CN110286169A - 一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法及其应用 - Google Patents

一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法及其应用。本发明采用高效液相色谱方法，在色谱柱：Stamsil C18(250mm×4.6mm i.d，5μm)，流动相组成：流动相A为乙腈，流动相B为含0.1%磷酸的水溶液；流速：0.8L/min，检测波长330nm；柱温：26℃；进样量：20μL的检测条件下分别建立了从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法。本发明的5种化学成分含量测定方法具有良好的分析评价能力，有简便、稳定、准确等优势，可为评价桑枝药材的质量提供方法依据。该研究为进一步药效研究奠定了基础。

Description

一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法 及其应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法及其应用。
背景技术
2015年版药典记载其为桑科植物桑(Morus albaL.)的干燥嫩枝。春末夏初采收，去叶，晒干，或趁鲜切片，晒干。桑枝中起主要药理活性作用的成分为桑枝多糖、黄酮类和生物碱类成分。药理活性主要包括降低血脂、降血糖、抗炎作用以及多糖免疫作用等。
本发明采用高效液相色谱(HPLC)法对中药桑枝中的5种成分(桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇、桑辛素)同时进行含量测定，并对不同桑枝炮制品进行测定，为桑枝进一步药效研究奠定了基础，同时为中药桑枝的质量控制提供方法学支持和数据参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，可以对中药桑枝中的5种成分(桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇、桑辛素)同时进行含量测定。
本发明提供的技术方案为：
一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，包括以下步骤：
(1)分别配制对照品溶液和供试品溶液；
(2)检测波长的选择：取桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的对照品溶液在波长200-800nm范围内扫描，发现桑皮苷A、绿原酸在326nm处有最大吸收，白藜芦醇苷、白藜芦醇在328nm处有最大吸收，桑辛素在269nm处有最大吸收，最终选择峰数较多，分离较好，信号响应强度适当的波长作为最佳检测波长；
(3)采用高效液相色谱方法，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Stamsil C18(250mm×4.6mm i.d，5μm)，
流动相组成：流动相A为乙腈，流动相B为含0.1％磷酸的水溶液；
流速：0.8L/min，
检测波长330nm；
柱温：26℃；
进样量：20μL；
(4)建立标准曲线，求出桑枝生品中桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的含量。
作为优选，所述对照品溶液的制备方法如下：分别精密称取桑皮苷A对照品、绿原酸对照品、白藜芦醇苷对照品、白藜芦醇对照品和桑辛素对照品，加甲醇配成浓度分别为0.72、0.24、0.21、0.25和0.74mg/mL的混合对照品溶液，作为储备液。
作为优选，所述供试品溶液的制备方法如下：精密称取桑枝生品粉末1.0021g，置具塞锥形瓶中，加25mL 80％甲醇，超声处理(功率250kW，频率40kHz)30min过滤，滤渣用相同方法继续提取1次，过滤，合并提取液，蒸干；残渣用甲醇溶解，并定容置于4mL容量瓶中，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，滤液供HPLC分析。
作为优选，所述流动相按照梯度进行洗脱。
作为优选，所述最佳吸收波长为330nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法具有良好的分析评价能力，有简便、稳定、准确等优势，可为评价桑枝药材的质量提供方法依据。该研究为进一步药效研究奠定了基础。
附图说明
图1为桑枝的HPLC特征图谱；
其中，1-12.特征指纹峰；1-桑皮苷A(参照峰)；2-绿原酸；7-白藜芦醇；12-桑辛素；
图2为12个产地桑枝的HPLC特征图谱；
图3为HPLC图；
其中，A-混合对照品；B-桑枝样品；1-桑皮苷A；2-绿原酸；3-白藜芦醇苷；4-白藜芦醇；5-桑辛素。
具体实施方式
参考下列实施例将更容易理解本发明，给出的实施例不是限制本发明的范围。
实施例：
1仪器与方法
1.1仪器Prominence UFLC岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；ME235S电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ-5200DE超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore纯水仪(美国Millipore公司)；炒锅(九阳股份有限公司)；电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.2试药 桑皮苷A(西格玛公司，批号：18011503，纯度：98％，供含量测定用)；
绿原酸(成都普瑞法科技开发有限公司，批号：BP0345，纯度：99％，供含量测定用)；白藜芦醇苷(西格玛公司，批号：141121，纯度：98％，供含量测定用)；白藜芦醇(西格玛公司，批号：18012503，纯度：98％，供含量测定用)；桑辛素(西格玛公司，批号：18022501，纯度：98％，供含量测定用)；乙腈(美国Honeywell公司，色谱纯)；甲醇(美国Honeywell公司，色谱纯)；磷酸(天津市富宇精细化工有限公司，色谱纯)；黄酒(湖州老恒和酿造有限公司)；白醋(山西紫林醋业股份有限公司)；盐(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；熟蜜(西安槐花蜜)。
表1不同产地桑枝药材来源
2特征图谱测定方法与结果
2.1色谱条件Stamsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为乙腈流动相B为水(含0.1％磷酸)，按表2程序进行梯度洗脱；柱温：26℃；流速：0.8mL/min；进样体积：20μL；吸收波长：330nm，261nm。
表2梯度洗脱程序表
2.2对照品溶液的制备精密称取桑皮苷A对照品2.5mg，置于25mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液，作为参比溶液。
2.3供试品溶液的制备精密称取桑枝生品(S1)粉末(过3号筛)1.0021g，置具塞锥形瓶中，加25mL 80％甲醇，超声处理(功率250kW，频率40kHz)30min，过滤，滤渣用相同方法继续提取一次，滤过，合并提取液，蒸干。残渣用甲醇溶解，并定容至于4ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，滤液供HPLC分析。
2.4方法学考察
2.4.1精密度实验 取2.3项下制备的供试品溶液(S1)，连续进样6次，分别对12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果其相对保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于1.0％和3.0％，结果表明，该方法精密度良好。
2.4.2稳定性实验 取2.3项下制备的供试品溶液(S1)，分别在0，3，6，9，12，15和18h进样，考察12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果其相对保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于1.0％和3.0％，结果表明，供试品溶液在18h内稳定性良好。
2.4.3重复性实验 取6份供试品(S1)，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行分析，分别对12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果其相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于1.0％和3.0％，表明该方法重复性良好。
2.4.4指纹图谱的建立及相似度分析 取12个产地的桑枝样品，分别按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行分析，进样量为20μL，记录指纹图谱，见图1。
由图1可知，峰1为桑皮苷A即参比物，建立指纹图谱。
12个产地桑枝样品12个共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于2.0％和3.0％，符合文献要求，见图1和图2。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对12个产地桑枝样品的特征图谱进行相似度分析，结果对选定的12个共有色谱峰进行谱峰匹配，得出了样品特征图谱的共有模式，见图1；整体相似度为0.691-0.991。结果表明，这12个产地桑枝的化学成分具有良好的一致性。
3测定方法与结果
3.1色谱条件 同2.1项下色谱条件
3.2对照品溶液的制备 分别精密称取桑皮苷A对照品、绿原酸对照品、白藜芦醇苷对照品、白藜芦醇对照品、桑辛素对照品，加甲醇配成浓度分别为0.72，0.24，0.21，0.25和0.74mg·mL-1的混合对照品溶液，作为储备液。
3.3供试品溶液的制备 同2.3项下方法。
3.4线性关系 分别精密量取3.2项下制备的储备液，用甲醇稀释成一系列浓度，0.45um微孔滤膜滤过，按2.1项下色谱条件进样，以各对照品的质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，计算得其线性方程、相关系数以及线性范围，见表3和图3。结果表明，各对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。
表3标准曲线、线性范围和相关系数
3.5不同比例甲醇提取液的对比 按照2.3项下方法制备不同比例甲醇提取液的桑枝(S1)供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，测得不同比例甲醇提取液的桑枝(陕西)中桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的平均含量(mg-1)见表4。
表4不同比例甲醇提取液的桑枝样品中五种成分含量的对比
根据不同比例甲醇提取液的桑枝样品中五种成分含量的对比，最终选用80％甲醇作为提取液。
3.5精密度实验 取浓度为0.1mg·ml-1的混合溶液，按照2.1项下色谱条件进样，连续进样6次测得桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的RSD值分别为0.6285％，0.1888％，0.0918％，0.0888％和0.2976％，结果表明，该方法精密度良好。
3.6稳定性实验 精密吸取2.3项下制备的桑枝(S1)供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别在0，3，6，9，12，15和18h进样，结果桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的峰面积RSD值分别为1.6080％，1.2598％，0.9133％，0.8222％和1.3822％，表明该溶液在18h内稳定。
3.7重复性实验 精密称取6份桑枝(S1)粉末(过3号筛)，分别按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定。见表7。桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的平均含量分别为1.1538，0.1917，00149，0.0204和0.0947mg·-1，RSD值分别为0.7813％，1.7630％，1.9274％，1.9026％和1.7804％。，结果表明，该方法重复性良好。
3.8加样回收率实验 精密称取桑枝(S1)粉末(过3号筛，其中桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的含量分别为1.1538，0.1917，00149，0.0204，0.0947mg-1)0.5g，分别添加混合对照品溶液(精密称取桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素适量，制成质量浓度分别为0.7666，0.1152，0.0092，0.0125和0.0572mg·-1的混合对照品溶液)，再加甲醇定容至刻度，按照2.3项下方法制备供试品溶液，6份，按照2.1项下色谱条件进行测定。结果表明，该方法回收率良好。见表5。
表5加样回收率实验结果
表5(续)加样回收率实验结果
3.10不同产地桑枝样品中五种成分含量的对比 按照2.3项下方法制备不同产地桑枝的供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，测得不同产地桑枝中桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的平均含量(mg·-1)见表6。根据不同产地桑枝样品中五种成分含量的对比，最终选用产地为河北的桑枝饮片作为后续炮制的原料药材。
3.11桑枝炮制品的制备
3.11.1酒炙品 取桑枝饮片100g，加黄酒12.75g拌匀，闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火炒至桑枝表面微黄，取出晾凉，用时粉碎。
3.11.2醋炙品 取桑枝饮片100.21g，加入白醋30.73g拌匀，闷润，待醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火炒至桑枝表面微黄，取出晾凉，用时粉碎。
表6不同产地桑枝样品中五种成分含量的对比
3.11.3非传统炮制品 取桑枝饮片去除表面杂质，将桑枝饮片放入饱和食盐水中浸泡2小时，取出晾晒。晾晒的环境选择暗环境，至其表面未有水分残留即可；将晾晒后的桑枝饮片表面涂上熟蜜；将涂蜜后的桑枝切片放入炒锅中，添加麸皮和小米，混合均匀搅拌，文火炒制2小时，取出。中炒料至桑枝薄片表面显微黄色即可；将干燥后的桑枝进行低温烘干。
3.12各炮制品中五种成分的含量测定 精密称取桑枝各炮制品，分别按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定。各炮制品中桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的平均含量(mg·-1)及RSD值分别见图3和表7。
4讨论
4.1检测波长的选择 取桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的对照品溶液在波长200～800nm范围内扫描，发现桑皮苷A、绿原酸在326nm处有最大吸收，白藜芦醇苷、白藜芦醇在328nm处有最大吸收，桑辛素在269nm处有最大吸收故最终选择330nm为检测波长时，峰数较多，分离较好，信号响应强度适当。
4.2流动相的选择 分别考察了磷酸-甲醇和磷酸-乙睛流动相系统，发现后者柱压较低，梯度洗脱时，改变流动相的比例对基线影响较小，分离度较好。
表7各炮制品中五种成分的含量含量
表7(续)各炮制品中五种成分的含量含量
4.3供试品溶液制备的考察 以含量为指标，分别对提取溶剂水，50％、70％、80％、100％的甲醇进行了考察。结果发现，用80％甲醇提取最佳。
4.412个产地的桑枝样品相似度数值为0.691～0.991,5种成分定量结果含量均一稳定，表明建立的桑枝的HPLC特征谱图方法与含量测定方法具有良好的分析评价能力，有简便、稳定、准确等优势，可为评价桑枝药材的质量提供方法依据。该研究为进一步药效研究奠定了基础。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.一种从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别配制对照品溶液和供试品溶液；
（2）检测波长的选择：取桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的对照品溶液在波长200-800nm范围内扫描，发现桑皮苷A、绿原酸在326nm处有最大吸收，白藜芦醇苷、白藜芦醇在328nm处有最大吸收，桑辛素在269nm处有最大吸收，最终选择峰数较多，分离较好，信号响应强度适当的波长作为最佳检测波长；
（3）采用高效液相色谱方法，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Stamsil C18 (250mm×4.6mm i.d，5μm)，
流动相组成：流动相A为乙腈，流动相B为含0.1%磷酸的水溶液；
流速：0.8L/min，
检测波长330nm；
柱温：26℃；
进样量：20μL；
（4）建立标准曲线，求出桑枝生品中桑皮苷A、绿原酸、白藜芦醇苷、白藜芦醇和桑辛素的含量。
2.根据权利要求1所述的从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法如下：分别精密称取桑皮苷A对照品、绿原酸对照品、白藜芦醇苷对照品、白藜芦醇对照品和桑辛素对照品，加甲醇配成浓度分别为0.72、0.24、0.21、0.25和0.74mg/mL的混合对照品溶液，作为储备液。
3.根据权利要求1所述的从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：精密称取桑枝生品粉末1.0021g，置具塞锥形瓶中，加 25mL 80% 甲醇，超声处理（功率250kW，频率 40kHz）30 min过滤，滤渣用相同方法继续提取1次，过滤，合并提取液，蒸干；残渣用甲醇溶解，并定容置于4mL容量瓶中，摇匀，过0.45μm 微孔滤膜，滤液供HPLC分析。
4.根据权利要求1所述的从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，其特征在于，所述流动相按照梯度进行洗脱。
5.根据权利要求1所述的从炮制桑枝中同时提取并分别纯化5种化学成分的方法，其特征在于，所述最佳吸收波长为330nm。
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