CN110806457A - 四君甘露饮指纹图谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了四君甘露饮指纹图谱的检测方法，它包括步骤1、四君甘露饮供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，四君甘露饮指纹图谱仪器导出，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次四君甘露饮的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成四君甘露饮的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；将四君甘露饮指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认主要成分峰。本发明所提供的四君甘露饮指纹图谱，能全面，客观地表征四君甘露饮的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及四君甘露饮指纹图谱的检测方法。
背景技术
四君甘露饮是南京市名中医谢英彪教授几十年临床经验总结，在南京南医堂大力支持下开发出来了一种蕴含中医理论的调养茶饮。本产品主要由山药、茯苓、甘草、炒薏仁、橘皮、代代花等成分组成，临床试验具有补气、养胃、健脾、利湿的功效，主治脾胃气虚，面色萎黄，语声低微，气短乏力，食少便溏，舌淡苔白，脉虚弱。临床常用于治疗慢性胃肠炎，消化性溃疡等脾胃气虚的人群。
目前关于四君甘露饮的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立四君甘露饮的指纹图谱检测方法，为四君甘露饮的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种四君甘露饮的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价四君甘露饮的质量，对控制四君甘露饮的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，四君甘露饮供试品溶液的制备：
分别精密称取不同批次的四君甘露饮样品，置于圆底瓶中，加甲醇溶液，回流提取，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定异甘草苷、橙皮苷、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；
步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的四君甘露饮供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次四君甘露饮的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成四君甘露饮的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
步骤5，将步骤3中获得的四君甘露饮指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出四君甘露饮中2号峰为异甘草苷、3号峰为橙皮苷、6号峰为甘草苷。
作为优选方案，以上所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，步骤1四君甘露饮供试品溶液制备方法为：取8批次的四君甘露饮样品5g置100mL圆底瓶中，加甲醇溶液50mL，回流提取2h，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定异甘草苷、橙皮苷、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.0525mg/mL异甘草苷、0.1102mg/mL橙皮苷、0.1062mg/mL甘草苷组成的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，二极管阵列检测器，检测波长：230nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
作为优选方案，以上所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰8个。
指纹图谱检测条件的优化：
1、在样品溶液的制备优化方面
本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)、进行实验比较，结果发现回流提取所得的谱图差成分比较全面，分离度良好，故采用回流提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用甲醇进行提取。
2、在色谱条件进行优化方面
本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取230nm、254nm、280nm、284nm、300nm处的色谱图，发现检测波长为230nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选230nm为检测波长；
本发明对流速(1mL/min、0.8mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min)进行筛选，因四君甘露饮中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为1mL/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。
本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.05％磷酸水为流动相时，四君甘露饮中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.05％磷酸水为流动相。
在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0～5min乙腈体积5％～5％；5～25min乙腈体积5％～20％；25～50min乙腈体积20％～30％；50～80min乙腈体积30％～50％时可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。
本发明所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，四君甘露饮由山药25份、茯苓20份、甘草10份、炒薏仁25份、橘皮10份、代代花10份制成。
有益效果：
1、本发明根据四君甘露饮中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的四君甘露饮指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价四君甘露饮的质量，为保证临床四君甘露饮疗效具有重要意义。
2、用本发明所提供的方法所建立的四君甘露饮指纹图谱，能有效地表征四君甘露饮的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定四君甘露饮质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
3、本发明提供的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为本发明混合对照品的色谱图。
图2为本发明的四君甘露饮样品的对照指纹图谱。
图3为本发明四君甘露饮样品的8批次供试品指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例用到的仪器与试剂如下：
实验器材
1.1仪器
日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。
1.2药品与试剂
四君甘露饮样品来自南京南医堂健康产业发展有限公司；异甘草苷对照品(批号170711)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；橙皮苷对照品(批号161230)购自国家食品药品检定研究院；甘草苷对照品(批号151028)购自于南京森贝伽生物科技有限公司；甲醇(分析纯)；石油醚(分析纯)；乙醚(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)。
实施例1一种四君甘露饮指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，四君甘露饮供试品溶液的制备：
取8批次的四君甘露饮药材(山药25份、茯苓20份、甘草10份、炒薏仁25份、橘皮10份、代代花10份)5g置100mL圆底瓶中，加甲醇溶液50mL，回流提取2h，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定异甘草苷、橙皮苷、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.0525mg/mL异甘草苷、0.1102mg/mL橙皮苷、0.1062mg/mL甘草苷组成的混合对照品溶液。
步骤3，分别精密吸取8批四君甘露饮供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：230nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
步骤4，将步骤3中获得的8批四君甘露饮供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择8批次四君甘露饮的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次四君甘露饮的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品四君甘露饮中有8个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。异甘草苷保留时间为34.40min，橙皮苷保留时间为42.92min，甘草苷保留时间为53.74min。
步骤5，步骤3中获得的四君甘露饮指纹图谱和混合标准品图谱(图1)进行比对，指认主要成分，对比出四君甘露饮中2、3、6号色谱峰分别为：异甘草苷(保留时间34.40min)、橙皮苷(保留时间42.92min)、甘草苷(保留时间53.74min)。
同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算获得南医堂厂家的8批四君甘露饮中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的四君甘露饮中药建立的指纹图谱能够很好的检测南医堂及批次四君甘露饮的质量，结果如表1。
表1各批次样品与共有模式间的相似度
实施例2指纹图谱检测方法的方法学研究：
1、精密度研究
取四君甘露饮药材(山药25份、茯苓20份、甘草10份、炒薏仁25份、橘皮10份、代代花10份)按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，进样量为10μL，以异甘草苷、橙皮苷和甘草苷为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表2，结果表明该设备的平行进样精密性良好。
表2精密度研究峰面积和保留时间
2、稳定性研究
取四君甘露饮药材(山药25份、茯苓20份、甘草10份、炒薏仁25份、橘皮10份、代代花10份)按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，采用0、2、6、12、18、24小时不同时间进样分析，进样量为10μL，以异甘草苷、橙皮苷、甘草苷为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表3，表明四君甘露饮供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化，稳定性好。
表3稳定性研究峰面积和保留时间
3、重复性研究
平行精密称取编号为S1的四君甘露饮中药样品六份，按实施例1方法制备成6份同样的供试品溶液，参照实施例1的色谱条件，进样量为10μL，以异甘草苷、橙皮苷、甘草苷为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表4，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。
表4重复性研究峰面积和保留时间
以上实验结果表明，本发明提供的四君甘露饮指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价四君甘露饮的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，四君甘露饮供试品溶液的制备：
分别精密称取不同批次的四君甘露饮样品，置于圆底瓶中，加甲醇溶液，回流提取，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定异甘草苷、橙皮苷、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；
步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的四君甘露饮供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次四君甘露饮的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成四君甘露饮的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
步骤5，将步骤3中获得的四君甘露饮指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出四君甘露饮中2号峰为异甘草苷、3号峰为橙皮苷、6号峰为甘草苷。
2.根据权利要求1所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1四君甘露饮供试品溶液制备方法为：取8批次的四君甘露饮样品5g，置100mL锥形瓶中，置于圆底瓶中，加甲醇溶液50mL，回流提取，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定异甘草苷、橙皮苷、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成含0.0525mg/mL异甘草苷、0.1102mg/mL橙皮苷、0.1062mg/mL甘草苷组成的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：230nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
5.根据权利要求1所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰8个。
6.根据权利要求1所述的四君甘露饮指纹图谱的检测方法，其特征在于，四君甘露饮由山药25份、茯苓20份、甘草10份、炒薏仁25份、橘皮10份、代代花10份制成。
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