CN109521132A - 一种僵蚕hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括以下步骤：称取僵蚕粉，用80％(V/V)的乙醇溶液，以1:20的料液比超声波下提取，过滤，蒸干，用甲醇定容，微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；配制对照品溶液；吸取供试品溶液或混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录60min内的指纹图谱；测定若干批次僵蚕药材的HPLC指纹图谱，通过相似度评价系统分析后获得中药材僵蚕的HPLC特征指纹图谱。本发明通过高效液相色谱建立僵蚕HPLC的对照指纹图谱具有很好的精密度、重现性及稳定性，能较为全面地反映僵蚕所含化学成分的种类与数量，能对药品质量进行整体描述和评价。

Description

一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明属于仪器分析领域，具体涉及一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法。
背景技术
僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕(Bombyx mori L.)4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌(Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant)而致死的干燥体。
僵蚕药用历史悠久。在中国、韩国和日本的传统医学典籍中，僵蚕具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效，用于肝风夹痰、惊风抽搐、小儿急惊、破伤风、中风口风热头痛、目赤咽痛、风疹瘙痒、发颐痄腮等疾病的治疗。现代药理试验证实，僵蚕水提物或醇提物具有抗惊厥、抗癫痫、抗凝血、降糖降脂、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理活性，在药食用领域展现出广阔的发展前景。
当前，僵蚕主要来源于养蚕过程中自然感染白僵菌的病死僵蚕。这些僵蚕来自千家万户，在致病白僵菌菌种、家蚕品种、感染剂量和僵化时间上各不相同，导致其药用品质参差不齐。而且，有些农户或商贩受经济利益驱使，将其它病蚕或未感染家蚕作处理后冒充僵蚕进行出售。这些伪劣僵蚕的使用更是直接影响到僵蚕在临床上的使用效果，甚至威胁到患者的安全。
然而，《中国药典》中僵蚕质量标准较笼统，缺少反映僵蚕内在药效成分的定性、定量分析，无法对市场上的僵蚕原料实现科学评级，也无法对品质低劣、药效较差的僵蚕予以鉴别与淘汰。因此，建立科学的僵蚕质量评价技术，对保障僵蚕品质有重要意义。
中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，
发明内容
针对当前僵蚕质量标准落后、指纹图谱尚未建立这一现状，本发明的目的在于提供一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法，并用相似度软件进行评价，可全面地对僵蚕质量进行评价，实现鉴别僵蚕真伪和评价僵蚕品质的目的。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：称取僵蚕粉，用80％(V/V)的乙醇溶液，以1:20的料液比超声波下提取60min，提取温度60℃；提取后过滤，蒸干，用甲醇定容，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液的配制：称取槲皮素对照品2.5mg、芦丁对照品0.5mg、山奈酚对照品0.25mg、紫云英苷对照品0.5mg，混合，加入甲醇定容，0.45μm滤膜过滤，得混合对照品溶液；
(3)高效液相色谱分析：吸取供试品溶液或混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录60min内的指纹图谱；
色谱条件是：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250nm，2.6μm)，柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长：360nm，进样量10μL，流动相A：0.4％冰乙酸溶液，流动相B：100％乙腈，采用梯度洗脱方式：从0-40min，流动相A的体积百分含量由95％降低至75％，流动相B的体积百分含量由5％提高至25％；从40-45min，流动相A的体积百分含量由75％降低至65％，流动相B的体积百分含量由25％提高至35％；从45-50min，流动相A的体积百分含量由65％降低至50％，流动相B的体积百分含量由35％提高至50％；
(4)测定若干批次僵蚕药材的HPLC指纹图谱，通过相似度评价系统分析后获得中药材僵蚕的HPLC特征指纹图谱；
所述的若干批次优选10批次以上；
所述的相似度评价系统优选《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过高效液相色谱建立僵蚕HPLC的对照指纹图谱，并通过试验确定对照指纹图谱的精密度、重现性及稳定性。本发明全面考虑了中药一般为多组分复杂体系这一因素，建立的僵蚕HPLC指纹图谱能较为全面地反映僵蚕所含化学成分的种类与数量，通过指纹图谱中共有峰的有无和相似度的比较对药品质量进行整体描述和评价，是一种科学、客观、有效、高效的方法，可保证药材质量的稳定性及临床用药有有效性与安全性。
附图说明
图1-图2是10批僵蚕的外观与横截面图。
图3是10批次僵蚕药材HPLC色谱图。
图4是10批僵蚕药材特征指纹图谱。
图5是僵蚕标准指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例用的主要仪器和药品：
选用Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国)；二极管阵列检测器(DAD)；
芦丁和紫云英苷购自广州齐云生物技术有限公司；槲皮素和山萘酚购自成都曼斯特生物科技有限公司。
实施例
一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)采购僵蚕：从药店采购10批僵蚕药材，外观和横截面图如图1-图2所示，经鉴定均为白僵蚕。
(2)供试品溶液的制备：精确称取2.00g僵蚕粉，用80％的乙醇溶液，以1:20的料液比超声波下提取60min，超声温度60℃。提取后过滤，旋转蒸发仪减压蒸干，用甲醇定容至25mL容量瓶，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
(3)对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品2.5mg、芦丁对照品0.5mg、山奈酚对照品0.25mg、紫云英苷对照品0.5mg，加入甲醇定容至10mL量瓶中，0.45μm滤膜过滤，得混合对照品溶液。
(4)高效液相色谱分析：吸取供试品溶液或混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录60min内的指纹图谱；
色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，2.6μm)；二极管阵列检测器(DAD)；柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长：360nm，进样量10μL，流动相A：0.4％冰乙酸溶液，流动相B：100％乙腈，采用梯度洗脱程序，见表1。
表1僵蚕指纹图谱流动相梯度洗脱条件
10批次僵蚕HPLC指纹色谱图，结果见图3。
(5)将步骤(4)获得的10批次僵蚕HPLC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，通过对色谱峰进行多点校正，采用中位数方法，时间窗宽度为0.1，自动匹配色谱峰，生成僵蚕药材特征指纹图谱，如图4所示。10批僵蚕药材HPLC色谱图有10个共有峰，各共有峰的保留时间与峰面积见表2。各共有峰稳定，具有指纹图谱特征性，可初步拟定为僵蚕药材的指标成分群。
表2 10批次僵蚕药材指纹图谱共有峰保留时间及峰面积
由10批僵蚕样本共有特征峰构成僵蚕HPLC的标准指纹图谱，如图5所示，其中3、6、10、11号色谱峰分别为芦丁、紫云英苷、槲皮素和山奈酚。
相似度评价：用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，计算10种僵蚕指纹色谱图之间的相似度，见表3。
由结果可以看到，10个批次僵蚕药材的相似度并不一致，S1与S2、S3、S4、S7、S8的相似度均在0.9以上，与S5、S6、S9、S10的相似度在0.8～0.9之间。
以共有模式R为基准，市售僵蚕药材特征指纹图谱相似度结果如表4所示，10个样品中相似度大于0.9的有6个样品，可以判定它们的质量相似。相似度在0.8～0.9之间的有4个样品。
表3 10批僵蚕药材指纹图谱相似度
表4 10批次僵蚕药材特征图谱相似度比较(以共有模式R为基准)
此外，还对本发明方法的精密度、重现性、稳定性做了试验，试验方法和结果如下所示：
精密度试验：取同一供试品溶液，连续进样5次，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行相似度评价，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于2％、相对峰面积RSD均小于3％，相似度为0.99以上，表明仪器精密度良好。
重现性试验：取同一批僵蚕药材5份，按(1)下供试品制备方法平行制备5份供试品溶液，按(2)下色谱条件进行测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行相似度评价，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于2％、相对峰面积RSD均小于3％，相似度为0.99以上，表明该方法重复性良好。
稳定性试验：取同一供试品溶液，于0h、2h、4h、8h、24h进样，按(2)下色谱条件进行测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行相似度评价，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于2％、相对峰面积RSD均小于3％，相似度为0.99以上，表明供试品溶液在室温下24h内稳定性良好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种僵蚕HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取僵蚕粉，用80％(V/V)的乙醇溶液，以1:20的料液比超声波下提取60min，提取温度60℃；提取后过滤，蒸干，用甲醇定容，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；
(2)配制对照品溶液；
(3)吸取供试品溶液或混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录60min内的指纹图谱；
色谱条件是：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18，柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长：360nm，进样量10μL，流动相A：0.4％冰乙酸溶液，流动相B：100％乙腈，采用梯度洗脱方式：从0-40min，流动相A的体积百分含量由95％降低至75％，流动相B的体积百分含量由5％提高至25％；从40-45min，流动相A的体积百分含量由75％降低至65％，流动相B的体积百分含量由25％提高至35％；从45-50min，流动相A的体积百分含量由65％降低至50％，流动相B的体积百分含量由35％提高至50％；
(4)测定若干批次僵蚕药材的HPLC指纹图谱，通过相似度评价系统分析后获得中药材僵蚕的HPLC特征指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的配制对照品溶液包括以下步骤：称取槲皮素对照品2.5mg、芦丁对照品0.5mg、山奈酚对照品0.25mg、紫云英苷对照品0.5mg，混合，加入甲醇定容，0.45μm滤膜过滤，得混合对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的若干批次是10批次以上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的相似度评价系统是《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》。
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