CN109613134A - 一种桑白皮药材uplc指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法及其应用，包括步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、超高相液相色谱测定、指纹图谱的建立、相似度评价和聚类分析。本发明建立了23 min内快速鉴别桑白皮药材的UPLC指纹图谱方法，并对数据进行相似度评价和聚类分析，该方法简单、高效，重复性好，为全面、有效控制和科学评价桑白皮药材的质量提供了依据。
Description
技术领域
本发明属于药物分析及药物质量控制技术领域，具体涉及一种桑白皮药材指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
桑白皮又名桑根皮、白桑皮，为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮。始载于《神农本草经》，其性味甘寒，归肺经，具有泻肺平喘，利水消肿。用于肺热喘咳，水肿胀满尿少，面目肌肤浮肿等症。现代研究表明桑白皮的化学成分主要桑白皮中主要含有黄酮类、酚酸类、生物碱类等成分；黄酮类化合物主要包括：桑素、桑色烯、桑白皮素C、D；酚酸类化合物主要为二苯乙烯类、2-苯基苯并呋喃类和芪类低聚物三类，主要有白藜芦醇、氧化白藜芦醇、桑皮苷A。此外，尚含少量三萜、香豆素及多羟基生物碱类化合物。具有镇咳、祛痰及平喘、抗糖尿病、抗病毒、抗炎、降血糖统、利尿等药理作用。
目前，关于桑白皮指纹图谱或特征图谱方面的文献报道较少，2015年版《中国药典》仅收载性状、显微鉴别及薄层色谱鉴别，至今尚无明确化学成分指标评价桑白皮药材的品质，简单测定一个或几个有效(指标)成分的量已不能全面地反映药材的质量。随着现代分析技术的发展，指纹图谱作为一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法正在广泛应用，因此，有必要建立了一种快速鉴别桑白皮药材的UPLC指纹图谱方法，为有效控制和科学评价桑白皮药材的质量提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，该方法为桑白皮药材的质量评价和控制提供了较为全面、系统、有效的快速评价方法。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(a)对照品溶液的制备：
精密称取桑皮苷A对照品2.459mg，置10ml量瓶中，加70％乙醇制成每1ml含桑皮苷A 245.9μg的对照品溶液；
(b)供试品溶液的制备：
取桑白皮药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％乙醇20-30ml，称定重量，水浴加热回流15-30分钟，放冷，用50-80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(c)超高相液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0～2min，5％A；2～7min，5％→10％A；7～10min，10％→25％A；10～13min，25％→50％A；13～19min，50％→80％A；19～23min，80％A；检测波长：320nm；流速：0.38ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；
(d)指纹图谱的建立：
将多批桑白皮药材的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行共有峰标识，建立桑白皮药材的对照指纹图谱，确定具有14个共有峰，以峰1桑皮苷A的色谱峰为参照峰S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：1.00、峰2：1.07、峰3：1.21、峰4：1.27、峰5：1.30、峰6：1.37、峰7：1.44、峰8：1.49、峰9：1.63、峰10：1.95、峰11：1.99、峰12：2.14、峰13：2.30、峰14：2.37，相对保留时间在规定值的±10％之内；
(e)相似度评价：比较不同产地各批次桑白皮药材的色谱图与对照指纹图谱的相似度；
(f)聚类分析：运用SPSS19.0软件对不同产地的桑白皮药材进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，得到不同产地的桑白皮药材的聚类结果。
优选的，步骤(b)供试品溶液的制备：取桑白皮药材粉末，过三号筛，0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22um滤膜滤过，取续滤液，即得。
本发明还提供了上述桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法在桑白皮药材质量评价和检测中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
①本发明采用UPLC方法建立了23min内快速鉴别桑白皮药材的指纹图谱，与现有方法相比，缩短了检测时间，提高分析效率，并对数据进行了相似度评价和聚类分析，该方法简单、高效，重复性好，为全面、有效控制和科学评价桑白皮药材的质量提供了依据。
②本发明采用水浴加热回流30分钟作为样品前处理方法，与现有方法相比，在缩短了前处理时间的前提下达到了相同的效果，简便了前处理操作，提高了前处理方法的可重现性，同时节省了成本。
③本发明通过与标准品对照，指认了特征峰1为桑皮苷A，并选择其作为参照峰，提高了方法的专属性，同时使其余特征峰的定位更准确，使方法更精确。
附图说明
图1为18批桑白皮药材UPLC指纹图谱叠加图；
图2为18批桑白皮药材UPLC指纹图谱共有模式图；
图3为18批桑白皮药材的聚类分析结果图；
图4-6分别为254nm、280nm和320nm波长下的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
1、仪器与试药
1.1仪器
仪器：Waters高效液相色谱仪(H-Class，沃特世公司)；ME204E型万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26型百万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS28型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct超纯水系统(默克股份有限公司)。
1.2对照品和试剂
桑皮苷A对照品(批号：17071002，成都普菲德生物科技有限公司，纯度>98％)；乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
1.3药材
不同批次桑白皮药材的产地和批号等信息详见表1。所有样品经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，样品存放于广东一方制药有限公司。本发明的样品分别采自云南、四川、广西三个产地，涵盖了桑白皮的道地产区和大宗产区，经检测均符合2015《中国药典》桑白皮项下有关要求，在产地和质量上具有代表性。
表1桑白皮药材样品信息
2、方法与结果
2.1对照品溶液的制备精密称取桑皮苷A对照品2.459mg，置10ml量瓶中，加70％乙醇制成每1ml含桑皮苷A 245.9μg的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备取桑白皮药材粉末，过三号筛，0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22um滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3超高相液相色谱测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：色谱柱：Agilent SB C18柱(2.1×100mm，1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0～2min，5％A；2～7min，5％→10％A；7～10min，10％→25％A；10～13min，25％→50％A；13～19min，50％→80％A；19～23min，80％A；检测波长：320nm；流速：0.38ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；
3、供试品溶液制备方法考察
3.1提取溶媒考察
本次实验分别考察了不同提取溶剂对桑白皮药材指纹图谱的影响，选取甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、水作为提取溶剂，对不同提取溶剂的样品溶液指纹图谱进行测定，确定最佳提取溶剂。
取桑白皮药材粉末(过三号筛)约0.5g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇、70％甲醇、30％甲醇、乙醇、70％乙醇、水25ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇、70％甲醇、30％甲醇、乙醇、70％乙醇、水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表2。
表2桑白皮药材不同提取溶剂考察指纹图谱测定结果
通过对比6种不同提取溶剂的色谱图可发现，以50％甲醇和水为提取溶剂指纹图谱中具有色谱峰丢失峰，而其他4种提取溶剂色谱图的色谱峰数目与色谱峰峰形一致，总峰面积大小的顺序为：70％乙醇>70％甲醇>甲醇>乙醇；综合考虑各溶剂的提取能力、色谱峰峰形、峰面积/称样量的值和溶剂效应等，最终采用70％乙醇作为提取溶剂。
3.2提取溶剂方式考察
本次实验考察不同提取方式对桑白皮药材指纹图谱的影响，选取水浴加热回流与超声处理两种方式。对不同提取方式的样品溶液指纹图谱进行测定，确定最佳提取方式。
取桑白皮药材粉末(过三号筛)约0.5g，共2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，分别水浴加热回流、超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表3。
表3桑白皮药材不同提取方式考察指纹图谱测定结果
对比了两种提取方式，不同提取方式的色谱图色谱峰数目与色谱峰峰形一致，总峰面积大小的顺序为：水浴加热回流>超声处理，故选择水浴加热回流作为提取方式。
3.3提取时间考察
本次实验考察不同提取时间对桑白皮药材指纹图谱的影响，选取加热回流提取时间分别为：15分钟、30分钟、45分钟、60分钟。对不同提取时间的样品溶液指纹图谱进行测定，确定最佳提取时间。
取桑白皮药材粉末约0.5g，共4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，分别水浴加热回流15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表4。
表4桑白皮药材不同提取时间考察指纹图谱测定结果
通过对比不同提取时间桑白皮药材色谱图，可发现随着水浴加热回流时间的增加，色谱图总峰面积没有明显的增加，说明水浴加热回流15分钟已经能提取充分，为保证方法的耐用性，提取时间选择30分钟。
根据上述实验结果，桑白皮药材指纹图谱样品前处理方法可确定为：取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4、色谱条件优化
4.1检测波长的确定
本发明采用DAD检测器对桑白皮供试品溶液进行了紫外190-400nm扫描，分别比较了254nm、280nm及320nm波长下的色谱图(如图4-6)，综合考虑个色谱峰的吸收强度、峰个数信息，结果发现320nm波长下整体性峰型较好、吸收强、色谱峰数较多且各峰之间的分离度较好，能够反映组分的全貌，因此，选择320nm为检测波长。
4.2流动相的选择
比较不同缓冲盐对桑白皮药材指纹图谱的影响，分别考察0.1％磷酸、0.2％甲酸、0.1％醋酸对色谱峰分离效果的影响，结果显示：通过比较不同缓冲盐对桑白皮药材指纹图谱的影响，结果发现0.1％磷酸溶液所得色谱图与0.2％甲酸、0.1％醋酸相比，峰形更好，基线更平稳，因此选择0.1％磷酸作为缓冲盐。
4.3柱温的考察
比较柱温对桑白皮药材指纹图谱的影响，分别考察28℃、30℃、32℃对色谱峰分离效果的影响，结果显示：通过比较不同柱温对桑白皮药材指纹图谱的影响，发现30±2℃对桑白皮药材指纹图谱影响不大，所以选择常用的柱温30℃。
4.4流速的考察
考察桑白皮指纹图谱流速分别为0.38ml/min、0.40ml/min、0.42ml/min时对色谱峰分离效果的影响。结果表明：不同流速的对比，以流速为0.38ml/min，各色谱峰分离效果最佳。
5、方法学考察
5.1专属性试验取桑白皮药材供试品溶液、对照品溶液、空白溶液依次进样检测，考察实验方法的专属性。结果表明，样品中各个色谱峰分离较好，峰形对称，并且空白无干扰，该方法专属性良好。
5.2精密度试验取同一桑白皮药材供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，以桑皮苷A为参照峰时，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.11％～0.13％、0.32％～2.91％，表明仪器精密度良好。
5.3重复性试验平行制备6份桑白皮药材供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，以桑皮苷A为参照峰时，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.27％～0.31％、1.54％～2.84％，表明该方法的重复性较好。
5.4稳定性试验取桑白皮药材供试品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，10，12h按“2.3”项下色谱条件测定，以桑皮苷A为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.44％～0.52％、0.62％～2.82％，表明供试品溶液在制备后12h内稳定性良好。
6、桑白皮药材指纹图谱的建立
6.1共有峰的确定取18批桑白皮药材样品，按“2.2”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“2.3”项下确定的色谱条件，进样测定，根据18批供试品溶液UPLC指纹图谱给出的参数，比较供试品图谱，其中14个色谱峰为各批供试品所共有，各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步拟定为桑白皮药材的指标成分群。因此，确定这14个峰为18批桑白皮药材的共有峰。
6.2参比峰的选择经与对照品、空白溶液进行对照，1号峰为桑白皮苷A峰，且空白无干扰；1号峰为桑白皮药材的第一大峰，在各批次样品图谱中桑皮苷A的色谱峰(1号峰)分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定为参照峰。以1号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：1.00、峰2：1.07、峰3：1.21、峰4：1.27、峰5：1.30、峰6：1.37、峰7：1.44、峰8：1.49、峰9：1.63、峰10：1.95、峰11：1.99、峰12：2.14、峰13：2.30、峰14：2.37，相对保留时间在规定值的±10％之内；各批样品的共有峰的相对保留时间与相对峰面积见表5，表6。
表5 18批桑白皮药材样品UPLC指纹图谱分析结果(相对保留时间)
表6 18批桑白皮药材样品UPLC指纹图谱分析结果(相对峰面积)
6.3桑白皮药材样品共有模式建立采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)通过色谱峰多点校正的方法对18批桑白皮药材指纹图谱色谱峰进行自动匹配，生成药材的色谱指纹图谱共有模式(中位数法)。指纹图谱的叠加图见图1，生成的共有模式见图2。
6.4各产地药材指纹图谱相似度评价以各个产地桑白皮药材生成的共有模式为对照，各产地样品的相似度在0.961～1.000之间，表现出了良好的相似度，具体结果见表7。各色谱峰的峰面积有差异，说明不同产地桑白皮药材其成分的组成基本上是一致的，但成分含有量存在差异，其原因与产地、生长年限、采收期、加工方法等因素有关。
表7桑白皮样品指纹图谱相似度评价
6.5将各色谱峰面积相对于称样量量化，运用SPSS19.0软件对7个产地桑白皮药材进行系统聚类，采用组间平均数联结法averagelinkage(between groups)，以夹角余弦(cosin)作为样品相似度的距离公式。聚类分析将桑白皮样品分为5类，Ⅰ类包括S1、S2，产地均为云南省曲靖市；Ⅱ类包括S03、S04、S05、S06、S07、S09、S18，产地包含四川省的三个市和广西南宁市；Ⅲ类包括包括S08、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17，产地主要为四川西昌市和广西的三个主产市；具体结果见图3；由聚类分析结果可以看出来，云南产地的两批样品紧密的聚在一起，广西和四川的样品聚在一类。建立的指纹图谱可以对云南产的桑白皮和其他两个省的桑白皮进行初步区分，表明不同产地的桑白皮指纹图谱有一定的差别。三大主产区的桑白皮药材具有较高的相似性，与相似度分析结果一致。
Claims (3)
1.一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）对照品溶液的制备：
精密称取桑皮苷A对照品2.459 mg，置10 ml量瓶中，加70%乙醇制成每1 ml含桑皮苷A245.9μg的对照品溶液；
（b）供试品溶液的制备：
取桑白皮药材粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80%乙醇20-30ml，称定重量，水浴加热回流15-30 分钟，放冷，用50-80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（c）超高相液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.5µl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B进行梯度洗脱：0~2min，5% A；2~7min，5%→10% A；7~10min，10%→25% A；10~13min，25%→50% A；13~19min，50%→80% A；19~23min，80% A；检测波长：320 nm；流速：0.38 ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；
（d）指纹图谱的建立：
将多批桑白皮药材的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行共有峰标识，建立桑白皮药材的对照指纹图谱，确定具有14个共有峰，以峰1 桑皮苷A 的色谱峰为参照峰S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：1.00、峰2：1.07、峰3：1.21、峰4：1.27、峰5：1.30、峰6：1.37、峰7：1.44、峰8：1.49、峰9：1.63、峰10：1.95、峰11：1.99、峰12：2.14、峰13：2.30、峰14：2.37，相对保留时间在规定值的±10%之内；
（e）相似度评价：比较不同产地各批次桑白皮药材的色谱图与对照指纹图谱的相似度；
（f）聚类分析：运用SPSS19.0软件对不同产地的桑白皮药材进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，得到不同产地的桑白皮药材的聚类结果。
2.根据权利要求1所述的一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(b) 供试品溶液的制备：
取桑白皮药材粉末，过三号筛，0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，称定重量，水浴加热回流30 分钟，放冷，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22um滤膜滤过，取续滤液，即得。
3.权利要求1或2所述的一种桑白皮药材UPLC指纹图谱的构建方法在桑白皮药材质量评价和检测中的应用。
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