CN110007031B - 甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法 - Google Patents
甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了甘草汁炙女贞子指纹图谱的检测方法,该方法包括以下步骤:步骤1、甘草汁炙女贞子供试品溶液的制备;步骤2、混合对照品溶液的制备;步骤3、分别精密吸取定量供试品与对照品溶液注入液相色谱图仪,记录色谱图;步骤4、将甘草汁炙女贞子指纹图谱仪器导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统,选择不同批次甘草汁炙女贞子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰,用平均值计算法生成甘草汁炙女贞子的对照指纹图谱,计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所研究的甘草汁炙女贞子指纹图谱,能全面、客观地评价甘草汁炙女贞子的质量。本发明提供的检测方法具有方法简单、准确度高、重复性好、精密度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域,具体地说,涉及一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法及其指纹图谱。
背景技术
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。有滋补肝肾,明目乌发之功效。用于肝肾阴虚,眩晕耳鸣,腰膝酸软,须发早白,目暗不明,内热消渴,骨蒸潮热。甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。性味甘、平,有补脾益气,缓急止痛,调和诸药的功效。药物经甘草汁炙后可以缓和药性,调和诸药,协同增强中药的补益作用。女贞子的炮制始于宋代,在临床实践中不断发展出各种辅料制法。现代对女贞子的炮制方法主要有去梗叶、洗净、酒蒸、酒炖、盐炙、醋蒸等,关于甘草汁炙女贞子及其炮制作用,历代文献记载较少。
目前相关药品标准中,女贞子饮片炮制规格有女贞子和酒女贞子,但具体的工艺条件与质量标准无明确规定,缺乏客观的工艺参数。甘草汁炮制后的女贞子,其内部化学成分具有一定的变化,采用高效液相色谱法对甘草汁炙女贞子进行指纹图谱研究,该方法简便可靠,对于控制甘草汁炙女贞子质量标准与工艺规范具有重大意义。
发明内容
发明目的:本发明的目的是克服现有技术的不足,开发一种关于甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,通过本发明的方法可以控制甘草汁炙女贞子的质量稳定,确保其安全性与有效性,并可以本发明建立的指纹图谱为依据,完善相关炮制方法的工艺优化。
技术方案:为实现以上目的,本发明采用的技术方案为:
1、一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、甘草汁炙女贞子供试品溶液的制备:
取适量生甘草,浸泡后煎煮,取煎煮液,浓缩,得甘草汁待用,称取适量女贞子饮片,用甘草汁闷润后炒制得甘草汁炙女贞子样品;取甘草汁炙女贞子打粉,称取粉末置于具塞锥形瓶中,加入甲醇,称重,超声处理后补足失重,离心后取上清液,用0.45μm有机微孔滤膜滤过,取续滤液,即得待测供试品溶液;
步骤2、甘草汁炙女贞子对照品溶液的制备:
分别取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品适量,精密称定,分别置于容量瓶中,加甲醇分别配成特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵的对照品储备液;然后分别精密吸取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵的对照品溶液适量,加甲醇定容至20ml,制成特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵的混合对照品溶液;
步骤3、分别精密吸取步骤1的甘草汁炙女贞子供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图;
步骤4,将步骤3中获得的甘草汁炙女贞子供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A;选择不同批次的甘草汁炙的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰;用平均值计算法生成甘草汁炙女贞子的对照指纹图谱,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积;并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,
步骤1、甘草汁炙女贞子供试品溶液的制备方法为:
取甘草待用,用水浸泡1h,煎煮2次,每次30min,滤过,合并滤液并浓缩得甘草汁待用。取生女贞子饮片待用,取适量甘草汁闷润3h,120℃下炒制8min得甘草汁炙女贞子样品待用。打粉,精密称取过4号筛(65目)的粉末1.0g,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,称定质量,超声提取30min,室温放置,再称定质量,用甲醇补足失重,12000r/min离心3min,取上清液,过0.45μm有机微孔滤膜,即得甘草汁炙女贞子供试品溶液。
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,步骤2、混合对照品溶液的制备方法为:
分别取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品适量,精密称定,置于10ml容量瓶中,加甲醇配成浓度分别为290μg/ml、312μg/ml、288μg/ml的特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品储备液;分别精密特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品溶液适量,加甲醇定容至20ml,制成每1ml含特女贞苷14.5μg、甘草苷15.6μg、甘草酸铵14.4μg的混合对照品溶。
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,步骤3、高效液相色谱仪检测的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.2%磷酸水作为流动相A,以乙腈为流动相B,梯度洗脱,流速为0.5~1.5ml·min-1,柱温25~40℃,检测波长200~360nm;
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.2%磷酸水作为流动相A,以乙腈为流动相B,梯度洗脱,流速为0.8ml·min-1,柱温30℃,检测波长254nm。
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,梯度洗脱优选如下表:
时间/min | 流动相A体积百分比 | 流动相B体积百分比 |
0 | 95 | 5 |
20 | 90 | 10 |
40 | 83 | 17 |
55 | 75 | 25 |
95 | 65 | 35 |
105 | 0 | 100 |
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,色谱柱为色谱柱为Purospher STAR LP RP-18endcapped,4.6*250mm,5μm。
作为优选方案,以上所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,得得到的甘草汁蒸女贞子指纹图谱中有6个共有峰,各共有峰的保留时间分别为:共有峰1,保留时间为52.914min;共有峰2,保留时间为57.919min;共有峰3,保留时间为71.147min;共有峰4,保留时间为76.014min;共有峰5,保留时间为81.031min;共有峰6,保留时间为103.046min。
其中,1号峰为甘草苷,2号峰为特女贞苷,6号峰为甘草酸铵。
实验方法与指纹图谱检测条件的优化实验:
(1)不同流动相的选择:
本发明通过大量实验筛选了纯水-乙腈、纯水-甲醇、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%磷酸水-乙腈、0.2%磷酸水-乙腈和0.2%磷酸水-甲醇等流动相系统进行检测,检测结果显示选择含0.2%体积磷酸的水和乙腈作为流动相,系统基线平稳、峰形、各峰分离度情况最好。故选择以含0.2%磷酸体积的水作为流动相A,以乙腈为流动相B为最佳流动相;在确定流动相基础上,为了达到更好的分离度,本发明筛选了梯度洗脱方式,实验结果表明,不同的梯度洗脱方式,对各化合物的分离度影响大,本发明通过调整不同时间段的分离度和色谱峰数目,优选得到最佳的梯度洗脱方式为:流动相B的比例变化为:0~20min,5%~10%乙腈;20~40min,10%~17%乙腈;40~55min,17%~25%乙腈;55~95min,25%~35%乙腈;95~105min,35%~100%乙腈。
(2)不同检测波长的选择:
本发明通过大量实验筛选了不同波长230nm、254nm、280nm下色谱检测结果,检测结果显示在254nm下各特征峰强度较好,故选择254nm作为检测波长,如图1所示。
(3)不同炒制时间的选择:
本发明通过大量实验筛选了炮制过程中不同炒制时间得影响,分别在120℃条件下炒制8min、10min、12min、15min,通过实验结果可知,炒制时间过长,饮片易炒焦炒黑,有效成分结构被破坏,故选择炒制时间为8min。
本发明的有益效果是:
1、本发明根据法半夏中所含的活性成分的结构性之特点,通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件,经多次实验验证表明,本发明提供的法半夏指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价法半夏的质量,为保证其临床疗效具有重要意义。
2、本发明所建立的甘草汁炙女贞子指纹图谱,能有效地表征甘草汁炙女贞子的质量,有利于全面监控药物的质量。
3、本发明所建立的甘草汁炙女贞子指纹图谱的实验方法,优化了药汁制女贞子的炮制工艺。
4、本发明所建立的指纹图谱,可注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系,注重整体面貌特征,既可避免因测定个别化学成分而判定甘草汁炙女贞子质量的片面性,又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
5、本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。
附图说明
图1为甘草汁炙女贞子供试品在254nm下的色谱图。
图2为对照品溶液在254nm下的色谱图。
图3为10批甘草汁炙女贞子供试品溶液匹配的指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
以下实施例所用仪器
日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统,包括在线脱气机,自动进样器Prominence SIL-20A,二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A;ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司,精确到十万分之一);BSM220.4分析天平(上海卓精公司,精确到万分之一);GVS型超声波清洗器(深圳市够威科技有限公司);TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
以下实例所用试药如下:特女贞苷分析标准品(批号5937,纯度99.5%)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。甘草苷(批号111610-200604)、甘草酸铵(批号110731-201619)对照品均购自中国食品药品检定研究所。乙腈为色谱纯,水为超纯水,磷酸为分析纯。女贞子(南京海源中药饮片有限公司,批号181202、181102、181002、180902、180802、180702、180602、180504、180402、180302),甘草(南京海源中药饮片有限公司,批号180608),其它试剂均为分析纯。
实施例1
一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其包括以下步骤:
(1)供试品溶液的制备:
取批号为180608的甘草60g,用水浸泡1h,煎煮2次,每次30min,滤过,合并滤液浓缩至300g甘草汁。取10批女贞子(南京海源中药饮片有限公司,批号181202、181102、181002、180902、180802、180702、180602、180504、180402、180302)待用,分别取上述10批女贞子各50g加入上述15ml甘草汁闷润3h,然后分别在120℃下炒制8min得10批甘草汁炙女贞子样品待用。分别取上述炮制后的10批甘草汁炙女贞子打粉,精密称取过4号筛(65目)的粉末1.0g,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,称定质量,超声提取30min,室温放置,再称定质量,用甲醇补足失重,12000r/min离心3min,取上清液,过0.45μm有机微孔滤膜,即得10批甘草汁炙女贞子供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备:
分别取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品适量,精密称定,置于10ml容量瓶中,加甲醇配成浓度分别为290μg/ml、312μg/ml、288μg/ml的对照品储备液;分别精密取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品溶液适量,加甲醇定容至20ml,制成每1ml含特女贞苷14.5μg、甘草苷15.6μg和甘草酸铵14.4μg的混合对照品溶液。
(3)分别精密吸取步骤1的10批甘草汁炙女贞子供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图;
(4)将步骤3中获得的10批甘草汁炙女贞子供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A;选择10批次甘草汁炙女贞子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰;用平均值计算法生成甘草汁炙女贞子的对照指纹图谱,如图3所示,相似度评价结果见表2。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积;并根据混合对照品溶液色谱图(图2所示,甘草苷保留时间为52.914min;特女贞苷保留时间为57.919min;甘草酸铵,保留时间为103.046min)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
上述步骤(3)色谱条件及系统适用性
色谱柱:Purospher STAR LP RP-18endcapped,4.6*250mm,5μm。
流动相:A相:0.2体积%磷酸水;B相:乙腈;检测波长:254nm,流速:0.8ml·min-1,柱温:30℃;梯度洗脱程序如下表1:
表1梯度洗脱程序
时间/min | 流动相A体积百分比 | 流动相B体积百分比 |
0 | 95 | 5 |
20 | 90 | 10 |
40 | 83 | 17 |
55 | 75 | 25 |
95 | 65 | 35 |
105 | 0 | 100 |
表2 10批甘草汁炙女贞子供试品溶液相似度评价结果
得到的甘草汁炙女贞子指纹图谱中有6个共有峰,各共有峰的保留时间分别为:共有峰1,保留时间为52.914min;共有峰2,保留时间为57.919min;共有峰3,保留时间为71.147min;共有峰4,保留时间为76.014min;共有峰5,保留时间为81.031min;共有峰6,保留时间为103.046min。
其中,1号峰为甘草苷,2号峰为特女贞苷,6号峰为甘草酸铵。
实施例2指纹图谱检测的方法学研究:
1、方法学考察
1.1精密度考察
取批号为181202的甘草汁炙女贞子样品,按照上述实施例1的供试品制备方法,制备得到供试品溶液,连续进样6次,每次进样量10μL,按上述实施例1色谱条件检测,测定其HPLC色谱图,对色谱图中6个共有指纹峰进行考察,结果表明,共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.9%,共有峰峰面积RSD均小于1.7%,说明仪器精密度较好。
1.2稳定性考察
取批号为181202的甘草汁炙女贞子饮片样品,按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液,按上述实施例1中的色谱条件分别于0,2,4,8,12和24h进样,记录色谱图,对色谱图中6个共有指纹峰进行考察,结果表明,共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.3%,共有峰峰面积RSD均小于2.1%,说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
1.3重复性考察
取批号为181202的甘草汁炙女贞子样品6份,按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液,分别测定,记录色谱图,对色谱图中6个共有指纹峰进行考察,结果表明,共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.6%,共有峰峰面积RSD均小于2.3%,说明该方法重复性良好。
由以上实验结果表明,本发明建立的甘草汁炙女贞子指纹图谱检测方法,精密度、稳定性和重复性好,能有效地表征甘草汁炙女贞子的质量,有利于全面监控其质量。
Claims (6)
1.一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、甘草汁炙女贞子供试品溶液的制备:
取适量生甘草,浸泡后煎煮,取煎煮液,浓缩,得甘草汁待用,称取适量女贞子饮片,用甘草汁闷润后炒制得甘草汁炙女贞子样品;取甘草汁炙女贞子打粉,称取粉末置于具塞锥形瓶中,加入甲醇,称重,超声处理后补足失重,离心后取上清液,用0.45μm有机微孔滤膜滤过,取续滤液,即得待测供试品溶液;
步骤2、甘草汁炙女贞子对照品溶液的制备:
分别取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品适量,精密称定,分别置于容量瓶中,加甲醇分别配成特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵的对照品储备液;然后分别精密吸取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵的对照品溶液适量,加甲醇定容至20ml,制成特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵的混合对照品溶液;
步骤3、分别精密吸取步骤1的甘草汁炙女贞子供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图;
所述的高效液相色谱仪检测的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.2%磷酸水作为流动相A,以乙腈为流动相B,梯度洗脱,流速为0.8ml·min-1,柱温30℃,检测波长254nm;
所述的梯度洗脱如下表:
步骤4,将步骤3中获得的甘草汁炙女贞子供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A;选择不同批次的甘草汁炙女贞子 的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰;用平均值计算法生成甘草汁炙女贞子的对照指纹图谱,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积;并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
2.根据权利要求1所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,
步骤1、甘草汁炙女贞子供试品溶液的制备方法为:
取甘草待用,用水浸泡1h,煎煮2次,每次30min,滤过,合并滤液,浓缩得甘草汁待用;
取生女贞子饮片待用,取适量甘草汁闷润3h,120℃下炒制8min得甘草汁炙女贞子样品待用;取甘草汁炙女贞子打粉,精密称取过4号筛,取粉末1.0g,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,称定质量,超声提取30min,室温放置,再称定质量,用甲醇补足失重,12000r/min离心3min,取上清液,过0.45μm有机微孔滤膜,即得甘草汁炙女贞子供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,步骤2、混合对照品溶液的制备方法为:
分别取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品适量,精密称定,置于10ml容量瓶中,加甲醇配成浓度分别为290μg/ml、312μg/ml和288μg/ml的特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品储备液;然后分别精密取特女贞苷、甘草苷和甘草酸铵对照品溶液适量,加甲醇定容至20ml,制成每1ml含特女贞苷14.5μg、甘草苷15.6μg和甘草酸铵14.4μg的混合对照品溶液。
4.根据权利要求3所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,色谱柱为11STAR LP RP-18endcapped,规格为4.6× 250mm,5μm。
5.根据权利要求1所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,得到的甘草汁炙女贞子指纹图谱中有6个共有峰,各共有峰的保留时间分别为:共有峰1,保留时间为52.914min;共有峰2,保留时间为57.919min;共有峰3,保留时间为71.147min;共有峰4,保留时间为76.014min;共有峰5,保留时间为81.031min;共有峰6,保留时间为103.046min。
6.根据权利要求5所述的一种甘草汁炙女贞子的指纹图谱检测方法,其特征在于,其中,1号峰为甘草苷,2号峰为特女贞苷,6号峰为甘草酸铵。
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