CN107782811A - 一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法及获得的芪苓健肾片指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法及其指纹图谱，该方法建立芪苓健肾片的标准指纹图谱，采用高效液相色谱法和梯度洗脱，理论板数按青藤碱峰计算，应不低于100000。由本发明方法获得的芪苓健肾片指纹图谱与对照指纹图谱的相似度大于0.9，能全面地、有效地表征芪苓健肾片的质量，完善了芪苓健肾片的质量评价体系；所得的芪苓健肾片指纹图谱特征峰多，相似度高，可以准确、可靠地监控芪苓健肾片的质量；采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所测指纹图谱进行辨认，以此得出的相似度结果对芪苓健肾片指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确；本发明具有方法简便、稳定性优异、精密度高、重现性好等优点。

Description

一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法及获得的芪苓健肾片指 纹图谱

技术领域

本发明涉及中药制剂的质量控制方法，特别是一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，以及由此方法得到的芪苓健肾片的指纹图谱。

背景技术

由于中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法。中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。以指纹图谱作为中药提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，从先行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。

芪苓健肾片具有健脾益肾，补气清利，祛风通络的功能，其由黄芪、茯苓、淫羊藿、僵蚕、全蝎、泽泻、石韦和青风藤共8味药制成，其治疗效果已经在临床上得到验证，而是否能够保证芪苓健肾片的质量以及其中有效成分的含量，是决定芪苓健肾片疗效的基础。

现有技术中，还没有作为质量控制标准的芪苓健肾片指纹图谱的公开报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，用于评价和控制芪苓健肾片的质量，通过此方法可以保证芪苓健肾片的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保芪苓健肾片的安全性和有效性。

本发明的另一个目的在于还提供了应用上述方法获得的芪苓健肾片指纹图谱。

本发明是通过以下技术方案来实现的。本发明是一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特点是，该方法采用以下方法建立芪苓健肾片的标准指纹图谱，采用高效液相色谱法，

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：C₁₈柱；流动相A：乙腈，流动相B：体积浓度为0.1～0.5％磷酸水溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱，0～65min，体积浓度7％A～90％A；流速：0.8～1.2mL/min；检测波长：208～270nm；柱温：25～35℃；理论板数按青藤碱峰计算，应不低于100000。

本发明所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其进一步优选的技术方案是：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters Symmetry C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为208nm；柱温30℃；理论板数按青藤碱峰计算应不低于100000。

本发明所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其进一步优选的技术方案是：梯度洗脱程序为：

本发明所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其进一步优选的技术方案是：建立芪苓健肾片的标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测芪苓健肾片样品的指纹图谱，然后将其与上述芪苓健肾片的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.80。

本发明所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其进一步优选的技术方案是：供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物适量，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30～70％甲醇15～75mL，称定重量；超声处理15～60min，放冷，再称定重量，用体积浓度为30～70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成含绿原酸、淫羊藿苷、青藤碱的混合溶液，作为对照品溶液；

测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各5～15μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱。

本发明所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其进一步优选的技术方案是：采用高效液相色谱法进行检测，其步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物0.35g，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％甲醇50mL，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用体积浓度为50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成每1mL含绿原酸40μg、淫羊藿苷40μg、青藤碱320μg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱。

本发明所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述的超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

本发明一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法获得的芪苓健肾片指纹图谱：得到的芪苓健肾片标准指纹图谱的图谱总长度为65min，有24个共有峰，第4、6、22号峰分别对应为青藤碱、绿原酸、淫羊藿苷；以4号峰，即青藤碱参照物对应的峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间，各共有峰的平均相对保留时间及相对标准偏差具体如下：

1号峰：平均相对保留时间为0.500，RSD为0％；

2号峰：平均相对保留时间为0.739，RSD为0.43％；

平均相对峰面积为0.572，RSD为0.99％；

3号峰：平均相对保留时间为0.854，RSD为0.60％；

4号峰：平均相对保留时间为1，RSD为0％；

平均相对峰面积为1，RSD为0％；

5号峰：平均相对保留时间为1.162，RSD为0.36％；

平均相对峰面积为0.147，RSD为2.27％；

6号峰：平均相对保留时间为1.444，RSD为0.36％；

7号峰：平均相对保留时间为1.653，RSD为0.29％；

8号峰：平均相对保留时间为1.754，RSD为0.40％；

9号峰：平均相对保留时间为1.844，RSD为0.38％；

平均相对峰面积为0.970，RSD为0.11％；

10号峰：平均相对保留时间为1.984，RSD为0.35％；

11号峰：平均相对保留时间为2.027，RSD为0.47％；

12号峰：平均相对保留时间为2.062，RSD为0.45％；

13号峰：平均相对保留时间为2.284，RSD为0.47％；

平均相对峰面积为0.173，RSD为2.91％；

14号峰：平均相对保留时间为2.370，RSD为0.56％；

平均相对峰面积为0.280，RSD为0.31％；

15号峰：平均相对保留时间为2.523，RSD为0.46％；

16号峰：平均相对保留时间为2.719，RSD为0.50％；

平均相对峰面积为0.233，RSD为2.05％；

17号峰：平均相对保留时间为2.865，RSD为0.50％；

平均相对峰面积为0.120，RSD为0.77％；

18号峰：平均相对保留时间为3.884，RSD为0.85％；

19号峰：平均相对保留时间为3.921，RSD为1.02％；

20号峰：平均相对保留时间为4.010，RSD为0.51％；

21号峰：平均相对保留时间为4.068，RSD为0.45％；

平均相对峰面积为0.070，RSD为0.61％；

22号峰：平均相对保留时间为4.147，RSD为0.46％；

平均相对峰面积为0.120，RSD为2.02％；

23号峰：平均相对保留时间为4.461，RSD为0.50％；

24号峰：平均相对保留时间为4.515，RSD为0.52％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明确立了芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，通过该方法获得的芪苓健肾片指纹图谱与对照指纹图谱的相似度大于0.8，能全面地、有效地表征芪苓健肾片的质量，完善了芪苓健肾片的质量评价体系；

2.本发明方法所得的芪苓健肾片指纹图谱有24个共有峰，特征峰多，相似度高，可以准确、可靠地监控芪苓健肾片的质量；

3.本发明采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所测指纹图谱进行辨认，以此得出的相似度结果对芪苓健肾片指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确；

4.本发明具有方法简便、稳定性优异、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1是实施例6测得的芪苓健肾片的对照指纹图谱。

图2是实施例6精密度试验得到的芪苓健肾片指纹图谱叠加图；

图3是实施例6稳定性试验得到的芪苓健肾片指纹图谱叠加图；

图4是实施例6重复性试验得到的芪苓健肾片指纹图谱叠加图；

图5是实施例6测得的10个批次芪苓健肾片指纹图谱叠加图；

图6是实施例6测得的芪苓健肾片与药材相关性色谱图；

图7是实施例6测得的芪苓健肾片指纹图谱中色谱峰的指认色谱图；

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，其步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物适量，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30％甲醇15mL，称定重量；超声处理15min，放冷，再称定重量，用体积浓度为30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成含绿原酸、淫羊藿苷、青藤碱的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱；

所述的高效液相色谱检测的色谱条件为：色谱柱：C₁₈柱；流动相A：乙腈，流动相B：体积浓度为0.1％磷酸水溶液，采用梯度洗脱；流速：0.8mL/min；检测波长：208nm；柱温：25℃；理论板数按青藤碱峰计算，应不低于100000；其中，梯度洗脱程序为：

实施例2，一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，其步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物适量，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％甲醇75mL，称定重量；超声处理60min，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成含绿原酸、淫羊藿苷、青藤碱的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各15μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱；

所述的高效液相色谱检测的色谱条件为：色谱柱：C₁₈柱；流动相A：乙腈，流动相B：体积浓度为0.2％磷酸水溶液，采用梯度洗脱；流速：1.2mL/min；检测波长：270nm；柱温：35℃；理论板数按青藤碱峰计算，应不低于100000；其中，梯度洗脱程序为：

实施例3，一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，其步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物0.35g，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％甲醇50mL，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用体积浓度为50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成每1mL含绿原酸40μg、淫羊藿苷40μg、青藤碱320μg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱；

所述的高效液相色谱检测的色谱条件为：色谱柱：Waters Symmetry C₁₈(250×4.6mm，5μm)；流动相A：乙腈，流动相B：体积浓度为0.5％磷酸水溶液，采用梯度洗脱；流速：1mL/min；检测波长：208nm；柱温：30℃；理论板数按青藤碱峰计算，应不低于100000；其中，梯度洗脱程序为：

实施例4，实施例1-3任何一项所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，所述的超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

实施例5，实施例1-4任何一项所述的芪苓健肾片指纹图谱的检测方法得到的芪苓健肾片指纹图谱，图谱总长度为65min，有24个共有峰，第4、6、22号峰分别对应为青藤碱、绿原酸、淫羊藿苷；以4号峰，即青藤碱参照物对应的峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间，各共有峰的平均相对保留时间及相对标准偏差具体如下：

1号峰：平均相对保留时间为0.500，RSD为0％；

2号峰：平均相对保留时间为0.739，RSD为0.43％；

平均相对峰面积为0.572，RSD为0.99％；

3号峰：平均相对保留时间为0.854，RSD为0.60％；

4号峰：平均相对保留时间为1，RSD为0％；

平均相对峰面积为1，RSD为0％；

5号峰：平均相对保留时间为1.162，RSD为0.36％；

平均相对峰面积为0.147，RSD为2.27％；

6号峰：平均相对保留时间为1.444，RSD为0.36％；

7号峰：平均相对保留时间为1.653，RSD为0.29％；

8号峰：平均相对保留时间为1.754，RSD为0.40％；

9号峰：平均相对保留时间为1.844，RSD为0.38％；

平均相对峰面积为0.970，RSD为0.11％；

10号峰：平均相对保留时间为1.984，RSD为0.35％；

11号峰：平均相对保留时间为2.027，RSD为0.47％；

12号峰：平均相对保留时间为2.062，RSD为0.45％；

13号峰：平均相对保留时间为2.284，RSD为0.47％；

平均相对峰面积为0.173，RSD为2.91％；

14号峰：平均相对保留时间为2.370，RSD为0.56％；

平均相对峰面积为0.280，RSD为0.31％；

15号峰：平均相对保留时间为2.523，RSD为0.46％；

16号峰：平均相对保留时间为2.719，RSD为0.50％；

平均相对峰面积为0.233，RSD为2.05％；

17号峰：平均相对保留时间为2.865，RSD为0.50％；

平均相对峰面积为0.120，RSD为0.77％；

18号峰：平均相对保留时间为3.884，RSD为0.85％；

19号峰：平均相对保留时间为3.921，RSD为1.02％；

20号峰：平均相对保留时间为4.010，RSD为0.51％；

21号峰：平均相对保留时间为4.068，RSD为0.45％；

平均相对峰面积为0.070，RSD为0.61％；

22号峰：平均相对保留时间为4.147，RSD为0.46％；

平均相对峰面积为0.120，RSD为2.02％；

23号峰：平均相对保留时间为4.461，RSD为0.50％；

24号峰：平均相对保留时间为4.515，RSD为0.52％。

芪苓健肾片指纹图谱参照图1。

实施例6，芪苓健肾片指纹图谱的测定实验。

芪苓健肾片处方由黄芪、茯苓、淫羊藿、僵蚕、全蝎、泽泻、石韦和青风藤共8味药组成，具有健脾益肾，补气清利，祛风通络的功能。本试验针对其处方中药味进行指纹图谱和多成分含量测定研究，可从色谱的整体特征把握中药的品种和质量情况。

1.1仪器与试药

Agilent1260液相色谱仪，DAD紫外检测器；Waters2695-2487液相色谱仪；Ultimate3000液相色谱仪；KQ 5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MettlerAE240电子分析天平(梅特勒公司)；BSA224S-CW型电子分析天平(赛多利斯公司)；H1650-W台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Milli-QAcademic纯水机(密理博公司)。

绿原酸对照品(批号：110753-201314)，购自中国食品药品检定研究院；青藤碱对照品(111719-201505)、淫羊藿苷对照品(批号：110737-200415)，均购自成都曼斯特生物技术有限公司；乙腈和磷酸，均为色谱纯，美国天地公司；甲醇和乙醇均为分析纯，南京化学试剂公司；超纯水。

1.2药品来源

本文研究用芪苓健肾片由江苏康缘药业股份有限公司生产，批号：130401、140101、140102、140103、140501、140502、140503、130701、130702、130703。

1.3指纹图谱参照物的选择

通过与对照品比对，芪苓健肾片指纹图谱中主要已知化合物为青藤碱、绿原酸、淫羊藿苷，青藤碱在本品指纹图谱中含量较高、分离较好、对照品易获得，因此选择青藤碱为本品指纹图谱参照物。

1.4供试品溶液的制备

1.4.1提取方法的选择

取批号为130703的芪苓健肾片粉末2份，每份约0.35g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15ml，考察超声提取(250W，40KHz)30分钟和回流提取60分钟，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，进样，测定，主要色谱峰以平均峰面积除以取样量计算结果，结果见表1。

结果表明，超声处理(250W，40KHz)30分钟和回流提取60分钟提取效果无明显差异，考虑到超声提取操作简便，因此提取方法选择超声提取法。

表1提取方式考察结果

1.4.2提取溶剂的选择

取批号为130703的芪苓健肾片粉末8份，每份约0.35g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇15ml，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，进样，测定，主要色谱峰以平均峰面积除以取样量计算结果，结果见表2。

结果表明，70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇均具有提取效果，其中50％甲醇提取效果较优，因此提取溶剂优选50％甲醇。

表2提取溶剂考察结果

1.4.3提取溶剂用量的选择

取批号为130703的芪苓健肾片粉末4份，每份约0.35g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇15ml、25ml、50ml和75ml，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，进样，测定，主要色谱峰以平均峰面积乘以供试品溶液体积除以取样量计算结果，结果见表3。

结果表明，提取溶剂50％甲醇15ml、25ml、50ml和75ml均具有提取效果，提取溶剂为50ml和75ml的提取效果相当，因此提取溶剂用量确定优选为50ml。

表3提取溶剂用量考察结果

1.4.4提取时间的选择

取批号为130703的芪苓健肾片粉末3份，每份约0.35g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15ml，分别超声提取(250W，40KHz)15分钟、30分钟和60分钟，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，进样，测定，主要色谱峰以平均峰面积除以取样量计算结果，结果见表4。

结果表明，分别超声提取(250W，40KHz)15分钟、30分钟和60分钟均可以，提取时间为30分钟最好，因此提取时间确定优选为30分钟。

表4提取时间考察结果

通过上述考察，确定芪苓健肾片含量测定供试品溶液的制备方法为：取本品装量差异项下内容物，混匀，研细，取约0.35g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声(250W，40kHz)提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，即得。

1.5检测方法

1.5.1检测波长的选择

通过208nm、230nm、270nm、290nm和326nm 5个检测波长及190～400nm范围全扫描比较分析，208nm、230nm和270nm 3个检测波长分离效果均可，其中检测波长为208nm能较全面的反映芪苓健肾片中化学成分，且各色谱峰分离较好，所以优选208nm为芪苓健肾片指纹图谱测定波长。

1.5.2梯度洗脱程序的选择

将色谱柱固定为Waters C18(250×4.6mm，5μm)，考察不同洗脱程序(见表5-7)，结果以洗脱程序III所得色谱图中个色谱峰峰型较好、分离较佳。

表5洗脱程序I

表6洗脱程序II

表7洗脱程序III

1.5.3流动相的选择

色谱柱固定为Waters C18(250×4.6mm，5μm)，洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III。考虑到本品含有有机酸类成分，选用乙腈-酸水系统进行研究。考虑到本品含有生物碱类成分，选用乙腈-磷酸盐系统进行研究。比较了乙腈-0.1％甲酸水溶液，乙腈-0.1％磷酸水溶液，乙腈-0.005mol/L磷酸盐缓冲液系统，结果显示乙腈-0.1％磷酸水溶液所得色谱图中个色谱峰峰型较好、分离较佳，因此优选乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相。

1.5.4酸浓度的选择

色谱柱固定为Waters C18(250×4.6mm，5μm)，洗脱程序固定为洗脱程序III，选用不同浓度乙腈-磷酸水溶液作为流动相(0.1％、0.2％、0.5％乙腈-磷酸水溶液)，以考察不同浓度乙腈-磷酸水溶液的色谱峰分离效果。

1.5.4色谱柱的选择

洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为：Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)，Waters C18(250×4.6mm，5μm)，Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)。结果显示，Waters C18(250×4.6mm，5μm)对样品的分离效果较好，因此选择用该色谱柱为芪苓健肾片指纹图谱和含量测定分析柱。

1.5.4仪器的考察

洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，色谱柱固定为Waters C18(250×4.6mm，5μm)，对不同液相色谱仪进行考察，分别为：Waters2695-2478，Ultimate3000，Agilent1260。结果显示，三台仪器所得指纹图谱和多成分含量测定图谱中各色谱峰分离较好。

1.5.5柱温的考察

洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，色谱柱固定为Waters C18(250×4.6mm，5μm)，试验比较了柱温为25℃、30℃和35℃所得图谱，结果所得图谱分离峰均可，其中柱温为30℃时所得指纹图谱和多成分含量测定图谱中各色谱峰分离最好。

1.5.6流速的考察

洗脱程序固定为2.5.2中洗脱程序III，色谱柱固定为Waters C18(250×4.6mm，5μm)，柱温为30℃，试验比较了流速为0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min所得图谱，结果所得图谱分离峰均可，其中流速为1.0ml/min时所得指纹图谱和多成分含量测定图谱中各色谱峰分离较好。

1.5.7滞后峰测试

延长测试时间1倍至90分钟，结果55min后65min前有小的色谱峰，因此在芪苓健肾片指纹图谱和多成分含量测定时，将2.5.2中洗脱程序III时间延长至65min。

综上所述，芪苓健肾片指纹图谱和多成分含量测定检测条件最优选确定为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Waters C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为208nm；柱温30℃。

洗脱程序表

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录65min图谱，即得。

1.6方法学考察

1.6.1精密度试验

取批号为110504的芪苓健肾片，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定，测定结果见表8和表9。结果表明，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积基本一致(RSD＜2％)。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99，见表10。结果表明该方法精密度良好。见图2。

表8芪苓健肾片指纹图谱I精密度考察结果

(主要色谱峰的相对峰面积)

表9芪苓健肾片指纹图谱I精密度考察结果

(各共有峰的相对保留时间)

表10芪苓健肾片指纹图谱测定结果(相似度)

1.6.2稳定性试验

取批号为130703的芪苓健肾片，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、6h、9h、14h、18h和24h测定一次指纹图谱，共测7次，测定结果见表11和表12。结果表明，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积基本一致(RSD＜3％)。又以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均大于0.99，见表13，表明供试品溶液室温24小时内稳定性良好。见图3。

表11芪苓健肾片指纹图谱I稳定性考察结果

(主要色谱峰的相对峰面积)

表12芪苓健肾片指纹图谱I稳定性考察结果

(各共有峰的相对保留时间)

表13芪苓健肾片指纹图谱测定结果(相似度)

1.6.3重复性试验

取批号为110504的芪苓健肾片，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定，测定结果见表14和表15。结果表明，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积基本一致(RSD＜3％)。又以第1份样品所得指纹图谱做为对照计算另5份样品所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.90。见表16。结果表明该方法重复性良好。见图4。

表14芪苓健肾片指纹图谱I重复性考察结果

(主要峰的相对峰面积)

表15芪苓健肾片指纹图谱I重复性考察结果

(各共有峰的相对保留时间)

表16芪苓健肾片指纹图谱测定结果(相似度)

根据以上方法学考察结果，表明该方法测定芪苓健肾片的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。

1.7指纹图谱的建立

1.7.1芪苓健肾片指纹图谱I检测及对照指纹图谱的获得

收集十批芪苓健肾片样品，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，结果计算各共有峰的相对保留时间、主要峰的相对峰面积和相似度，用相似度软件以这十批样品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，见图5。结果见表17、18、19。

表17芪苓健肾片指纹图谱I样品测定结果

(主要峰的保留时间)

表18芪苓健肾片指纹图谱I样品测定结果

(各共有峰的相对保留时间)

表19芪苓健肾片指纹图谱样品测定结果(相似度)

十批芪苓健肾片指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.80，暂定芪苓健肾片用芪苓健肾片指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.80。

1.7.2制剂与药材相关性研究

通过与处方中的8味药材制备的样品图谱比较，结果显示芪苓健肾片指纹图谱中的成分主要来自青风藤、黄芪、淫羊藿、石韦和僵蚕药材。其中2、4(S)、5、7、8、9、10、11、12、13、14、17、18、20号峰来源于青风藤，1、15、19、24号峰来源于黄芪，21、22、23号峰来源于淫羊藿，6、16号峰来源于石韦，3号峰来源于僵蚕。见图6。

2.7.3色谱峰指认

用对照品进行对比，指认出4(S)号峰为青藤碱，6号峰为绿原酸，22号峰为淫羊藿苷。见图7。

Claims (8)

1.一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于，该方法采用以下方法建立芪苓健肾片的标准指纹图谱，采用高效液相色谱法，

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：C₁₈柱；流动相A：乙腈，流动相B：体积浓度为0.1~0.5%磷酸水溶液，采用梯度洗脱；梯度洗脱，0~65min，体积浓度7%A~90%A；流速：0.8~1.2mL/min；检测波长：208~270nm；柱温：25~35℃；理论板数按青藤碱峰计算，应不低于100000。

2.根据权利要求1所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters Symmetry C₁₈，250 mm×4.6mm，5μm；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.5%磷酸水为流动相B，梯度洗脱0~65min；流速每分钟为1.0ml；检测波长为208nm；柱温30℃；理论板数按青藤碱峰计算应不低于100000。

3.根据权利要求1所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于：梯度洗脱程序为：

。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于：建立芪苓健肾片的标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测芪苓健肾片样品的指纹图谱，然后将其与上述芪苓健肾片的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.80。

5.根据权利要求4所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于：

供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物适量，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30~70%甲醇15~75mL，称定重量；超声处理15~60min，放冷，再称定重量，用体积浓度为30~70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成含绿原酸、淫羊藿苷、青藤碱的混合溶液，作为对照品溶液；

测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各5~15µL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱。

6.根据权利要求5所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，其步骤如下：

（1）供试品溶液的制备：取芪苓健肾片装量差异项下的内容物0.35g，混匀，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%甲醇50mL，称定重量；超声处理30min，放冷，再称定重量，用体积浓度为50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，滤液作为供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品、青藤碱对照品、淫羊藿苷对照品适量，用甲醇配制成每1mL含绿原酸40μg、淫羊藿苷40μg、青藤碱320μg的混合溶液，作为对照品溶液；

（3）测定：精密吸取所述的供试品溶液和对照品溶液各10µL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，记录65min图谱；以对照品色谱峰为参照，根据中药色谱指纹图谱软件对所得数据和谱图进行处理，得到芪苓健肾片指纹图谱。

7.根据权利要求5所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法，其特征在于：所述的超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

8.一种如权利要求1－7任何一项所述的一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法获得的芪苓健肾片指纹图谱：其特征在于：得到的芪苓健肾片标准指纹图谱的图谱总长度为65min，有24个共有峰，第4、6、22号峰分别对应为青藤碱、绿原酸、淫羊藿苷；以4号峰，即青藤碱参照物对应的峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间，各共有峰的平均相对保留时间和主要色谱峰的相对峰面积以及相对标准偏差具体如下：

1号峰：平均相对保留时间为0.500，RSD为0%；

2号峰：平均相对保留时间为0.739，RSD为0.43%；

平均相对峰面积为0.572，RSD为0.99%；

3号峰：平均相对保留时间为0.854，RSD为0.60%；

4号峰：平均相对保留时间为1，RSD为0%；

平均相对峰面积为1，RSD为0%；

5号峰：平均相对保留时间为1.162，RSD为0.36%；

平均相对峰面积为0.147，RSD为2.27%；

6号峰：平均相对保留时间为1.444，RSD为0.36%；

7号峰：平均相对保留时间为1.653，RSD为0.29%；

8号峰：平均相对保留时间为1.754，RSD为0.40%；

9号峰：平均相对保留时间为1.844，RSD为0.38%；

平均相对峰面积为0.970，RSD为0.11%；

10号峰：平均相对保留时间为1.984，RSD为0.35%；

11号峰：平均相对保留时间为2.027，RSD为0.47%；

12号峰：平均相对保留时间为2.062，RSD为0.45%；

13号峰：平均相对保留时间为2.284，RSD为0.47%；

平均相对峰面积为0.173，RSD为2.91%；

14号峰：平均相对保留时间为2.370，RSD为0.56%；

平均相对峰面积为0.280，RSD为0.31%；

15号峰：平均相对保留时间为2.523，RSD为0.46%；

16号峰：平均相对保留时间为2.719，RSD为0.50%；

平均相对峰面积为0.233，RSD为2.05%；

17号峰：平均相对保留时间为2.865，RSD为0.50%；

平均相对峰面积为0.120，RSD为0.77%；

18号峰：平均相对保留时间为3.884，RSD为0.85%；

19号峰：平均相对保留时间为3.921，RSD为1.02%；

20号峰：平均相对保留时间为4.010，RSD为0.51%；

21号峰：平均相对保留时间为4.068，RSD为0.45%；

平均相对峰面积为0.070，RSD为0.61%；

22号峰：平均相对保留时间为4.147，RSD为0.46%；

平均相对峰面积为0.120，RSD为2.02%；

23号峰：平均相对保留时间为4.461，RSD为0.50%；

24号峰：平均相对保留时间为4.515，RSD为0.52%。