CN102890125A - 桑白皮药材或桑白皮提取物的总生物碱类成分指纹图谱的构建方法及其质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种桑白皮药材或桑白皮提取物的总生物碱类成分指纹图谱的构建方法及其质量检测方法。该构建方法包括以下步骤：(a)制备桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液；以及(b)利用高效液相色谱法测得桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱。经过上述构建方法，测得了桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱，全面反映了桑白皮药材中总生物碱类活性成分。这不但提高了桑白皮药材以及桑白皮提取物的质量控制标准，而且本发明指纹图谱的构建方法具有稳定性好、重现性好的优点。通过与对照指纹图谱的比较，可准确地判断出市场上现有桑白皮中药材的质量问题。

Description

桑白皮药材或桑白皮提取物的总生物碱类成分指纹图谱的构建方法及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药材的质量检测领域，具体而言，涉及一种对桑白皮药材或桑白皮提取物中总生物碱类成分的指纹图谱构建方法及检测方法。 

背景技术

桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，始载于《神农本草经》，列为中品，历代本草均有收载。桑白皮性甘、寒，归肺经，具有泻肺平喘、利水消肿功能，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿。桑白皮的主要化学成分包括：黄酮类化合物、哌啶型生物碱类化合物(以1-脱氧野尻霉素为代表)、香豆素类化合物、多糖类化合物等。桑白皮提取物由桑白皮药材为原料制备而成：首先将桑白皮药材切制或粉碎，用水提取，提取次数为1～3次，优选提取3次，提取温度为室温至煮沸，优选煮沸提取，溶剂量为药材重量的10～30倍重量份，优选20～30倍，获得桑白皮药材水提取液；然后提取液浓缩后离心，上清液过强酸型阳离子交换树脂，树脂可选择001*4、001*7、D61、D001cc等型号，优选001*7(732型)，上柱流出液弃之，收集0.1～1N的氨水洗脱液，优选用0.5N的氨水洗脱，洗脱液浓缩后，最终获得桑白皮提取物，或经过喷雾干燥、减压或常压干燥得到桑白皮提取物。桑白皮药材及其提取物在民间常用于消炎、利尿、解热、镇咳、祛痰等。 

桑白皮所表现出来的多种功效吸引着众多学者的目光，人们对其中的哌啶型生物碱类化合物开始了大量而深入的研究。20世纪70年代，日本学者Yoshiaki首次从桑白皮中分离得到一种生物碱Moranoline(1-脱氧野尻霉素，1-deoxynojirimycin，DNJ)，研究证实它能在小肠竞争性抑制a-葡萄糖苷酶的活性，可用于治疗糖尿病、肥胖症、病毒感染等疾病。随后，国内外学者又从桑白皮中分离出多种生物碱，并确定了其分子结构。研究人员将这些生物碱类化合物作用于糖尿病小鼠模型并充分证明，上述多种生物碱类化合物的降糖效果非常明显。 

在对上述生物碱类活性成分的分离和提取过程中，人们发现由于DNJ及其他衍生物结构中含有较多羟基，属氮杂糖类，结构中没有苯环、双键、羰基等发色基团，在可见光区和紫外光区都没有吸收，故很难用HPLC-UV法直接测定其含量。目前国内外文献报道多采用荧光试剂芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)与DNJ发生柱前衍生化反应后，用HPLC-FLU法进行测定。FMOC-Cl是一种氨基酸衍生化试剂，主要用于伯胺和仲胺的衍生化，生成的衍生物具有稳定的荧光强度。DNJ分子中因为具有仲胺结构，所以可用FMOC-Cl进行柱前衍生化，生成的衍生物采用HPLC-FLU法进行测定。采用此方法对桑白皮药材或桑白皮提取物进行检测，虽然可以有效地检测出DNJ的含量，但是仅能检测出这一单一成分，无法全面反映并控制桑白皮药材以及桑白 皮提取物中总生物碱类活性成分的含量。 

杨文宇等在题为《桑树总生物碱分析方法与提取方法的探讨》一文中，公开了一种从桑叶、桑椹、桑白皮和桑枝中提取总生物碱的方法。该方法利用氯-邻联甲苯胺试剂作为显色剂，利用薄层色谱分析以及分光光度法检测总生物碱。这种方法虽然比较简便，对仪器的要求不高，但其分辨率较差，总生物碱中所含成分及含量均无法检测出来，并不适合对桑白皮药材以及桑白皮提取物进行精确的质量检测。 

由此可见，为提高桑白皮药材以及桑白皮提取物现有质量标准，亟待建立一种检测精确度较高、可鉴别总生物碱类多种活性成分的检测方法。 

发明内容

为了解决桑白皮药材或桑白皮提取物现有质量检测过程中仅能检测出单一成分，无法全面反映桑白皮总生物碱类活性成分含量的问题，本发明提供了一种桑白皮药材或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱的构建方法。 

本发明提供的桑白皮药材或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱的构建方法包括以下步骤：(a)制备桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液：以0.02mol/L的盐酸溶液或水作为溶剂，将桑白皮药材的粉末配制成桑白皮药材溶液；或者以水作为溶剂，将桑白皮提取物的粉末配制成桑白皮提取物溶液； 

(b)利用高效液相色谱法测得桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱，操作步骤包括：分别将硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液加入桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液，水浴下反应预定时间；再依次将甘氨酸溶液、醋酸水溶液加入到桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液，过滤后取续滤液注入高效液相色谱仪；所采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，并以乙腈为流动相A，0.1％醋酸为流动相B进行梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0～50分钟，流动相A体积比由30％上升到35％，流动相B体积比由70％下降到65％；50～60分钟，流动相A体积比保持为35％，流动相B体积比保持为65％；60～61分钟，流动相A体积比由35％上升到100％，流动相B体积比由65％下降到0％；61～70分钟，流动相A体积比保持为100％，流动相B体积比保持为0％；70～71分钟，流动相A体积比由100％下降到30％，流动相B体积比由0％上升到70％；荧光检测器激发波长为254nm，发射波长为309nm，柱温在20-40℃的范围内，经过上述色谱分离过程，从而测得桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱。 

进一步地，该构建方法还包括参照物溶液的制备，可将1-脱氧野尻霉素盐酸盐加入水中制备而成；制得的参照物溶液与桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液同时注入到高效液相色谱仪。 

进一步地，该构建方法中桑白皮药材溶液的制备包括：将过50目筛的桑白皮药材粉末0.2g，置于250ml容量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液200-240ml，超声处理，放冷，再加0.02mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。 

进一步地，该构建方法中桑白皮提取物溶液的制备包括：将桑白皮提取物粉末0.05g，置于100ml容器中，加入50ml水，称定重量，超声处理；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀；从容器中精密吸取0.5ml加入容量瓶中，用水稀释至10ml，摇匀得到桑白皮提取物溶液。 

进一步地，通过该构建方法得到的桑白皮药材总生物碱类成分的对照指纹图谱具有11个特征指纹峰。各个特征指纹峰的保留时间为：1号峰为0.537±0.038min，2号峰为1.000±0.000min，3号峰为1.400±0.010min，4号峰为1.429±0.004min，5号峰为1.470±0.017min，6号峰为1.906±0.016min，7号峰为2.028±0.013min，8号峰为2.203±0.022，9号峰为2.314±0.034min，10号峰为3.633±0.019min，11号峰为3.735±0.022min。 

进一步地，通过该构建方法得到的桑白皮提取物总生物碱类成分的对照指纹图谱具有13个特征指纹峰。各个特征指纹峰的保留时间为：1号峰为0.530±0.029min，2号峰即S峰为1.000±0.000min，3号峰为1.401±0.009min，4号峰为1.428±0.005min，5号峰为1.471±0.019min，6号峰为1.517±0.017min，7号峰为1.908±0.019min，8号峰为2.027±0.014min，9号峰为2.206±0.031min，10号峰为2.312±0.038min，11号峰为2.583±0.038min，12号峰为3.625±0.036min，13号峰为3.730±0.033min。 

本发明的另一目的在于提供一种桑白皮药材或桑白皮提取物的质量检测方法，包括以下步骤：按照上述构建方法中的步骤(a)制备待测桑白皮药材溶液或待测桑白皮提取物溶液；然后按照上述构建方法中的步骤(b)测得待测桑白皮药材指纹图谱或待测桑白皮提取物指纹图谱；以及将待测桑白皮药材指纹图谱与上述桑白皮药材总生物碱类成分的对照指纹图谱进行比较；或者将待测桑白皮提取物指纹图谱与上述桑白皮提取物总生物碱成分的对照指纹图谱进行比较。 

根据本发明所提供的桑白皮药材或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱的构建方法，得到了可全面反映桑白皮中药材中总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。这不但较为全面地反映了总生物碱类活性成分的含量情况，提高了桑白皮药材以及桑白皮提取物的质量控制标准，而且本发明指纹图谱构建方法具有稳定性好、重现性好的优点。通过与该对照指纹图谱的比较，可准确地判断出市场上现有桑白皮中药材的质量。 

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 

图1是桑白皮药材对照指纹图谱； 

图2是桑白皮提取物对照指纹图谱； 

图3是空白指纹图谱，是指不加入任何桑白皮药材、提取物溶液或参照物，只加入各种试剂而得到的高效液相色谱； 

图4是批号为Y100513HB的桑白皮药材的指纹图谱； 

图5是编号为S20100720(由批号为Y110225HN的桑白皮药材制备而成)的桑白皮提取物的指纹图谱； 

图6是批号为Y101229HB桑白皮药材的指纹图谱； 

图7是编号为S20100805(由批号为Y100826HN的桑白皮药材制备而成)桑白皮提取物的指纹图谱。 

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 

本发明的目的在于提供一种桑白皮药材或桑白皮提取物总生物碱类活性成分的指纹图谱的构建方法。本发明利用高效液相色谱法，对20批桑白皮药材及桑白皮提取物进行了研究，建立此总生物碱类活性成分的指纹图谱构建方法。本发明在荧光法的基础上选择合适的流动相以及梯度洗脱参数，对桑白皮中的总生物碱成分进行指纹图谱的检查，具有较强的针对性。 

本发明提供的构建方法包括以下步骤： 

(a)桑白皮药材溶液的制备：以0.02mol/L的盐酸溶液或水为溶剂，将桑白皮药材的粉末配制成桑白皮药材溶液，优选采用0.02mol/L的盐酸溶液作为溶剂，因为生物碱成分普遍呈弱碱性，用稀盐酸提取过程中的成盐效应可确保生物碱成分最大的提取率。当然，本发明的目的是将桑白皮药材制备成可用于高效液相色谱分离的溶液，所以在此宗旨下，本发明采用的溶剂并不仅限于0.02mol/L的盐酸溶液或水。溶液浓度可根据所采用的色谱柱负载量、流动相流速及极性等因素来确定，通常来说，其浓度可以控制在0.8g/L-1.0g/L的范围内。在本发明的具体实施方式中，先将桑白皮药材粉末过三号筛(50目左右)，以确保粉末颗粒大小比较均匀，有利于溶液的形成；然后精密称取粉末0.2g，并置于250ml容量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液适量，并以功率250W、频率28KHZ超声处理45分钟；自然放冷后，加0.02mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，静置，得到桑白皮药材溶液。这里所采用的过筛、超声处理等方式，其目的都在于加大桑白皮药材粉末的溶解度，以形成均匀溶液，避免堵塞色谱柱。本领域技术人员完全可以采取其他等同方式来替代上述过筛和超声处理步骤。 

对于桑白皮提取物溶液，则可直接通过将桑白皮提取物的粉末加入水中而制得。溶液浓度可根据所采用的色谱柱负载量、流动相流速及极性等因素来确定，通常来说，其浓度可以控制在0.05g/L-0.1g/L的范围内。在本发明所采用的具体实施方式中，先精密称取桑白皮提取物0.05g，置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，称定重量，以功率250W，频率33KHZ超声处理30分钟；然后自然放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀；精密吸取0.5ml，用水稀释至10ml，摇匀，得到桑白皮提取物溶液。 

(b)利用高效液相色谱法测得桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱，具体操作步骤如下： 

分别将硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液加入桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液，得到；在本发明的具体实施方式中，所采用的硼酸盐缓冲液浓度为0.4mol/L，pH值为8.5，芴甲氧酰氯乙腈溶液的浓度为5mmol/L。因为上述溶液的加入是现有DNJ检测方法中的常规手段，所以本领域技术人员完全可以根据桑白皮的活性成分含量及色谱分离条件，选择合适的浓度及加入量，本发明采用的硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液浓度和加入量并不局限于本发明的具体实施方式。随后，在水浴下反应预定时间，水浴温度可以是30℃，水浴时间为10-15分钟，优选为10分钟；再依次将甘氨酸溶液、醋酸水溶液加入到桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液，过滤后取续滤液注入高效液相色谱仪；在本发明的具体实施方式中，所采用的甘氨酸溶液为0.1mol/L，加入的体积为100μl，采用的醋酸浓度为0.1％，加入量为9.5ml。 

本发明所提供的构建方法的一个重要优势在于，通过本发明采用的色谱条件，所得指纹图谱的精密度、稳定性及重现性都非常好，此色谱条件未在其他文件中见到相关报道。本发明的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，并以乙腈为流动相A，0.1％醋酸为流动相B进行梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：0～50分钟，流动相A体积比由30％上升到35％，流动相B体积比由70％下降到65％；50～60分钟，流动相A体积比保持为35％，流动相B体积比保持为65％；60～61分钟，流动相A体积比由35％线性上升到100％，流动相B体积比由65％线性下降到0％；61～70分钟，流动相A体积比保持为100％，流动相B体积比保持为0％；70～71分钟，流动相A体积比由100％线性下降到30％，流动相B体积比由0％线性上升到70％；荧光检测器激发波长为254nm，发射波长为309nm，柱温在30-40℃的范围内，流速为0.8-1.0ml/L。通过色谱条件得到的指纹图谱，较为全面地反映了总生物碱类活性成分的含量情况，各活性成分之间的分离度较高。 

通过对20批桑白皮药材的指纹图谱构建，经过比较分析，确定了桑白皮药材总生物碱类成分的对照指纹图谱具有11个共有指纹峰，相对保留时间分别为：1号峰为0.537±0.038，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.400±0.010，4号峰为1.429±0.004，5号峰为1.470±0.017，6号峰为1.906±0.016，7号峰为2.028±0.013，8号峰为2.203±0.022，9号峰为2.314±0.034，10号峰为3.633±0.019，11号峰为3.735±0.022。 

11个共有指纹峰的优选相对保留时间分别为：1号峰为0.537，2号峰即S峰为1.000，3号峰为1.400，4号峰为1.429，5号峰为1.470，6号峰为1.906，7号峰为2.028，8号峰为2.203，9号峰为2.314，10号峰为3.633，11号峰为3.735。这些共有峰构成了桑白皮药材总生物碱类活性成分的指纹特征，可作为桑白皮药材总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。 

通过对20批桑白皮提取物的指纹图谱构建，经过比较分析，确定了桑白皮提取物总生物碱类成分的对照指纹图谱具有13个共有指纹峰，相对保留时间分别为：1号峰为0.530±0.029，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.401±0.009，4号峰为1.428±0.005，5号峰为1.471±0.019，6号峰为1.517±0.017，7号峰为1.908±0.019，8号峰为2.027±0.014，9号峰为2.206±0.031，10号峰为2.312±0.038，11号峰为2.583±0.038，12号峰为3.625±0.036，13号峰为3.730±0.033。 

13个共有指纹峰的优选相对保留时间分别为：1号峰为0.530，2号峰即S峰为1.000，3号峰为1.401，4号峰为1.428，5号峰为1.471，6号峰为1.517，7号峰为1.908，8号峰为2.027， 9号峰为2.206，10号峰为2.312，11号峰为2.583，12号峰为3.625，13号峰为3.730。这些共有峰构成了桑白皮提取物总生物碱类活性成分的指纹特征，可作为桑白皮提取物总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。 

在本发明提供的构建方法中，可进一步包括参照物溶液的制备。众所周知，参照物可用于考察指纹图谱的稳定性和重现性，有助于色谱的辨认。在液相色谱法中，一般选取容易获取的一个以上主要活性或指标成分作为对照，如无合适的对照物，可酌情考虑选择适宜的内标物作为参照物，也可以选择指纹图谱中稳定的色谱峰作为参照峰。本发明提供的构建方法中，可以不采用参照峰，直接以2号峰作为参照峰。也可采用1-脱氧野尻霉素盐酸盐作为参照物，将其加入水中直接制得参照物溶液；将制得的参照物溶液与桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液同时注入到高效液相色谱仪，在指纹图谱中将进一步增强2号峰的强度，有利于考察指纹图谱的稳定性和重现性。 

本发明的另一目的在于利用通过上述构建方法得到的指纹图谱对桑白皮中药材或桑白皮提取物进行质量控制。首先，按照上述构建方法中的步骤(a)制备待测桑白皮药材溶液或待测桑白皮提取物溶液；然后按照上述构建方法中的步骤(b)测得待测桑白皮药材指纹图谱或待测桑白皮提取物指纹图谱；将待测桑白皮药材指纹图谱与上述桑白皮药材总生物碱类成分的对照指纹图谱进行比较；或者将待测桑白皮提取物指纹图谱与上述桑白皮提取物总生物碱成分的对照指纹图谱进行比较。具体比较方法可以国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算来计算其相似度。 

实施例1 桑白皮药材对照指纹图谱建立 

(1)桑白皮药材的来源： 

本发明实施例所采用的20批桑白皮药材的产地主要为河南、河北、安徽、广西、湖南，上述品种经过鉴别，符合药典标准，无明显生物差异性，具体情况请见表1。 

表1 

批号	产地	是否有生物差异性
			Y070609HN	河南	无
Y100513HB	河北	无
			Y100716HB	河北	无
Y101113HB	河北	无
			Y101229HB	河北	无
Y110104HN	湖南	无
			Y101230AH	安徽	无
Y100826HN	河南	无

[0044] 

Y101026HB	河北	无
			Y101102HN	河南	无
Y110224GZ	广西	无
			Y110225HN	河南	无
Y110226HN	湖南	无
			Y110228SC	四川	无
Y110222HN	河南	无
			Y110224HN	湖南	无
Y101123HN	河南	无
			Y110225HB	河北	无
Y101009CQ	重庆	无
			Y100928HB	河北	无

(2)参照物溶液的制备，精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐参照物(Sigma公司，批号078K4062)适量，加水制成每1ml含4μg的溶液，即得； 

(3)桑白皮药材溶液(供试品)的制备，分别将20批桑白皮药材粉末过三号筛，精密称取0.2g，置250ml容量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液适量，超声处理(功率250W，频率28KHZ)45分钟，放冷，加0.02mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，静置； 

(4)桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱(对照图谱)的构建： 

所用仪器：SHIMADZU高效液相色谱仪包括LC-20AT色谱泵、RF-20A荧光检测器、CBM-20A控制器、DGU-20A5脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、class-vp工作站；色谱柱：Cosmosil C18(250×4.6mm，5μm)分析柱； 

测试方法：精密吸取参照物溶液和供试品溶液各100μl，置10ml离心管中，分别精密加入硼酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH8.5)100μl、芴甲氧酰氯乙腈溶液(5mmol/L)200μl，于30℃水浴下反应10min，再分别依次加入甘氨酸溶液(0.1mol/L)100μl，0.1％醋酸水溶液9.50ml，摇匀，滤过，取续滤液各10μl注入高效液相色谱仪，测定，记录80分钟色谱，可得到桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱； 

上述色谱实验过程是按照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》一部附录ⅥD)，并结合指纹图谱要求而测定的，具体参数为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流 动相A，以0.1％醋酸为流动相B进行梯度洗脱，荧光检测器激发波长为254nm，发射波长为309nm；柱温为30℃；流速为0.8ml/min； 

流动相梯度洗脱程序为：0～50分钟流动相A体积比由30％线性上升到35％，流动相B体积比由70％下降到65％；50～60分钟流动相A体积比保持为35％、流动相B体积比保持为65％；60～61分钟流动相A体积比由35％线性上升到100％，流动相B体积比由65％线性下降到0％；61～70分钟流动相A体积比保持为100％，流动相B体积比保持为0％；70～71分钟流动相A体积比由100％线性下降到30％，流动相B体积比由0％线性上升到70％；71～80分钟流动相A体积比保持为30％、流动相B体积比保持为70％。其中指纹图谱完成时间为70分钟，71～80分钟为系统平衡时间。 

通过20批桑白皮药材溶液的指纹图谱的比较分析，比较分析后，确定了11个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.537±0.038，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.400±0.010，4号峰为1.429±0.004，5号峰为1.470±0.017，6号峰为1.906±0.016，7号峰为2.028±0.013，8号峰为2.203±0.022，9号峰为2.314±0.034，10号峰为3.633±0.019，11号峰为3.735±0.022。如图1所示，这些共有峰构成了桑白皮药材总生物碱类活性成分的指纹特征，可作为桑白皮药材总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。图3是空白指纹图谱，是不加入任何桑白皮药材、提取物溶液或参照物，只加入各种试剂而得到的高效液相色谱。 

实施例2 桑白皮药材的指纹图谱质量检测方法 

(1)待测桑白皮药材溶液的制备：将待测桑白皮药材(批号Y100513HB)粉末过三号筛，精密称取0.2g，置250ml容量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液适量，超声处理(功率250W，频率28KHZ)45分钟，放冷，加0.02mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，静置； 

(2)参照物溶液的制备：精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐对照品适量，加水制成每1ml含4μg的溶液，即得； 

(3)按照实施例1的色谱测定方法及条件测定待测桑白皮药材的指纹图谱，如图4所示； 

(4)待测桑白皮药材指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，比较方法可根据国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》相关规定进行。经过计算，发现待测品的指纹图谱与对照指纹图谱有良好的相似性，相似度＞0.85。 

实施例3 桑白皮提取物对照指纹图谱建立 

(1)桑白皮提取物的来源：将实施例1中提及的20批桑白皮药材进行提取，得到20批 桑白皮提取物； 

(2)桑白皮提取物溶液的制备：称取20批桑白皮提取物各0.05g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHZ)30分钟；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀；精密吸取0.5ml，用水稀释至10ml，摇匀，得到20个桑白皮提取物溶液； 

(3)参照物溶液的制备同实施例1相同； 

(4)桑白皮提取物总生物碱类成分对照指纹图谱的构建： 

所用仪器：SHIMADZU高效液相色谱仪包括LC-20AT色谱泵、RF-20A荧光检测器、CBM-20A控制器、DGU-20A5脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、class-vp工作站；色谱柱：Cosmosil C18(250×4.6mm，5μm)分析柱； 

测试方法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各100μl，置10ml离心管中，分别精密加入硼酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH8.5)100μl、芴甲氧酰氯乙腈溶液(5mmol/L)200μl，于30℃水浴下反应10min，再分别依次加入甘氨酸溶液(0.1mol/L)100μl，0.1％醋酸水溶液9.50ml，摇匀，滤过，取续滤液各10μl注入高效液相色谱仪，各项色谱条件与实施例1相同，记录80分钟色谱，可得到桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱； 

通过20批桑白皮提取物溶液的指纹图谱的比较分析，比较分析后，确定了13个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.530，2号峰即S峰为1.000，3号峰为1.401，4号峰为1.428，5号峰为1.471，6号峰为1.517，7号峰为1.908，8号峰为2.027，9号峰为2.206，10号峰为2.312，11号峰为2.583，12号峰为3.625，13号峰为3.730。如图2所示，这些共有峰构成了桑白皮提取物总生物碱类活性成分的指纹特征，可作为桑白皮提取物总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。 

实施例4 编号为S20100720的桑白皮提取物的指纹图谱质量检测方法 

(1)待测桑白皮提取物溶液的制备：将待测桑白皮提取物(编号为S20100720)0.05g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHZ)30分钟；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀；精密吸取0.5ml，用水稀释至10ml，摇匀，得到待测桑白皮提取物溶液； 

(2)参照物溶液的制备：精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐对照品适量，加水制成每1ml含4μg的溶液，即得； 

(3)按照实施例1的色谱测定方法及条件测定待测桑白皮提取物的指纹图谱，如图5所 示； 

(4)待测桑白皮提取物指纹图谱与桑白皮提取物对照指纹图谱进行比较，比较方法可根据国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》相关规定进行。经过计算，发现待测品的指纹图谱与对照指纹图谱有良好的相似性，相似度＞0.85。 

实施例5 批号为Y101229HB桑白皮药材的指纹图谱质量检测方法 

(1)待测桑白皮药材溶液的制备：将待测桑白皮药材(批号为Y101229HB，产地河北)将待测桑白皮药材(批号Y101229HB)粉末过三号筛，精密称取0.2g，置250ml容量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液适量，超声处理(功率250W，频率28KHZ)45分钟，放冷，加0.02mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，静置； 

(2)参照物溶液的制备：精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐对照品适量，加水制成每1ml含4μg的溶液，即得； 

(3)按照实施例2的色谱测定方法及条件测定待测桑白皮药材的指纹图谱，如图6所示； 

(4)待测桑白皮药材指纹图谱与桑白皮药材对照指纹图谱进行比较，比较方法可根据国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》相关规定进行。经过计算，发现待测品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似性不好，相似度＜0.85。 

实施例6 编号为S20100805桑白皮提取物的指纹图谱质量检测方法 

(1)待测桑白皮提取物溶液的制备：将待测桑白皮提取物(编号为S20100805)0.05g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHZ)30分钟；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀；精密吸取0.5ml，用水稀释至10ml，摇匀，得到待测桑白皮提取物溶液； 

(2)参照物溶液的制备：精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐对照品适量，加水制成每1ml含4μg的溶液，即得； 

(3)按照实施例4的色谱测定方法及条件测定待测桑白皮提取物的指纹图谱，如图7所示； 

(4)待测桑白皮提取物指纹图谱与桑白皮提取物对照指纹图谱进行比较，比较方法可根据国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》相关规定进行。经过计算，发现待测品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似性不好，相似度＜0.85。 

实施例7 对桑白皮药材和桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱构建方法的考察 

(1)为了验证本发明提供的桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱构建方法的精密度、稳定性及重现性，对上述方法进行了以下实验，其结果如下： 

a.桑白皮药材指纹图谱精密度试验 

取同一供试品溶液(样品批号Y100513HB，产地河北，品种经过鉴别，符合药典标准。)，按实施例1的色谱条件连续进样5针，结果见表2。各指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度＞0.90。 

表2 桑白皮药材指纹图谱精密度考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	1.000	0.999	1.000	0.999	1.000

b.桑白皮药材指纹图谱稳定性试验 

取同一供试品溶液(样品批号Y100513HB)，按实施例1的色谱条件分别于0、8、16、24、36h进样，结果见表3。各指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明供试品溶液在36h内稳定。 

表3 桑白皮药材指纹图谱稳定性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.987	0.983	0.989	0.988	0.981

c.桑白皮药材指纹图谱重现性试验 

取同一供试品溶液(样品批号Y100513HB)，分别制备5份供试品溶液，按实施例1的色谱条件进样，结果见表4。各指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明方法重现性良好。 

表4 桑白皮药材指纹图谱重现性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.985	0.981	0.989	0.986	0.978

(2)为了验证本发明提供的桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱构建方法的精密度、稳定性及重现性，对上述方法进行了以下实验，其结果如下：

a.桑白皮提取物指纹图谱精密度试验 

取同一供试品溶液(编号为S20100720)，按上述色谱条件连续进样5针，结果见表5。各指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度＞0.90。 

表5 桑白皮提取物指纹图谱精密度考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	1.000	0.999	1.000	0.999	1.000

b.桑白皮提取物指纹图谱稳定性试验 

取同一供试品溶液(编号为S20100720)，按上述色谱条件分别于0、8、16、24、36h进样，结果见表6。各指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明供试品溶液在36h内稳定。 

表6 桑白皮提取物指纹图谱稳定性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.989	0.985	0.987	0.988	0.986

c.桑白皮提取物指纹图谱重现性试验 

取同一供试品溶液(编号为S20100720)，分别制备5份供试品溶液，按上述色谱条件进样，结果见表7。各指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明方法重现性良好。 

表7 桑白皮提取物指纹图谱重现性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.989	0.982	0.986	0.988	0.982

从上述实验结果可知，本发明提供的桑白皮药材和桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱的构建方法，具有精密度高、稳定性强、重现性良好的优点，得到的指纹图谱可全面反映桑白皮中药材中总生物碱类活性成分。这提高了桑白皮药材以及桑白皮提取物的质量控制标准。通过与该对照指纹图谱的比较，可准确地判断出市场上现有桑白皮中药材的质量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (7)

1.一种桑白皮药材或桑白皮提取物的总生物碱类成分指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(a)桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液的制备

所述桑白皮药材溶液的制备：以0.02mol/L的盐酸溶液或水为溶剂，将所述桑白皮药材的粉末配制成所述桑白皮药材溶液；

所述桑白皮提取物溶液的制备：以水作为溶剂，将所述桑白皮提取物的粉末配制成所述桑白皮提取物溶液；

(b)利用高效液相色谱法测得所述桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或所述桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱，其中，包括：

分别将硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液加入所述桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液，水浴下进行反应；再依次将甘氨酸溶液、醋酸水溶液加入到所述桑白皮药材溶液或所述桑白皮提取物溶液，过滤后取续滤液注入高效液相色谱仪，其中，

所述高效液相色谱仪中的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1％醋酸为流动相B进行梯度洗脱，荧光检测器激发波长为254nm，发射波长为309nm，柱温在20-40℃的范围内，所述梯度洗脱的程序如下：

0～50分钟，所述流动相A体积比由30％上升到35％，所述流动相B体积比由70％下降到65％；

50～60分钟，所述流动相A体积比保持为35％，所述流动相B体积比保持为65％；

60～61分钟，所述流动相A体积比由35％上升到100％，所述流动相B体积比由65％下降到0％；

61～70分钟，所述流动相A体积比保持为100％，所述流动相B体积比保持为0％；

70～71分钟，所述流动相A体积比由100％下降到30％，所述流动相B体积比由0％上升到70％；

得到所述桑白皮药材总生物碱类成分指纹图谱或所述桑白皮提取物总生物碱类成分指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，进一步包括参照物溶液的制备，所述参照物溶液可通过将1-脱氧野尻霉素盐酸盐加入水中制备而成；制得的所述参照物溶液与所述桑白皮药材溶液或桑白皮提取物溶液同时注入所述高效液相色谱仪。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述桑白皮药材溶液的制备进一步包括：

将过50目筛的所述桑白皮药材的粉末0.2g，置于250ml容量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液200-240ml，超声处理，放冷，再加0.02mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀得到所述桑白皮药材溶液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述桑白皮提取物溶液的制备进一步包括：

将所述桑白皮提取物的粉末0.05g，置100ml容器中，加入50ml水，称定重量，超声处理；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀；从所述容器中精密吸取0.5ml加入容量瓶中，用水稀释至10ml，摇匀得到所述桑白皮提取物溶液。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述桑白皮药材总生物碱类成分的对照指纹图谱中具有11个特征指纹峰，所述特征指纹峰的保留时间为：

1号峰为0.537±0.038min，2号峰为1.000±0.000min，3号峰为1.400±0.010min，4号峰为1.429±0.004min，5号峰为1.470±0.017min，6号峰为1.906±0.016min，7号峰为2.028±0.013min，8号峰为2.203±0.022，9号峰为2.314±0.034min，10号峰为3.633±0.019min，11号峰为3.735±0.022min。

6.根据权利要求1、2或4所述的构建方法，其特征在于，所述桑白皮提取物总生物碱类成分的对照指纹图谱中具有13个特征指纹峰，所述特征指纹峰的保留时间为：

1号峰为0.530±0.029min，2号峰为S峰，为1.000±0.000min，3号峰为1.401±0.009min，4号峰为1.428±0.005min，5号峰为1.471±0.019min，6号峰为1.517±0.017min，7号峰为1.908±0.019min，8号峰为2.027±0.014min，9号峰为2.206±0.031min，10号峰为2.312±0.038min，11号峰为2.583±0.038min，12号峰为3.625±0.036min，13号峰为3.730±0.033min。

7.一种桑白皮药材或桑白皮提取物的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

待测桑白皮药材或桑白皮提取物溶液的制备：按照权利要求1所述的构建方法中的步骤(a)制备所述待测桑白皮药材溶液或所述待测桑白皮提取物溶液；

所述待测桑白皮药材或待测桑白皮提取物的指纹图谱测定：按照权利要求1所述的构建方法中的步骤(b)测得所述待测桑白皮药材指纹图谱或所述待测桑白皮提取物的指纹图谱；以及

将所述待测桑白皮药材指纹图谱与权利要求5所述构建方法中的所述桑白皮药材总生物碱类成分对照指纹图谱进行比较；或者将所述待测桑白皮提取物指纹图谱与权利要求6所述构建方法中的所述桑白皮提取物总生物碱类成分对照指纹图谱进行比较。

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