2.不同流速对f的影响：考察不同流速0.6、0.8、1.0和1.2ml/min对各f的影响，结果朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰf的RSD依次为0.86％、0.73％、0.72％、0.35％、3.68％、0.88％、1.38％、2.87％和1.14％，表明流速的波动对各成分f无显著影响，试验结果如表5。

3.不同色谱柱对f的影响：考察了色谱柱对各成分f的影响，色谱柱的规格为：柱内径4.6mm，柱长250mm，填料孔径5μm的十八烷基键合的反相硅胶色谱柱，厂家和型号如下：

厂家	型号
		沃特世公司(Waters)	Symmetry Shield<sup>TM</sup> RP<sub>18</sub>
安捷伦(Agilent)	Eclipse pluμs C<sub>18</sub>
		安捷伦(Agilent)	Eclipse XDB C<sub>18</sub>
安捷伦(Agilent)	ZORBAX Eclipse XDB-C<sub>18</sub>

结果使用以上色谱柱各成分均能达到较好的分离效果，结果朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰf的RSD依次为1.71％、1.04％、1.48％、0.30％、0.67％、1.49％、2.19％、1.65％和1.24％，表明4根色谱柱对各成分f无显著影响，试验结果如表5。

4.不同仪器对f的影响：考察安捷伦(Agilent)1200(1^#)、安捷伦(Agilent)1200(2^#)和Waters型3种高效液相色谱系统对各成分f的影响，结果朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰf的RSD依次为0.62％、1.52％、0.61％、2.47％、2.20％、0.88％、2.11％、3.24％和1.37％，表明不同仪器对各成分f无显著影响，试验结果如表5。

5.不同实验人员对f的影响：考察3名实验人员对各成分f的影响，结果朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰf的RSD值为1.18％、2.63％、0.48％、3.04％、1.14％、0.58％、2.37％、1.27％、1.41％，表明不同实验人员所得各目标成分的f无显著影响，试验结果如表5。

表5各种因素对f的影响(f值)

综上5种因素，计算朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚、宝藿苷Ⅰf的RSD依次为0.30％、0.81％、1.11％、0.79％、2.24％、0.80％、2.96％、0.57％和1.35％，表明该方法测得的各成分的相对校正因子f耐用性好，适用于治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测。

试验例三、样品成份色谱峰的定位

采用相对保留时间值(待测成份与内参物保留时间之比)对治疗类风湿性关节炎中药组合物(昆仙胶囊)中各待测成份色谱峰进行定位，结果如图1。

以金丝桃苷的保留时间为相对保留时间，各成份的相对保留时间如表6。

表6.各成份的相对保留时间

成分	相对保留时间min	RSD％
			朝藿定B	1.2120	0.27
朝藿定A	1.2593	0.31
			朝藿定C	1.2913	0.34
淫羊藿苷	1.3925	0.37
			木犀草素	2.0936	0.30
槲皮素	2.1956	1.03
			川陈皮素	2.7699	0.32
山奈酚	3.0913	0.28
			宝藿苷Ⅰ	3.4177	0.29

相对保留时间规定值RSD<5％，表明该色谱条件中流动相相对稳定，可用于色谱峰的定位。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，所述治疗类风湿性关节炎的中药组合物由昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子组成，其特征在于，该检测方法以金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ作为昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞子的检测指标；

检测步骤如下：

S1混合对照品溶液的制备：精密称定金丝桃苷、朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚和宝藿苷Ⅰ对照品，80%甲醇溶液溶解定容、摇匀，得含有96.8µg/mL金丝桃苷、119.04µg/mL朝藿定B、213.2µg/mL朝藿定A、257.32µg/mL朝藿定C、390µg/mL淫羊藿苷、4.136µg/mL木犀草素、42.24µg/mL槲皮素、16.69µg/mL川陈皮素、24.416µg/mL山奈酚和17.984µg/mL宝藿苷Ⅰ的混合对照品溶液；

S2样品的制备：精密称量治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇溶液20mL，所述治疗类风湿性关节炎中药组合物粉末与乙醇溶液物液比为1g:（66-68）mL，称定重量，超声20-40min，超声功率240-260W，室温冷却，称定重量，乙醇溶液补足减轻的重量，摇匀，转速为10000r/min离心10min，取上清液用0.22µm微孔滤膜过滤，即得待测样品；

S3色谱条件：高效液相检测法，流动相A相为乙腈，B相为0.2%磷酸溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，取步骤S1中混合对照品溶液和S2中待测样品，进样，梯度洗脱，洗脱时间和条件如下：

方法中，以金丝桃苷为内参物，分别计算朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陈皮素、山奈酚、宝藿苷Ⅰ的相对校正因子ƒ，ƒ的计算公式如下：

ƒ_s/i = ƒ_s/ƒ_i = (A_s×C_i) / (A_i×C_s)

式中As为内参物对照品S的峰面积，Cs为内参物对照品S的浓度，Ai为某待测成分对照品i的峰面积，Ci为某待测成分对照品i的浓度，按照外标法测定内参物峰面积As，利用各成分的ƒ和内参物的实测值，计算待测样品成分的含量；

基于以上步骤确立了9种有效成分相对于金丝桃苷的相对校正因子（fs/i），分别为f_{金丝桃苷/朝霍定}A=2.170、f_{金丝桃苷/朝霍定C}=1.217、f_{金丝桃苷/朝霍定B}=0.753、f_{金丝桃苷/淫羊藿苷}=0.999、f_{金丝桃苷/木犀草素}=0.618、f_{金丝桃苷/槲皮素}=0.567、f_{金丝桃苷/川陈皮素}=0.491、f_{金丝桃苷/山奈酚}=0.537和f_{金丝桃苷/宝霍苷I}=0.675；

所述步骤S3中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料孔径5µm。

2.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中超声时间为30min。

3.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的乙醇溶液为80%乙醇水溶液。

4.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，其特征在于，所述步骤S3的高效液相检测法的检测器为多波长选择的安捷伦二极管阵列检测器。

5.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ检测波长为270nm，川陈皮素检测波长为325nm，金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚检测波长为360nm。

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