CN112748201B

CN112748201B - 葛根八宝茶指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN112748201B
Application number: CN202011576994.3A
Authority: CN
Inventors: 金俊杰; 李国维; 刘爱国; 胡玉凯; 段莉娟
Original assignee: Jiangsu Haisheng Pharmaceutical Co ltd; Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co ltd
Current assignee: Jiangsu Haisheng Pharmaceutical Co ltd; Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112748201A

Abstract

本发明公开了葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，它包括步骤1、葛根八宝茶供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，葛根八宝茶指纹图谱仪器导出，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次葛根八宝茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成葛根八宝茶的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；将葛根八宝茶指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认主要成分峰。本发明所提供的葛根八宝茶指纹图谱，能全面，客观地表征葛根八宝茶的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

葛根八宝茶指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药代用茶的检测方法，具体涉及葛根八宝茶指纹图谱的检测方法。

背景技术

如今，人们生活节奏快，工作压力大，加班、应酬、熬夜是家常便饭，不良的生活方式使我们的身体承受着巨大的负荷。肝脏是我们身体中最忍辱负重的器官，情绪上的压力、抑郁、过劳、发怒，伤害的都是肝。肝是人体新陈代谢的“化工厂”，吃进去的有毒物质、有损肝脏的药物、体内产生的毒物、废物等都必须依靠肝脏来解毒，因为肝脏没有痛感神经，所以它出了问题并没有什么明显症状，这也是人们经常忽略它健康状况的原因。经常出现无端疲倦、眼睛干涩、失眠多梦、口干口苦、记忆力下降等小毛病，很有可能就是肝脏的健康预警，就该防患于未然，葛根八宝茶将药食同源药材的独特口感和食疗功能浓缩于茶包之中。

从中医的角度，葛根八宝茶以利尿和清热为目的，采取的方法则为去水和发汗，以清热泻火药材为主，辅以化湿、行气消积药物配伍来解酒护肝养肝。枳椇子和葛根对饮酒积热，毒伤脾胃，见胃痛、发热、烦渴、小便短赤者，有显著的解酒、清热、利尿等功效；栀子和菊花能疏散风热，平肝明目，清热解毒；橘皮和山楂能健脾、化湿、消暑，有温中行气，消食之功；以枸杞扶阴固本、补精益气和决明子的清肝明目来滋补养护肝肾。日常饮用可以清热泻火，清肝毒，降火气，补肝益肾，消肿利尿，养肝明目；饮酒后可缓解头痛、头昏、烦渴，保护肠胃，减少乙醇的摄取，发汗利尿，加速乙醇的排出。

目前关于葛根八宝茶的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立葛根八宝茶的指纹图谱检测方法，为葛根八宝茶的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种葛根八宝茶的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价葛根八宝茶的质量，对控制葛根八宝茶的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，葛根八宝茶供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的葛根八宝茶样品，打粉，置于圆底瓶中，加甲醇溶液，回流提取，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

精密称定葛根素、芦丁对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；

步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的葛根八宝茶供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次葛根八宝茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成葛根八宝茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

步骤5，将步骤3中获得的葛根八宝茶指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出葛根八宝茶中1号峰为葛根素、4号峰为芦丁。

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，步骤1葛根八宝茶供试品溶液制备方法为：取8批次的葛根八宝茶样品粉末55g，置圆底瓶中，加甲醇溶液500mL，超声提取30min，过滤，滤液置于容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定葛根素、芦丁对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1008mg/mL葛根素、0.1115mg/mL芦丁组成的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：225nm，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

程序	时间（min）	乙腈体积（%）
			1	0	5
2	30	20
			3	70	30
4	100	45
			5	115	100

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰15个。

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，葛根八宝茶的药味组成为：枳椇子、葛根、栀子、菊花、决明子、枸杞子、橘皮、山楂。

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，葛根八宝茶的药味组成和配比为：枳椇子10 ~30份、葛根10~30份、栀子5~15份、菊花4~12份、决明子5~15份、枸杞子5~15份、橘皮6~18份、山楂10~30份。

作为优选方案，以上所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，葛根八宝茶的药味组成和配比为：枳椇子10份、葛根10份、栀子5份、菊花4份、决明子5份、枸杞子5份、橘皮6份、山楂10份。

指纹图谱检测条件的优化：

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法（超声、回流、渗漉等）及不同提取溶剂（甲醇、水、70%乙醇水溶液、85%乙醇水溶液、95%乙醇、无水乙醇）进行实验比较，结果发现超声提取所得的谱图差成分比较全面，提取效率高，分离度良好，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用甲醇进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取205nm、225nm、254nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为225nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选225nm为检测波长；

本发明对流速（1mL/min、0.9mL/min、0.8mL/min、0.6mL/min）进行筛选，因葛根八宝茶中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，高流速下无法将其分开，在低流速下分离效果较好，最终选择在流速为0.8mL/min梯度条件下将极性相似的物质分开。

本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，乙腈和0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1%磷酸水为流动相时，葛根八宝茶中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.1%磷酸水为流动相。

在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0~30min 乙腈体积5%~20%；30~70min 乙腈体积20%~30%；70~100min 乙腈体积30%~45%；100~115min 乙腈体积45%~100%时可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。

有益效果：

1、本发明根据葛根八宝茶中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的葛根八宝茶指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价葛根八宝茶的质量，为保证临床葛根八宝茶疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的葛根八宝茶指纹图谱，能有效地表征葛根八宝茶的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定葛根八宝茶质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明混合对照品的色谱图。

图2为本发明的葛根八宝茶样品的对照指纹图谱。

图3为本发明葛根八宝茶样品的8批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司全波段扫描（200-800nm）高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BP121S电子分析天平（SARTORIUS）。

1.2药品与试剂

葛根八宝茶样品来自江苏海昇药业有限公司；葛根素对照品（批号3681-99-0）购自中国食品药品检定研究所；芦丁对照品（批号100080-200707）购自中国药品生物制品检定所；甲醇（分析纯）；磷酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）。

实施例1 一种葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，葛根八宝茶供试品溶液的制备：

取8批次的葛根八宝茶样品55g（枳椇子10g、葛根10g、栀子5g、菊花4g、决明子5g、枸杞子5g、橘皮6g、山楂10g）打粉后置圆底瓶中，加甲醇溶液500mL，超声提取30min，过滤，滤液置于容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得8批次的葛根八宝茶供试品溶液；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

取精密称定葛根素、芦丁对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1008mg/mL葛根素、0.1115mg/mL芦丁组成的混合对照品溶液。

步骤3，分别精密吸取8批葛根八宝茶供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：225nm，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

步骤4，将步骤3中获得的8批葛根八宝茶供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择8批次葛根八宝茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次葛根八宝茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品葛根八宝茶中有15个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。葛根素保留时间为24.494min，芦丁保留时间为33.7min。

步骤5，步骤3中获得的葛根八宝茶指纹图谱和混合标准品图谱（图1）进行比对，指认主要成分，对比出葛根八宝茶中1、4号色谱峰分别为：葛根素（保留时间24.494min）、芦丁（保留时间33.7min）。

同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算获得江苏海昇药业厂家的8批葛根八宝茶中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的葛根八宝茶中药建立的指纹图谱能够很好的检测江苏海昇药业多批次葛根八宝茶的质量，结果如表1。

表1各批次样品与共有模式间的相似度

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	R
										S1	1	0.805	0.9896	0.935	0.916	0.927	0.937	0.929	0.944
S2	0.905	1	0.899	0.975	0.949	0.963	0.92	0.964	0.941
										S3	0.896	0.899	1	0.954	0.97	0.904	0.927	0.911	0.952
S4	0.935	0.975	0.954	1	0.925	0.905	0.948	0.922	0.905
										S5	0.916	0.949	0.97	0.925	1	0.892	0.919	0.913	0.967
S6	0.927	0.963	0.904	0.905	0.892	1	0.922	0.949	0.958
										S7	0.937	0.92	0.927	0.948	0.919	0.922	1	0.919	0.915
S8	0.929	0.964	0.911	0.922	0.913	0.949	0.919	1	0.922
										R	0.944	0.941	0.952	0.905	0.967	0.958	0.915	0.922	1

实施例2指纹图谱检测的方法学研究：

1、方法学考察

1.1精密度考察

取葛根八宝茶样品55g（枳椇子10g、葛根10g、栀子5g、菊花4g、决明子5g、枸杞子5g、橘皮6g、山楂10g），按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中15个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.5%，共有峰峰面积RSD均小于1.8%，说明仪器精密度较好。

1.2稳定性考察

取葛根八宝茶样品5g，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录色谱图，对色谱图中15个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.3%，共有峰峰面积RSD均小于2.6%，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。

1.3重复性考察

取葛根八宝茶样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中15个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.2%，共有峰峰面积RSD均小于2.2%，说明该方法重复性良好。

以上实验结果表明，本发明提供的葛根八宝茶指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价葛根八宝茶的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，葛根八宝茶供试品溶液的制备：

分别精密称取不同批次的葛根八宝茶样品，打粉后置于圆底瓶中，加甲醇溶液，超声提取，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2，混合对照品溶液的制备：

步骤4，将步骤3中获得的葛根八宝茶供试品溶液的色谱图导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次葛根八宝茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成葛根八宝茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；

步骤5，将步骤3中获得的葛根八宝茶供试品溶液的色谱图和混合标准品图谱进行比对，指认出葛根八宝茶中1号峰为葛根素、4号峰为芦丁;

液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：225nm，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下：

程序时间/min 乙腈体积/% 1 0 5 2 30 20 3 70 30 4 100 45 5 115 100

所述的葛根八宝茶的药味组成和配比为：枳椇子10 ~30份、葛根10~30份、栀子5~15份、菊花4~12份、决明子5~15份、枸杞子5~15份、橘皮6~18份、山楂10~30份。

2.根据权利要求1所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1葛根八宝茶供试品溶液制备方法为：取8批次的葛根八宝茶样品5g，打粉，置圆底烧瓶中，超声提取，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：精密称定葛根素、芦丁对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1008mg/mL葛根素、0.1115mg/mL芦丁组成的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有15个峰，其保留时间分别为1号峰24.494min、2号峰25.139min、3号峰30.615min、4号峰33.7min、5号峰45.878min、6号峰48.071min、7号峰50.37min、8号峰55.495min、9号峰64.248min、10号峰79.849min、11号峰100.583min、12号峰101.654min、13号峰108.245min、14号峰109.459min、15号峰110.588min，其中1号峰为葛根素、4号峰为芦丁。

5.根据权利要求1所述的葛根八宝茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，葛根八宝茶的药味组成和配比为：枳椇子10份、葛根10份、栀子5份、菊花4份、决明子5份、枸杞子5份、橘皮6份、山楂10份。