CN116026975A

CN116026975A - 一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法

Info

Publication number: CN116026975A
Application number: CN202310194449.5A
Authority: CN
Inventors: 张宁; 杨海军; 刘美辉; 曾庆琪
Original assignee: Jiangsu Health Vocational College
Current assignee: Jiangsu Health Vocational College
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明公开了一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，它包括步骤1、利喉开音供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，利喉开音指纹图谱仪器导出，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次利喉开音的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成利喉开音的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；将利喉开音指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认主要成分峰。本发明所提供的利喉开音指纹图谱，能全面，客观地表征利喉开音的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于中药组合物技术领域，具体地说，涉及一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法。

背景技术

利喉开音颗粒是一种蕴含中医理论的调养茶饮。本产品主要由罗汉果、桑葚、决明子、桃仁、甘草等成分组成，具有清热润肺，利喉开音，活血祛瘀，滑肠通便的功效，主治肺热燥咳，咽痛失音，咳嗽气喘，肠燥便秘。临床常用于经常咳嗽或频繁讲课的人群，以辛苦教学的一线教师群体为佳。

目前关于利喉开音的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，为利喉开音的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，开发一种关于具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以控制利喉开音的质量稳定，确保其安全性与有效性，并完善相关制药工艺的优化。

技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1、利喉开音供试品溶液的制备：

取适量利喉开音中药材，打粉，过筛，称取粉末置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声提取，放冷过滤，取滤液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；

步骤2、利喉开音对照品溶液的制备：

分别取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚的对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、绿芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚的混合对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取步骤1的利喉开音供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的利喉开音供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择不同批次利喉开音的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成利喉开音的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1、利喉开音供试品溶液的制备方法为：

取适量利喉开音中药材，打粉，过60目筛，精密称定粉末5g，加入甲醇150ml，超声提取30min，放冷过滤，取滤液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，

步骤2、混合对照品溶液的制备：

分别取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1200μg/ml、818μg/ml、909μg/ml、2000μg/ml、368μg/ml、262μg/ml、104μg/ml、1000μg/ml的对照品储备液；分别精密吸取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚的对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含异绿原酸A 120μg、异绿原酸B 81.8μg、异绿原酸C 90.9μg、芦丁100μg、木犀草苷36.8μg、决明子苷26.2μg、橙黄决明素10.4μg和大黄酚100μg的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤3、高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml·min^-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm；

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml·min^-1，柱温30℃，检测波长254nm。

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，梯度洗脱优选如下表：

时间/min	流动相A体积百分比	流动相B体积百分比
			0	95	5
5	90	10
			80	65	35
100	30	70
			130	15	85
135	0	100

。

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，色谱柱为色谱柱为YMC-Pack ODS-A，4.6*250mm，5μm。

作为优选方案，以上所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，得到的利喉开音指纹图谱中有14个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为18.544min；共有峰2，保留时间为19.985min；共有峰3，保留时间为34.306min；共有峰4，保留时间为36.032min；共有峰5，保留时间为38.588min，共有峰6，保留时间为40.016min，共有峰7，保留时间为42.092min，共有峰8，保留时间为44.819min，共有峰9，保留时间为47.132min，共有峰10，保留时间为61.888min，共有峰11，保留时间为84.280min，共有峰12，保留时间为87.187min，共有峰13，保留时间为104.220min，共有峰14，保留时间为123.474min。

其中，3号峰为芦丁，4号峰为木犀草苷，6号峰为异绿原酸B，7号峰为异绿原酸A，8号峰为异绿原酸C，9号峰为决明子苷，11号峰为橙黄决明素，13号峰为大黄酚。

本发明所述的具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，利喉开音由罗汉果、桑葚、决明子、桃仁和甘草组成。

作为优选方案，以上所述的具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，利喉开音各原料的具体用量为罗汉果4份、桑葚5份、决明子5份、桃仁6份、甘草6份。

本发明提供的中药组合物，其中罗汉果具有清肺利咽、止咳、润肠通便的功效。在临床应用于痰热咳嗽、血燥便秘、百日咳、痰火热盛引起的呼吸道刺激咳嗽症状，都有良好的治疗作用。当患有糖尿病的患者，经常食用罗汉果，有明显的伤津消渴以及滋阴去虚热的作用，所以对于糖尿病患者有良好的调理。另外，含有丰富的维生素，具有清除自由基的功效，能够促进身体的美容养颜。

桑葚具有滋阴补血；生津润燥，用于肝肾不足和血虚精亏的头晕目眩；腰酸耳鸣；津伤口渴；消渴等症。

决明子清热泻火、明目、润肠通便、降压、降血脂功效。

桃仁具有活血祛瘀、润肠通便、止咳平喘的作用

甘草可以和中缓急、润肺、解毒、调和药性。

本发明中药组合物配伍具有清热润肺，利喉开音，活血祛瘀，滑肠通便的功效，主治肺热燥咳，咽痛失音，咳嗽气喘，肠燥便秘。

实验方法与指纹图谱检测条件的优化实验：

(1)不同流动相的选择：

本发明通过大量实验筛选了纯水-乙腈、纯水-甲醇、0.1％磷酸水-乙腈、0.1％磷酸水-甲醇等流动相系统进行检测，检测结果显示选择含0.1％体积磷酸水和乙腈作为流动相，系统基线平稳、峰形、各峰分离度情况最好。故选择以含0.1％体积磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B为最佳流动相；在确定流动相基础上，为了达到更好的分离度，本发明筛选了梯度洗脱方式，实验结果表明，不同的梯度洗脱方式，对各化合物的分离度影响大，本发明通过调整不同时间段的分离度和色谱峰数目，优选得到最佳的梯度洗脱方式为：流动相B的比例变化为：0～5min，5％～10％乙腈；5～80min，10％～35％乙腈；80～100min，35％～70％乙腈，100～130min，70％～85％乙腈，130～135min，85％～100％乙腈。

(2)不同检测波长的选择：

本发明通过大量实验筛选了不同波长230nm、254nm、284nm、334nm下色谱检测结果，检测结果显示在254nm下各特征峰强度较好，故选择254nm作为检测波长，如图1所示。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所建立的利喉开音指纹图谱，能有效地表征利喉开音的质量，有利于全面监控利喉开音的质量。

(2)本发明所建立的指纹图谱，可注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定利喉开音质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

(3)本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

附图说明

图1为利喉开音供试品在254nm下的色谱图。

图2为对照品溶液在254nm下的色谱图。

图3为10批利喉开音供试品溶液匹配的指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例所用仪器

日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A；ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司，精确到十万分之一)；BSM220.4分析天平(上海卓精公司，精确到万分之一)；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

以下实例所用试药如下：

芦丁分析标准品(批号100080-200306，纯度98.7％)购自中国食品药品检定研究所、木犀草苷分析标准品(批号111720-201609，纯度98％)购自中国食品药品检定研究所、异绿原酸A分析标准品(批号161208，纯度98％)购自南京森贝伽生物科技有限公司、异绿原酸B分析标准品(批号161121，纯度98％)购自南京森贝伽生物科技有限公司、异绿原酸C分析标准品(批号1601102，纯度98％)购自南京森贝伽生物科技有限公司、决明子苷分析标准品购自南京森贝伽生物科技有限公司、橙黄决明素分析标准品(批号111900-201605，纯度98％)购自中国食品药品检定研究所、大黄酚分析标准品(批号110796-201621，纯度98％)购自中国食品药品检定研究所。乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。其它试剂(分析纯)。

实施例1

一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

10批利喉开音中药组合物(罗汉果4g、桑葚5g、决明子5g、桃仁6g、甘草6g)分别取适量打粉，过60目筛，精密称定粉末5g，加入甲醇150ml，超声提取30min，放冷过滤，取滤液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液，

(2)对照品溶液的制备：

(3)分别精密吸取步骤1的10批利喉开音供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

(4)将步骤3中获得的10批利喉开音供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择10批次利喉开音的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成利喉开音的对照指纹图谱，如图3所示，相似度评价结果见表2。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图(图2所示，芦丁保留时间为34.306min；木犀草苷保留时间为36.032min；异绿原酸B保留时间为40.016min，异绿原酸A保留时间为42.092min，异绿原酸C保留时间为44.819min，决明子苷保留时间为41.132min，橙黄决明素保留时间为84.280min，大黄酚保留时间为104.220min)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

以上步骤(3)的色谱条件及系统适用性为：

色谱柱：YMC-Pack ODS-A，4.6*250mm，5μm。

流动相：A相：0.1体积％磷酸水；B相：乙腈；检测波长：254nm，流速：1.0ml·min^-1，柱温：30℃；梯度洗脱程序如下表1：

表1梯度洗脱程序

表2 10批利喉开音供试品溶液相似度评价结果

得到的利喉开音指纹图谱中有14个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为18.544min；共有峰2，保留时间为19.985min；共有峰3，保留时间为34.306min；共有峰4，保留时间为36.032min；共有峰5，保留时间为38.588min，共有峰6，保留时间为40.016min，共有峰7，保留时间为42.092min，共有峰8，保留时间为44.819min，共有峰9，保留时间为47.132min，共有峰10，保留时间为61.888min，共有峰11，保留时间为84.280min，共有峰12，保留时间为87.187min，共有峰13，保留时间为104.220min，共有峰14，保留时间为123.474min。

实施例2指纹图谱检测的方法学研究

1、方法学考察

1.1精密度考察

取利喉开音样品1批，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量20μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中共有峰1～14进行考察，结果表明，共有峰1～14的保留时间RSD均小于1.82％，共有峰1～14峰面积RSD均小于2.78％，说明仪器精密度较好。

1.2稳定性考察

取利喉开音样品1批，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，4，8，12，16，24h进样，记录色谱图，对色谱图中共有峰1～14进行考察，结果表明，共有峰1～14的保留时间RSD均小于1.98％，共有峰1～14峰面积RSD均小于2.95％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。

1.3重复性考察

利喉开音样品1批分别取6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中共有峰1～14进行考察，结果表明，共有峰1～14的保留时间RSD均小于1.78％，共有峰1～14峰面积RSD均小于2.85％，说明该方法重复性良好。

由以上实验结果表明，本发明建立的利喉开音指纹图谱检测方法，精密度、稳定性和重复性好，能有效地表征利喉开音的质量，有利于全面监控其质量。

Claims

1.一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、利喉开音供试品溶液的制备：

取适量利喉开音中药材，打粉，过筛，称取粉末置于玻璃瓶中，加入甲醇，超声提取，放冷过滤，取滤液，用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；

步骤2、利喉开音对照品溶液的制备：

分别取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚的对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚的混合对照品溶液；

2.根据权利要求1所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，

步骤1、利喉开音供试品溶液的制备方法为：

取适量利喉开音打粉，过60目筛，精密称定粉末5g，加入甲醇150ml，超声提取30min，放冷过滤，取滤液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，

步骤2、混合对照品溶液的制备：

分别取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1200μg/ml、818μg/ml、909μg/ml、2000μg/ml、368μg/ml、262μg/ml、104μg/ml、1000μg/ml的对照品储备液；分别精密吸取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、决明子苷、橙黄决明素和大黄酚的对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含异绿原酸A 120μg、异绿原酸B81.8μg、异绿原酸C 90.9μg、芦丁100μg、木犀草苷36.8μg、决明子苷26.2μg、橙黄决明素10.4μg和大黄酚100μg的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，

步骤3、高效液相色谱仪检测的色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1～0.5％磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml·min^-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm。

5.根据权利要求4所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，

步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml·min^-1，柱温30℃，检测波长254nm；梯度洗脱程序为：

。

6.根据权利要求5所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，4.6*250mm，5μm。

7.根据权利要求1所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，得到的利喉开音指纹图谱中有14个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为18.544min；共有峰2，保留时间为19.985min；共有峰3，保留时间为34.306min；共有峰4，保留时间为36.032min；共有峰5，保留时间为38.588min，共有峰6，保留时间为40.016min，共有峰7，保留时间为42.092min，共有峰8，保留时间为44.819min，共有峰9，保留时间为47.132min，共有峰10，保留时间为61.888min，共有峰11，保留时间为84.280min，共有峰12，保留时间为87.187min，共有峰13，保留时间为104.220min，共有峰14，保留时间为123.474min。

8.根据权利要求7所述的一种具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中3号峰为芦丁，4号峰为木犀草苷，6号峰为异绿原酸B，7号峰为异绿原酸A，8号峰为异绿原酸C，9号峰为决明子苷，11号峰为橙黄决明素，13号峰为大黄酚。

9.根据权利要求1所述的具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，利喉开音由罗汉果、桑葚、决明子、桃仁和甘草组成。

10.根据权利要求9所述的具有利喉开音功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，利喉开音各原料的具体用量为罗汉果4份、桑葚5份、决明子5份、桃仁6份、甘草6份。