CN103472148A

CN103472148A - 一种中药组合物制剂的指纹图谱检测方法

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Publication number: CN103472148A
Application number: CN2013103949907A
Authority: CN
Inventors: 马群; 解素花; 乔延江; 顾海鸥; 杜菁; 吴炜; 吴志生; 徐冰
Original assignee: BEIJING TONGRENTANG Co Ltd; Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: BEIJING TONGRENTANG Co Ltd; Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-03
Also published as: CN103472148B

Abstract

本发明涉及一种中药组合物制剂的HPLC指纹图谱检测方法，该方法包括：a、色谱条件：以酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相；采用梯度洗脱；检测波长190nm-290nm；b、供试品溶液制备：取中药组合物制剂，用有机溶剂提取后制备成供试品溶液；和c、测定：取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；此HPLC指纹图谱方法的稳定性、重现性好，可用于含有牛黄和麝香的不同组合物制剂的质量检测。

Description

一种中药组合物制剂的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药组合物制剂的指纹图谱检测方法，具体涉及一种中药组合物制剂的HPLC指纹图谱检测方法，属于中医药技术领域。

背景技术

中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量检测手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。因此，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。

本发明中药组合物含有11味药，同时含有动物药、植物药和矿物药，化学成分组成复杂，要对其质量进行控制，只针对其一、二个化学成分进行表征是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。指纹图谱作为中药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。如何能够从整体上、从更宏观的角度对本发明所述中药组合物制剂进行质量检测方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于公开一种中药组合物制剂的指纹图谱检测方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种中药组合物制剂的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤：

A、以酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相；采用梯度洗脱；检测波长190-290nm；

B、取中药组合物制剂，用有机溶剂提取后制备成供试品溶液；

C、取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；

进一步，所述步骤A中的酸水溶液为体积浓度0.2%-1%的磷酸水溶液；

更进一步，酸水溶液为体积浓度0.5%的磷酸水溶液。

进一步，所述步骤A中的检测波长为200nm。

进一步，所述步骤A中柱温为20-40℃。

进一步，所述步骤A中梯度洗脱程序：

0到2min时，流动相A体积比为90～95%；

2到30min时，流动相A体积比由90～95%下降到75～80%；

30到40min时，流动相A体积比为75～80%；

40到60min时，流动相A体积比由75～80%下降到65～70%；

60到70min时，流动相A体积比由65～70%下降到50～55%；

70到80min时，流动相A体积比由50～55%下降到10～15%；

80到85min时，流动相A体积比由10～15%下降到0～5%；

85到110min时，流动相A为0～5%

更进一步，梯度洗脱程序为：

0到2min时，流动相A体积比为90%；

2到30min时，流动相A体积比由90%下降到78%；

30到40min时，流动相A体积比为78%；

40到60min时，流动相A体积比由78%下降到66%；

60到70min时，流动相A体积比由66%下降到50%；

70到80min时，流动相A体积比由50%下降到10%；

80到85min时，流动相A体积比由10%下降到5%；

85到110min时，流动相A为5%

进一步，所述步骤B中提取溶剂为水饱和二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正丁醇、甲醇、乙醇中任意一种或几种组成的混合溶剂，或上述有机溶剂与酸水溶液组成的溶剂；所述酸水溶液为甲酸、冰醋酸中的任意一种；更进一步，所述步骤B中提取溶剂为体积比80-120:40-60:0.5-5的二氯甲烷-甲醇-冰醋酸；更进一步，提取溶剂为体积比100:（40-50）:2的二氯甲烷-甲醇-冰醋酸；其中，所述二氯甲烷为水饱和的二氯甲烷。

进一步，所述步骤B中提取方法为超声提取或冷浸提取或回流提取；更进一步，所述提取方法为超声提取。

本发明所述中药组合物制剂原料药组成为：牛黄50-200重量份、水牛角100-300重量份、麝香（或人工麝香）10-50重量份、珍珠20-100重量份、朱砂50-200重量份、雄黄50-200重量份、黄连50-200重量份、黄芩50-200重量份、栀子50-200重量份、郁金50-200重量份、冰片10-50重量份。

上述原料药可按常规制剂工艺制备成丸剂、颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液。

本发明中药组合物丸剂的制备方法为：按比例取原料药，珍珠水飞或粉碎成极细粉；朱砂、雄黄分别水飞成极细粉；黄连、黄芩、栀子、郁金粉碎成细粉；将牛黄、水牛角、麝香（或人工麝香）、冰片研细，与上述粉末配研，过筛，混匀，加适量炼蜜制成大蜜丸，或包金衣，即得。

一种中药的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括：

B、取中药用水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸提取后制备成供试品溶液；

所述中药为：牛黄或麝香或含有牛黄和麝香任一种或两种的中药组合物；

所述步骤A中梯度洗脱程序为：

0到2min时，流动相A体积比为90～95%；

2到30min时，流动相A体积比由90～95%下降到75～80%；

30到40min时，流动相A体积比为75～80%；

40到60min时，流动相A体积比由75～80%下降到65～70%；

60到70min时，流动相A体积比由65～70%下降到50～55%；

70到80min时，流动相A体积比由50～55%下降到10～15%；

80到85min时，流动相A体积比由10～15%下降到0～5%；

85到110min时，流动相A为0～5%。

所述步骤A中的酸水溶液为体积浓度0.2%-1%的磷酸水溶液。

所述步骤B中加水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（80-120:40-60:0.5-5）超声提取。

所述步骤A中柱温20-40℃；进样量5-20μl；流速0.5-1mL/min。

按照本发明所提供指纹图谱的建立方法所得指纹图谱有42个共有峰，其中18号为参照峰，图谱总长度为120min。以批号1为例，各个色谱峰的出峰时间和峰面积如下：

1号峰，出峰时间为5.038min时，相对峰面积为0.1002；

2号峰，出峰时间为7.006min；

3号峰，出峰时间为13.347min；

4号峰，出峰时间为15.871min；

5号峰，出峰时间为18.107min时，相对峰面积为0.1772；

6号峰，出峰时间为20.698min时，相对峰面积为0.0556；

7号峰，出峰时间为23.698min；

8号峰，出峰时间为25.139min时，相对峰面积为0.4530；

9号峰，出峰时间为26.429min；

10号峰，出峰时间为29.374min时，相对峰面积为0.0631；

11号峰，出峰时间为31.854min时，相对峰面积为0.0823；

12号峰，出峰时间为33.372min；

13号峰，出峰时间为36.596min；

14号峰，出峰时间为39.876min；

15号峰，出峰时间为40.449min；

16号峰，出峰时间为41.201min；

17号峰，出峰时间为41.510min时，相对峰面积为0.1916；

18号峰，出峰时间为48.556min时，相对峰面积为1；

19号峰，出峰时间为51.690min时，相对峰面积为0.1546；

20号峰，出峰时间为53.224min时，相对峰面积为0.6254；

21号峰，出峰时间为55.234min时，相对峰面积为0.0628；

22号峰，出峰时间为55.910min；

23号峰，出峰时间为57.889min时，相对峰面积为0.1344；

24号峰，出峰时间为60.453min时，相对峰面积为0.2629；

25号峰，出峰时间为64.290min；

26号峰，出峰时间为69.381min时，相对峰面积为0.2184；

27号峰，出峰时间为70.398min；

28号峰，出峰时间为77.739min时，相对峰面积为0.0935；

29号峰，出峰时间为78.461min；

30号峰，出峰时间为78.875min；

31号峰，出峰时间为82.197min；

32号峰，出峰时间为85.873min；

33号峰，出峰时间为86.303min；

34号峰，出峰时间为86.641min；

35号峰，出峰时间为87.392min；

36号峰，出峰时间为87.527min；

37号峰，出峰时间为90.071min时，相对峰面积为0.5636；

38号峰，出峰时间为91.143min；

39号峰，出峰时间为93.166min；

40号峰，出峰时间为97.329min时，相对峰面积为0.0545；

41号峰，出峰时间为100.282min；

42号峰，出峰时间为105.330min。

本发明指纹图谱检测方法测定10批样品色谱指纹图谱，10批样品与共有模式之间相似度均大于0.9，而且共有峰均从药材中得到了归属。此HPLC指纹图谱方法的稳定性、重现性好，可用于所述中药组合物制剂整体质量评价。本发明的HPLC指纹图谱方法能够反映制剂中天然牛黄和人工麝香的特征，可鉴别含有不同品种牛黄（天然牛黄和培植牛黄）和麝香（天然麝香和麝香）的中药组合物制剂，可用于含有不同品种牛黄和麝香的制剂的质量检测。

附图说明

图1不同溶剂提取液的色谱指纹图谱

A：水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）；B：甲醇；C：水饱和二氯甲烷；D：乙酸乙酯；E空白甲醇(在10-65min之间没有出峰)

图2 10批组合物丸剂HPLC指纹图谱

图3共有峰色谱指纹图谱

图4麝香药材色谱峰归属图

A：含天然麝香的组合物制剂色谱图；B：含人工麝香的组合物制剂色谱图；C：天然麝香色谱图；D：人工麝香色谱图；E：空白溶剂

图5牛黄药材色谱峰归属图

A：含天然牛黄的组合物制剂色谱图；B：含培植牛黄的组合物制剂色谱图；C：培植牛黄色谱图；D：天然牛黄色谱图；E：空白溶剂

图6A25号峰对应一级质谱图

图6B27号峰对应一级质谱图

具体实施方式

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器

岛津液相色谱仪（LC-20AT溶剂输液泵、SPD-M20A检测器、LC-solution色谱工作站）；Angilent SA-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；KQ-500DE型速控超声波清洗器；Sartorious电子分析天平。

1.2试药

色谱纯甲醇（Fisher公司产品）；色谱纯乙腈（Fisher公司产品）；屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯。10批中药组合物丸剂（北京同仁堂股份有限公司，天然牛黄、天然麝香（北京同仁堂股份有限公司））；培植牛黄、人工麝香以及含培植牛黄、人工麝香的中药组合物购自其他厂家。。

2方法与结果

2.1方法

2.1.1色谱条件

色谱柱：Angilent ZORAAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A（0.5%磷酸水），B（乙腈）为流动相，梯度洗脱：0～2min：90%A，10%B；2～30min：90%A～78%A，10%B～22%B；30～40min：78%A，22%B；40～60min：78%A～66%A，22%B～34%B；60～70min：66%A～50%A，34%B～50%B；70～80min：50%A～10%A，50%B～90%B；80～85min：10%A～5%A，90%B～95%B；85～110min:5%A,95%B；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；检测波长：200nm；进样量：10μL。

2.1.2供试品溶液制备

取组合物丸剂适量，剪碎，加等量硅藻土，研匀，取0.5g，精密称定，置于50mL容量瓶中。精密加入水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）各25mL，称定重量。超声提取30min，放冷，用提取溶剂补足减失重量，摇匀；量取上清液适量，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，置于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，取滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2方法验证

2.2.1提取溶剂考察

分别选择不同极性的甲醇、乙酸乙酯、水饱和二氯甲烷、水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）等四种溶剂进行考察。

取组合物丸剂（批号：2010542）适量，剪碎，加等量硅藻土，研匀，作为样品备用。称取样品约0.5g，精密称定，置于50mL容量瓶中。分别精密加入甲醇、乙酸乙酯、水饱和二氯甲烷、水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）各10mL，称定重量。超声提取30min，放冷，用提取溶剂补足减失重量，摇匀；量取上清液适量，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，置于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，取滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

按2.1.1项下色谱条件进行测定，得到不同溶剂提取液的色谱图，见图1。由图1可以看出用水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）作为提取溶剂时色谱图中峰个数最多，样品中成分提取较完全。因此选择提取溶剂为水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）。

2.2.2流动相的选择

以A（0.5%磷酸水）-B（乙腈）为流动相，分别按照1～60min，A：90%～5%和1～120min，A：90%～5%进行梯度洗脱，柱温：30℃；流速：0.8mL/min，检测波长：200nm，进行分析，记录色谱图。通过对色谱图的分析得出：在60min内，样品中的成分未完全洗脱，且图谱中各峰分离效果较差，120min内样品中成分可完全洗脱，因此选择分析时间为120min。

由于在上述梯度洗脱条件下，峰的分离效果不理想，因此，对色谱条件进行了进一步优化，最终确定流动相条件，见表1。

表1 流动相条件

时间（min）	%A（0.5%磷酸水）	%B（乙腈）
			0-2	90	10
2-30	90～78	10～22
			30-40	78	22
40-60	66	34
			60-70	66～50	34～50
70-80	50～10	50～90
			80-85	10～5	90～95
85-110	5	95

2.2.3精密度考察

取组合物丸剂（批号：2010542），按照2.1.2项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，取供试品溶液10μL按照2.1.1色谱条件进行测定，连续测定6次，记录主要峰相对峰面积，计算RSD值，结果见表2。

表2 组合物丸剂指纹图谱精密度考察结果

（注：相对峰面积小于0.05%的色谱峰不在计算范围内）

由表2可知，以18号峰为参照峰，主要色谱峰的相对保留时间的RSD%均小于0.11%，相对峰面积的RSD%均小于4.75%，表明方法精密度良好。

2.2.4稳定性考察

按照2.1.2项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件分别于样品制备后0h、2h、4h、8h、12h、24h进行测定，记录主要峰相对峰面积，计算RSD值，结果见表3。

表3 组合物丸剂指纹图谱稳定性考察结果

（注：相对峰面积小于0.05%的色谱峰不在计算范围内）

由表3得到，以18号峰为参照峰，主要色谱峰的相对保留时间的RSD%均小于0.34%，相对峰面积的RSD%均小于4.96%，表明样品在24小时内稳定。

2.2.5重复性考察

按照2.1.2项下供试品溶液制备方法平行制备供试品溶液6份，按2.1.1项下色谱条件测定，记录主要峰相对峰面积，计算RSD值，结果见表4。

表4 组合物丸剂指纹图谱重复性考察主要峰相对峰面积

（注：相对峰面积小于0.05%的色谱峰不在计算范围内）

由表4可知，以18号峰为参照色谱峰，主要色谱峰的相对峰面积的RSD%均小于4.91%，表明该HPLC指纹图谱方法重复性良好。

2.310批组合物丸剂HPLC指纹图谱的测定

取上述10批组合物丸剂，按照2.1.2项下供试品溶液制备方法项下制备供试品溶液，按照2.1.1色谱条件进行测定，记录HPLC指纹图谱，见图2。

采用国家药典会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件对上述10批组合物丸剂HPLC指纹图谱进行数据分析，生成了10批样品的共有模式，见图3，为对照指纹图谱。计算10批样品HPLC指纹图谱与对照指纹图谱间的相似度，计算结果见表5，各批次样品间的相似度均大于0.9，表明10个批次样品的质量稳定性良好。

表5 10批次样品与其对照指纹图谱间的相似度值

批号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	103	对照
												1010388	1
1010850	0.96	1
												2010022	0.979	0.927	1
2010207	0.994	0.949	0.992	1
												2010380	0.996	0.952	0.97	0.991	1
1010019	0.985	0.916	0.981	0.991	0.99	1
												2010542	0.987	0.926	0.987	0.995	0.99	0.999	1
4010230	0.995	0.961	0.967	0.989	0.998	0.985	0.986	1
												5010060	0.982	0.917	0.965	0.983	0.992	0.995	0.993	0.988	1

[0156]

6010103	0.984	0.952	0.936	0.97	0.992	0.97	0.969	0.992	0.983	1
												对照	0.996	0.951	0.98	0.996	0.999	0.994	0.995	0.997	0.993	0.987	1

2.4HPLC指纹图谱峰归属

分别取天然牛黄、培植牛黄、天然麝香、人工麝香，按照2.1.2项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按照2.1.1色谱条件测定，分别记录HPLC指纹图谱，见图4-5。根据HPLC指纹图谱保留时间和色谱峰的紫外光谱图对组合物丸剂指纹图谱中的色谱峰进行归属。

从图4数据分析可以指认，含天然麝香的组合物色谱图中13号峰，33号峰，40号峰，41号峰等4个峰来自天然麝香药材；含人工麝香的组合物色谱图中4号峰归属到人工麝香中。

由图4结合各色谱峰的紫外吸收光谱，可以看出含有人工麝香的组合物色谱图中没有13号峰，而在4号峰位置具有人工麝香特征峰；含有天然麝香的组合物色谱图中13号峰位具有天然麝香特征峰，4号峰位没有与人工麝香相同的峰。

从图5数据分析可以指认，含天然牛黄的组合物色谱图中25、27、42号峰等3个峰来自天然牛黄药材，培植牛黄中无25、27号峰；含有培植牛黄的组合物色谱图中无25、27号峰。因此，25、27号峰可以作为区分含有天然牛黄与培植牛黄的组合物制剂的特征峰。

由于天然牛黄与培植牛黄存在差异，为了确定两个峰，利用LC-MS分析天然牛黄与培植牛黄，根据质谱图数据确定25号峰（M/Z=514.2）为牛磺胆酸，27号峰(M/Z=464.3)为甘氨胆酸，如图6。

实施例2组合物颗粒剂的指纹图谱检测

组合物颗粒剂的制备：

组方：牛黄100g、水牛角200g、麝香25g、珍珠50g、朱砂100g、雄黄100g、黄连100g、黄芩100g、栀子100g、郁金100g、冰片25g；珍珠水飞或粉碎成极细粉；

制备方法：朱砂、雄黄分别水飞成极细粉；黄连、黄芩、栀子、郁金粉碎成细粉；将牛黄、水牛角、麝香、冰片研细，与上述粉末配研，过筛，混匀，加入辅料淀粉、硬脂酸镁、糊精、微晶纤维素，均匀制得颗粒，得到颗粒剂;

指纹图谱检测：

B、供试品溶液制备：取组合物颗粒剂适量，研匀，取0.5g，精密称定，置于50mL容量瓶中。精密加入水饱和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（100:50:2）各25mL，称定重量；回流提取1.5h，放冷，用提取溶剂补足减失重量，摇匀；量取上清液适量，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，置于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，取滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

“色谱条件”和“测定法”同实施例1操作，所得指纹图谱与图3相似。

Claims

1.一种中药组合物制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括：

A、以酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相；采用梯度洗脱；检测波长190nm-290nm；

B、取中药组合物制剂，用有机溶剂提取后制备成供试品溶液；以及

C、取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；

其中，所述中药组合物制剂原料药组成为：牛黄50-200重量份、水牛角100-300重量份、麝香（或人工麝香）10-50重量份、珍珠20-100重量份、朱砂50-200重量份、雄黄50-200重量份、黄连50-200重量份、黄芩50-200重量份、栀子50-200重量份、郁金50-200重量份、冰片10-50重量份。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A中的酸水溶液为体积浓度0.2%-1%的磷酸水溶液。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A中梯度洗脱程序为：

0到2min时，流动相A体积比为90～95%；

2到30min时，流动相A体积比由90～95%下降到75～80%；

30到40min时，流动相A体积比为75～80%；

40到60min时，流动相A体积比由75～80%下降到65～70%；

60到70min时，流动相A体积比由65～70%下降到50～55%；

70到80min时，流动相A体积比由50～55%下降到10～15%；

80到85min时，流动相A体积比由10～15%下降到0～5%；

85到110min时，流动相A为0～5%。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B中提取溶剂为水饱和二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正丁醇、甲醇、乙醇中任意一种或任意几种的混合溶剂，或其中任一一种或几种组成的混合溶剂与酸水溶液组成的溶剂。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B中提取溶剂为体积比（80-120）:（40-60）:（0.5-5）的二氯甲烷-甲醇-冰醋酸；其中，所述二氯甲烷为水饱和的二氯甲烷。

6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤B提取方法为超声提取或冷浸提取或回流提取。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测波长为200nm。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，洗脱中色谱柱的柱温20-40℃。

9.一种中药的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括：

所述步骤A中梯度洗脱程序为：

0到2min时，流动相A体积比为90～95%；

2到30min时，流动相A体积比由90～95%下降到75～80%；

30到40min时，流动相A体积比为75～80%；

40到60min时，流动相A体积比由75～80%下降到65～70%；

60到70min时，流动相A体积比由65～70%下降到50～55%；

70到80min时，流动相A体积比由50～55%下降到10～15%；

80到85min时，流动相A体积比由10～15%下降到0～5%；

85到110min时，流动相A为0～5%。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A中的酸水溶液为体积浓度0.2%-1%的磷酸水溶液。