CN115561364A - 一种区分半夏不同炮制品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，通过记录、分析供试品溶液和对照品溶液的色谱图，确定8个特征峰；当供试品溶液色谱图仅有峰1、峰5时，该供试品为法半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6时，该供试品为清半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰8时，该供试品为姜半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图含有8个峰时，该供试品为竹沥半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒。本发明中的色谱信息较为丰富且定位准确，可用于区分半夏不同规格的炮制品，具有普适性；且本发明使用了对照药材或对照饮片做对比研究，具有权威性。

Description

一种区分半夏不同炮制品的方法
技术领域
本发明涉及一种区分半夏不同炮制品的方法，尤其涉及一种区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，属于中药鉴别技术领域。
背景技术
半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎，有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效，主要用于湿痰寒痰，咳喘痰多，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气，外治痈肿痰核等症(国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].中国医药科技出版社,2020)。
半夏有毒，麻舌刺喉，一般不生用。半夏炮制品种类繁多，相较于法半夏、姜半夏、清半夏等炮制品，竹沥半夏临床使用相对较少，对其研究较少。炮制品清半夏中加入了白矾，白矾具有祛除风痰之功，可增强清半夏的化痰功效，相对于姜半夏和法半夏，燥湿化痰力较强(卢静.半夏的炮制方法及临床选用[J].福建医药杂志,2007,29(6):178.)，宜用于湿痰者，与临床用药原则相一致。分析止咳作用结果，与对照组比较，各受试样品均具有止咳作用，姜半夏作用最强；其次为半夏、清半夏；法半夏作用最弱。姜半夏经甘草、石灰水制后，检出其特有成分甘草苷、甘草酸铵，这是由辅料甘草引入，甘草具有补脾益气、祛痰止咳、调和诸药的功效，不仅可以缓和半夏生品燥性，同时可增强姜半夏的止咳作用，尚有调脾和胃之功，因此临床上多用于脾虚湿困、痰饮内停之证。经生姜、白矾制后的姜半夏，止咳作用减弱，但加入辅料生姜，引入6-姜辣素，生姜善于温中止呕，增强了姜半夏止呕作用，适用脾虚痰涎作呕或寒痰咳逆者。
竹沥是竹子经加工后提取的汁液。它是一种无毒无副作用，集药、食两用的天然饮品，其性味甘寒，能清心肺胃之火，有清热豁痰、定惊利窍之功效，主要用于治中风痰迷，惊痫癫狂，痰热咳喘，痰稠胸闷等症。经竹沥炮制过的半夏温燥之性大减，使药性由热性转为寒性。(杨新杰,杨芳,刘琦,王薇,崔九成,宋小妹,.基于小鼠生理生化指标探讨生半夏和竹沥半夏的寒热药性[J].云南中医学院学报,2012,35(5):11-14)
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，是饮片改革的一种新形式，相比于传统饮片汤剂具有方便携带，使用简单的特性，能够满足现代快节奏工作与生活的要求。近年来，中药配方颗粒快速发展，多个中药品种的配方颗粒国家标准相继出台，为规范中药配方颗粒的生产，推动中药现代化做出了巨大贡献。竹沥半夏配方颗粒是竹沥半夏饮片经过现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成，保留了竹沥半夏的临床效果，同时兼顾了使用的便携性。
2020年版《中国药典》仅收录半夏、法半夏、清半夏及姜半夏，竹沥半夏未被收录其中。2019年版《江苏省中药饮片炮制规范》所收录的竹沥半夏项下，由性状、显微鉴别、薄层鉴别、水分、总灰分、白帆限量检查项和浸出物组成。这些检测项目在一定程度上能反映竹沥半夏颗粒的质量，但内容相对简单，质量控制效果有限。
关于竹沥半夏颗粒的质量控制手段目前少有报道。楚玉等人通过性状、显微和薄层对其进行鉴别，并采用高效液相色谱法对竹沥半夏中的姜辣素类成分和核苷类成分进行分析，但两类成分含量均较低，只可定性，无法定量。(楚玉,张科卫,陆兔林等.竹沥半夏质量标准研究[J].中药材,2017,40(3):641-644.)
此外，尚无将清半夏炮制品、法半夏炮制品、姜半夏炮制品和竹沥半夏炮制品进行统一比较研究的报告，但这对于解释半夏炮制机制和质量标准研究具有积极指导意义。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种区分竹沥半夏饮片和清半夏、法半夏、姜半夏饮片的方法。
本发明所要解决的技术问题是提供了一种区分竹沥半夏标准汤剂和清半夏、法半夏、姜半夏标准汤剂的方法。
本发明最后所要解决的技术问题是提供了一种区分竹沥半夏配方颗粒和清半夏、法半夏、姜半夏配方颗粒的方法。
技术方案：
本发明提供了一种区分竹沥半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒和清半夏、法半夏、姜半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒的方法，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：分别将竹沥半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒研细，称量，加入溶剂，称定重量，提取，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，离心，过滤，取续滤液，即得供试溶液；
(2)制备对照品溶液：分别称定对照品酪氨酸、色氨酸和6-姜辣素，加入10％甲醇溶液作为对照品参照物溶液；
(3)高效液相图谱检测：分别取供试溶液或对照品溶液，注入液相色谱仪，按220nm～270nm波长、以乙腈～0.15％磷酸为流动相的条件下进行高效液相图谱检测，记录色谱图；
(4)分析：在色谱图中选取相对保留时间稳定的峰作为特征峰，再与对照品溶液图谱的峰进行比较，确定竹沥半夏的8个特征峰；
(5)区分：分别将供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图进行比较；当供试溶液色谱图仅有峰1、峰5时，该供试品为法半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6时，该供试品为清半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰8时，该供试品为姜半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图含有8个峰时，该供试品为竹沥半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒。
其中，步骤(1)中所述溶剂为10％～80％甲醇或30％乙醇。
优选地，步骤(1)中溶剂为10％甲醇，此时各特征峰成分提取效果较高。
其中，步骤(1)中所述提取方式为振荡、超声或回流，提取时间为15～60min，提取量为5～25ml。
优选地，步骤(1)中提取方式为超声，提取时间为30min，提取量为10ml，实验操作的简便且提取效果较好。
其中，步骤(3)中所述高效液相图谱检测中的色谱柱为CORTECS UPLC T3、ACQUITYUPLC HSS T3或ZORBAX Eclipse Plus C18。
优选地，步骤(3)高效液相图谱检测中的色谱柱为CORTECS UPLC T3，可确保检测结果重现性。
其中，步骤(3)中所述高效液相图谱检测中的色谱柱柱温为20～30℃，流速为0.25～0.32ml/min。
优选地，步骤(3)高效液相图谱检测中的色谱柱柱温为25℃，流速为0.30ml/min，各特征峰分离效果均较好。
其中，步骤(3)中所述供试品溶液或对照品溶液的进样量为2μl。
其中，步骤(4)中的相对保留时间是若干组实验结果的平均值。
其中，步骤(4)中取酪氨酸为对照品时，峰1为酪氨酸的色谱峰；取色氨酸为对照品，峰5为色氨酸的色谱峰；取6-姜辣素为对照品，峰8为酪氨酸的色谱峰，与酪氨酸参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％范围以内，峰2规定值为1.77，与色氨酸参照物相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，峰3、峰4、峰6、峰7规定值分别为：0.83、0.90、1.21、1.56。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、色谱信息较为丰富且定位准确；2、竹沥半夏对照特征图谱是通过多产地多批次饮片取共有峰建立，具有普适性；3、使用对照药材或对照饮片做对比研究，具有权威性。
附图说明
图1为不同检测波长下竹沥半夏配方颗粒的UPLC图谱；
图2为高波长(270nm)下半夏不同炮制品的UPLC图谱；
图3为竹沥半夏配方颗粒特征图谱系统适用性考察-色谱柱的选择(CORTRCS为CORTECS UPLC T3，HSS为ACQUITY UPLC HSS T3，EP为ZORBAX Eclipse Plus C18)；
图4为竹沥半夏配方颗粒特征图谱系统适用性考察-柱温的选择；
图5为竹沥半夏配方颗粒特征图谱系统适用性考察-色谱柱流速的考察；
图6为竹沥半夏配方颗粒特征图谱提取溶剂的考察；
图7为不同提取溶剂下竹沥半夏配方颗粒的UPLC图谱；
图8为竹沥半夏配方颗粒特征图谱提取方式的考察；
图9为不同提取方式下竹沥半夏配方颗粒的UPLC图谱；
图10为竹沥半夏配方颗粒特征图谱提取时间的考察；
图11为不同提取时间下竹沥半夏配方颗粒的UPLC图谱；
图12为竹沥半夏配方颗粒特征图谱提取溶剂量的考察；
图13为不同提取溶剂量下竹沥半夏配方颗粒的UPLC图谱；
图14为3批竹沥半夏配方颗粒共有模式图；
图15为竹沥半夏配方颗粒特征图谱；
图16为竹沥半夏配方颗粒特征图谱专属性试验UPLC图谱；
图17为不同梯度洗脱下竹沥半夏配方颗的UPLC图谱；
图18为不同品牌仪器下竹沥半夏配方颗粒的UPLC图谱；
图19为竹沥半夏配方颗粒及对照品溶液的色谱图；
图20为竹沥半夏配方颗粒对照特征图谱；
图21为22批竹沥半夏饮片特征图谱叠加图；
图22为竹沥半夏饮片对照特征图谱；
图23为22批竹沥半夏标准汤剂特征图谱叠加图；
图24为竹沥半夏标准汤剂对照特征图谱；
图25为半夏不同炮制品饮片UPLC图谱；
图26为半夏不同炮制品标准汤剂UPLC图谱；
图27为半夏不同炮制品颗粒UPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
仪器和试剂
仪器：Vanquish F超高效液相色谱仪(美国赛默飞)、Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦)，ME204E/02电子天平(瑞士梅特勒托利多)、JJ500电子天平(常熟双杰)、KQ-250E超声波清洗器(昆山超声)、HY-4调速多用振荡器(金坛科兴)、HH-4数显恒温水浴锅(常州国华)、TGL-16C高速离心机(上海安亭)、LabUF250纯水系统(美国密理博)。
试剂：乙腈(色谱纯，赛默飞世尔)、磷酸(色谱纯，阿拉丁)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
对照品：酪氨酸(140609-201914)、色氨酸(140686-201303)、6-姜辣素(111833-202007)、半夏对照药材(121272-201806)、干姜对照药材(120942-201911)，均购自中国食品药品检定研究院。
竹沥半夏配方颗粒(由江阴天江药业有限公司提供，批号：ZLBX1、ZLBX2、ZLBX3)。
竹沥半夏饮片(由江阴天江药业有限公司提供，批号：YP1～22)。
对照品溶液的制备：取酪氨酸对照品、色氨酸对照品、6-姜辣素对照品，精密称定，分别加10％甲醇，制成20μg/ml的对照品溶液。
实施例1竹沥半夏颗粒UPLC特征图谱的检测
1.流动相的确定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以A(乙腈)-B(0.15％磷酸)为流动相。按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为25℃；检测波长为220nm。理论板数按色氨酸峰计算应不低于5000。
表1梯度洗脱比例
Figure BDA0003911574930000061
2.检测波长的确定
将竹沥半夏配方颗粒(批号：ZLBX1)研细，取1g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用10％甲醇补足经超声而减失的重量，摇匀，过滤，取竹沥半夏续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取4组2μl供试品溶液，注入液相色谱仪(Vanquish F超高效液相色谱仪(美国赛默飞)，色谱柱：CORTECS UPLC T3、流速：0.3ml/min；柱温：25℃)以乙腈为流动相A，0.15％磷酸为流动相B，按表1所规定的梯度进行洗脱，测定，记录全波长扫描信息图(见图1)，并对比220nm、240nm、254nm和270nm波长下色谱信息。
实验结果表明，高波长条件下，竹沥半夏色谱峰较少；对比半夏不同炮制品，高波长条件下(270nm)无竹沥半夏专属特征峰，或特征峰响应值极低(见图2)。综合考虑，选择220nm作为检测波长。
3.系统适用性考察
3.1色谱柱的选择
将竹沥半夏配方颗粒(批号：ZLBX1)研细，取1g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用10％甲醇补足经超声而减失的重量，摇匀，2～10℃放置8小时以上，12000rpm离心5分钟，取上清液，过滤，取竹沥半夏续滤液作为供试品溶液。采用Vanquish F超高效液相色谱仪(美国赛默飞)，分别采用表2中3款色谱柱，分别进样2μl进行检测，色谱柱流速为0.3ml/min，柱温为25℃，检测波长为220nm，以乙腈为流动相A，0.15％磷酸为流动相B，记录并对比色谱图，见图3。
表2颗粒特征图谱系统适用性考察色谱柱信息
Figure BDA0003911574930000071
结果表明：不同色谱柱间差异较大，其中CORTECS UPLC T3与ZORBAX EclipsePlus C18可用于本品特征图谱检测，为确保检测结果重现性，本实验选择CORTECS UPLC T3色谱柱进行后续研究。
3.2色谱柱柱温的选择
将竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)，按3.1中的方法制备供试品溶液，采用Vanquish F超高效液相色谱仪(美国赛默飞)，以CORTECS UPLC T3为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.15％磷酸为流动相B，220nm检测波长，流速为0.3ml/min，分别考察了20℃、25℃、30℃三种不同的柱温对样品分离的影响，记录并对比色谱图，结果见图4。
结果表明：柱温在20℃～30℃区间内各特征峰分离度较好，本次实验选择柱温25℃进行后续研究。
3.3色谱柱流速的考察
将竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)，按3.1中的方法制备供试品溶液，采用Vanquish F超高效液相色谱仪(美国赛默飞)，以CORTECS UPLC T3为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.15％磷酸为流动相B，220nm检测波长，柱温设置为25℃，分别考察了0.25ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min三种不同的流速对样品分离的影响，记录并对比色谱图，结果见图5。
结果表明：流速在0.25ml/min～0.32ml/min区间内各特征峰分离效果均较好，本次实验选择流速0.30ml/min进行后续研究。
综上，试验的最佳检测条件为：220nm检测波长、以A(乙腈)-B(0.15％磷酸)为流动相、CORTECS UPLC T3色谱柱、25℃柱温、0.30ml/min色谱柱流速。
4.供试品溶液的制备
4.1提取溶剂的考察
取竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)适量，研细，取约1g的竹沥半夏粉末，共取五组，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇和30％乙醇各10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得0.1g/ml的供试品溶液。
分别精密吸取各供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳检测条件进行测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表3、图6和图7。
表3不同提取溶剂的提取效率比较(峰面积/称样量)
Figure BDA0003911574930000081
结果表明：10％甲醇、30％甲醇提取效果接近，但从30％甲醇开始，出现溶剂效应，随着有机相比例增加，溶剂化效应也加剧，存在裂峰，影响正常积分。因此，确定提取溶剂为10％甲醇。
4.2提取方式的考察
取竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)适量，研细，取约1g，共取3组，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，分别振摇提取、超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流30分钟，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得0.1g/ml的供试品溶液。
分别精密吸取各供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳检测条件进行测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表4、图8和图9。
表4竹沥半夏配方颗粒特征图谱提取方式考察
Figure BDA0003911574930000091
结果表明：3种提取方式结果相接近，从实验操作的简便性角度，确定提取方式为超声处理。
4.3提取时间的考察
取竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)适量，研细，取约1g，共取4组，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟和60分钟，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，12000rpm离心5min，滤过，取续滤液，即得0.1g/ml的供试品溶液。
分别精密吸取各供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳检测条件进行测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表5、图10和图11。
表5配方颗粒特征图谱提取时间考察
Figure BDA0003911574930000092
结果表明：不同时间提取效果接近，但考虑到不同批次的差异性，确定提取时间为30分钟。
4.4提取体积的考察
取竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)适量，研细，取约1g，共取3组，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10％甲醇5ml、10ml和25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，12000rpm离心5min，过滤，取续滤液，即分别得0.04g/ml、0.1g/ml、0.2g/ml的供试品溶液。
分别精密吸取各供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳检测条件进行测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表6、图12和图13。
表6竹沥半夏配方颗粒特征图谱提取溶剂量考察
Figure BDA0003911574930000101
结果表明：提取溶剂量为10ml与25ml时，各特征峰成分提取效果高于提取溶剂量为5ml，因此确定提取溶剂量为10ml。
综上，实验应用的供试溶液最佳提取条件：提取溶剂为10％甲醇、提取方式为超声处理、提取时间为30分钟、提取溶剂量为10ml。
5.竹沥半夏颗粒特征图谱的建立
分别精密称定酪氨酸对照品、色氨酸对照品、6-姜辣素对照品20μg，分别加10％甲醇制成20μg/ml的对照品溶液。分别取3批竹沥半夏颗粒适量(批号：ZLBX1、ZLBX2、ZLBX3)，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，12000rpm离心5min，取上清液，过滤，取续滤液，即得0.1g/ml竹沥半夏溶液。
分别按供试溶液最佳提取条件提取3批供试溶液，并按最佳检测条件测定供试溶液与对照品溶液的UPLC图谱，再采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择其共有峰；再以峰5色氨酸为参照峰，选择其中相对保留时间较为稳定的共有峰作为特征峰，见图14和图15。其中，图14中峰1*(S1)：酪氨酸；峰3：赤杨酮；峰4：6-O-乙酰基熊果苷；峰5*(S2)：色氨酸；峰8*：6-姜辣素(*经对照品指认)；，2.1mm×100mm,1.6μm。图15中，供试品色谱中呈现8个特征峰，其中峰1、峰5、峰8的保留时间应分别与酪氨酸对照品、色氨酸对照品、6-姜辣素对照品参照物峰的保留时间相对应。
与酪氨酸参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应该规定值的±10％范围以内。规定值为1.77(峰2)。与色氨酸参照物相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.83(峰3)、0.90(峰4)、1.21(峰6)、1.56(峰7)。
实施例2竹沥半夏颗粒特征图谱的方法学考察
1.专属性考察
取竹沥半夏颗粒(批号：ZLBX1)作为供试品，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，再分别精密吸取缺竹沥半夏的阴性样品即辅料溶液(由麦芽糊精、硬脂酸镁和二氧化硅溶于10％甲醇制得)、酪氨酸对照品溶液、色氨酸对照品溶液、6-姜辣素对照品溶液和供试品溶液各2μl，按上述最佳检测条件进行测定，结果见图16。
结果表明：辅料对本品特征图谱的检测没有干扰，该方法具有一定的专属性。
2.整体性考察
取竹沥半夏颗粒供试品(批号：ZLBX1)，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，再按上述最佳检测条件进行测定，记录色谱图，按表7的洗脱梯度进行洗脱，并与实施例1中的梯度进行对比，结果见图17。结果显示，在相同的色谱条件下，保持乙腈最高比例，洗脱时间延长一倍。
表7整体性考察-洗脱梯度2
Figure BDA0003911574930000121
结果表明：原梯度洗脱结束后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析无干扰。
3.精密度考察
取竹沥半夏颗粒供试品(批号：ZLBX1)，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，再按上述最佳检测条件进行测定，连续进样6次，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表8。
表8配方颗粒特征图谱仪器精密度试验
Figure BDA0003911574930000122
结果表明：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3％，精密度试验良好。
4.稳定性考察
取竹沥半夏颗粒供试品(批号：ZLBX1)，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24h按最佳检测条件进行测定，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表9。
表9配方颗粒特征图谱稳定性试验
Figure BDA0003911574930000131
结果表明：供试品溶液在24小时内测定，相对保留时间及相对峰面积无显著波动，表明供试品溶液在24小时内稳定，可用于检测特征图谱。
5.重复性考察
取竹沥半夏颗粒供试品(批号：ZLBX1)，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，再按上述最佳检测条件进行测定，平行6份，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表10。
表10配方颗粒特征图谱重复性试验
Figure BDA0003911574930000141
结果表明：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，重复性良好。
6.中间精密度考察
取竹沥半夏颗粒供试品(批号：ZLBX1)，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，再用不同仪器按最佳检测条件进行测定，平行3份。考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果见表11、12和图18。
表11配方颗粒特征图谱中间精密度试验-相对保留时间
Figure BDA0003911574930000151
表12配方颗粒特征图谱中间精密度试验-相对峰面积
Figure BDA0003911574930000152
结果表明：竹沥半夏配方颗粒特征图谱在不同品牌的两台仪器间可以重现，各特征峰分离度尚可且峰型较好，相对保留时间差异较小，RSD均小于3％，但相对峰面积差别较大。
7.相对保留时间规定值的确定
按制备竹沥半夏配方颗粒的方法，分别制备竹沥半夏饮片和标准汤剂作为供试品的溶液，汇总竹沥半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒标准研究过程中，在最佳色谱条件下，使用不同仪器、同型号色谱柱各三根(CORTECS T3，2.1mm×100mm,1.6μm)进行测定，根据所测得的各特征峰相对保留时间，计算其最小值、最大值、均值，以其均值作为规定值，结果见表13、14。
表13相对保留时间汇总
Figure BDA0003911574930000171
表14相对保留时间规定值
Figure BDA0003911574930000172
结果显示：除参照峰以外，峰3、峰4、峰6、峰7相对S2峰的保留时间波动较小，均在均值的±5％以内；峰2相对S1峰的保留时间波动较大，但在均值±10％以内，因此考虑以均值作为其相对保留时间规定值，各特征峰的保留时间都应在规定值的±10％以内。
综上，确定本品特征图谱各特征峰相对S峰的相对保留时间应在规定值的±10％范围以内。相对保留时间规定值为：1.77(峰2)、0.83(峰3)、0.90(峰4)、1.21(峰6)、1.56(峰7)。
实施例3竹沥半夏配方颗粒的特征峰归属及UPLC特征图谱的建立
取3批竹沥半夏配方颗粒(批号：ZLBX1、ZLBX2、ZLBX3)，按实施例1中3.1的方法制备供试品溶液并按最佳提取条件提取供试品溶液，再按最佳检测条件进行测定，得到其相对保留时间和相对峰面积，结果见表15、16。
表15样品测定结果(相对保留时间)
Figure BDA0003911574930000181
表16样品测定结果(相对峰面积)
Figure BDA0003911574930000182
结果表明，以上3批样品中各特征峰的相对保留时间均比较稳定，均小于1％，且均在标准规定范围内。各特征峰的相对峰面积有所差异。
取酪氨酸对照品、色氨酸对照品、6-姜辣素对照品适量，精密称定，分别加10％甲醇制成每1ml各含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳色谱条件进行测定，记录色谱图，结果如图19。据对照品指认结果，确定竹沥半夏配方颗粒的特征峰归属如图20。
实施例4竹沥半夏饮片的UPLC特征图谱的检测和对照图谱的建立
取22批次的竹沥半夏饮片(由江阴天江药业有限公司提供，批号：YP1～22)1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃放置8h以上，12000rpm离心5分钟，取上清液，过滤，取续滤液，即得0.1g/ml供试品溶液。
精密量取22批供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳检测条件测定UPLC图谱，结果见表17、18和图21、22(峰1*：酪氨酸；峰3：赤杨酮；峰4：6-O-乙酰基熊果苷；峰5*(S)：色氨酸；峰8*：6-姜辣素(*经对照品指认)；色谱柱：CORTECS T3，2.1mm×100mm,1.6μm)。再采用国家药典委推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，确定了酪氨酸、色氨酸、6-姜辣素等8个特征峰，其中峰5、峰8与色氨酸、6-姜辣素对照品色谱峰保留时间相一致。与酪氨酸对照品相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应该规定值的±10％范围以内。规定值为1.77(峰2)。与色氨酸对照品相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.83(峰3)、0.90(峰4)、1.21(峰6)、1.56(峰7)。
表17样品测定结果-相对保留时间
Figure BDA0003911574930000201
表18样品测定结果-相对峰面积
Figure BDA0003911574930000211
结果表明，竹沥半夏饮片特征图谱各特征峰，相对保留时间均在规定值±10％以内，符合饮片特征图谱的标准要求；竹沥半夏饮片特征图谱特征峰相对峰面积的RSD在45％～103％，表明不同产地竹沥半夏饮片的各特征峰相对峰面积存在一定差异，故标准中暂不对峰面积进行规定。
实施例5竹沥半夏标准汤剂的UPLC特征图谱的检测和对照图谱的建立
竹沥半夏标准汤剂的制备：分别取22批次的竹沥半夏饮片(由江阴天江药业有限公司提供，批号：YP1～22)100g，捣碎，称定，置砂锅中，加入900ml水浸泡30min，采用YMW机械分体煎药壶，先武火煮沸，再文火煎煮30min，选择200目标准筛趁热过滤；二煎加700ml水，武火煮沸后，再文火煎煮25min，200目标准筛趁热过滤；两次滤液合并后在65℃条件下进行减压浓缩；浓缩至相对密度1.01～1.04(65℃)，将浓缩液分装至西林瓶后，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得竹沥半夏标准汤剂(批号：DG1～22)。
取22批次的竹沥半夏标准汤剂0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃放置8h以上，12000rpm离心5分钟，取上清液，过滤，取续滤液，即得0.1g/ml供试品溶液。
精密量取22批供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按上述最佳检测条件测定UPLC图谱，结果见表19、20和图23、24(峰1*：酪氨酸；峰3：赤杨酮；峰4：6-O-乙酰基熊果苷；峰5*(S)：色氨酸；峰8*：6-姜辣素(*经对照品指认)；色谱柱：CORTECS T3，2.1mm×100mm,1.6μm)。再采用国家药典委推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，确定了酪氨酸、色氨酸、6-姜辣素等8个特征峰，其中峰5、峰8与色氨酸、6-姜辣素对照品色谱峰保留时间相一致。与酪氨酸对照品相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应该规定值的±10％范围以内。规定值为1.77(峰2)。与色氨酸对照品相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.83(峰3)、0.90(峰4)、1.21(峰6)、1.56(峰7)。
表19样品测定结果-相对保留时间
Figure BDA0003911574930000231
表20样品测定结果-相对峰面积
Figure BDA0003911574930000241
结果表明，竹沥半夏标准汤剂特征图谱的特征峰相对保留时间均在规定值±10％以内，符合标准汤剂特征图谱的标准要求；竹沥半夏标准汤剂特征图谱特征峰相对峰面积的RSD在38％～119％，表明不同产地竹沥半夏标准汤剂的各特征峰相对峰面积存在一定差异，故标准中暂不对峰面积进行规定。
实施例6竹沥半夏饮片和清半夏饮片、法半夏饮片、姜半夏饮片的区分
清半夏对照饮片(YP1812237)、法半夏对照饮片(YP1812637)、姜半夏对照饮片(YP1911022)，均经甘肃省药品检验研究院检定，作为工作对照。
竹沥半夏饮片(由江阴天江药业有限公司提供，批号：YP19)。
1.对照溶液及供试品溶液的制备
取各对照药材、对照饮片及竹沥半夏饮片1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，12000rpm离心5min，取上清液，过滤，取续滤液，即得0.1g/ml供试品溶液和对照品溶液。
2.特征图谱检测
分别精密吸取各对照溶液及供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按最佳色谱检测条件进行测定，结果见图25。
根据对比研究结果，本方法所拟定的8个特征峰中，峰1(酪氨酸)、峰5(色氨酸)为不同规格炮制品饮片所共有峰；峰2、峰3、峰6在清半夏、姜半夏、竹沥半夏饮片中测得，可用于区分法半夏饮片与其他规格炮制品饮片；峰8(6-姜辣素)在姜半夏饮片、竹沥半夏饮片中测得，可用于区分该二者与其他炮制品饮片；峰4、峰7仅在竹沥半夏饮片中测得，为其专属成分，可用于区分竹沥半夏饮片与其他炮制品饮片。
实施例7竹沥半夏标准汤剂和清半夏、法半夏、姜半夏标准汤剂的区分
清半夏标准汤剂(DG-QBX)、法半夏标准汤剂(DG-FBX)、姜半夏标准汤剂(DG-JBX)，均由江阴天江药业有限公司提供。
竹沥半夏标准汤剂的制备：取竹沥半夏饮片(批号：YP10)100g，捣碎，称定，置砂锅中，加入900ml水浸泡30min，采用YMW机械分体煎药壶，先武火煮沸，再文火煎煮30min，选择200目标准筛趁热过滤；二煎加700ml水，武火煮沸后，再文火煎煮25min，200目标准筛趁热过滤；两次滤液合并后在65℃条件下进行减压浓缩；浓缩至相对密度1.01～1.04(65℃)，将浓缩液分装至西林瓶后，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得竹沥半夏标准汤剂。
1.对照溶液及供试品溶液的制备
取各标准汤剂适量，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃放置8h以上，12000rpm离心5分钟，取上清液，滤过，取续滤液，即得四种0.1g/ml供试品溶液。
2.特征图谱检测
分别精密吸取各对照溶液及供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按最佳色谱条件进行测定，结果见图26。
根据对比研究结果，本方法所拟定的8个特征峰中，峰1(酪氨酸)、峰5(色氨酸)为不同规格炮制品标准汤剂所共有峰；峰2、峰3、峰6在清半夏、姜半夏、竹沥半夏标准汤剂中测得，可用于区分法半夏标准汤剂与其他规格炮制品标准汤剂；峰8(6-姜辣素)在姜半夏标准汤剂、竹沥半夏标准汤剂中测得，可用于区分该二者与其他炮制品标准汤剂；峰4、峰7仅在竹沥半夏标准汤剂中测得，为其专属成分，可用于区分竹沥半夏标准汤剂与其他炮制品标准汤剂。与竹沥半夏饮片和清半夏、法半夏、姜半夏饮片的区分相同。
实施例8竹沥半夏配方颗粒和清半夏、法半夏、姜半夏颗粒的区分
竹沥半夏颗粒(ZLBX1)，清半夏颗粒(QBX1),法半夏颗粒(FBX1)，姜半夏(JBX1)，均由江阴天江药业有限公司提供。
1.对照溶液及供试品溶液的制备
取各颗粒适量，研细，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，12000rpm离心5min，取上清液，滤过，取续滤液，即得四种0.1g/ml供试品溶液。
2.特征图谱检测
分别精密吸取各对照溶液及供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按最佳色谱条件进行测定，结果见图27。
根据对比研究结果，本方法所拟定的8个特征峰中，峰1(酪氨酸)、峰5(色氨酸)为不同规格炮制品颗粒所共有峰；峰2、峰3、峰6在清半夏、姜半夏、竹沥半夏颗粒中测得，可用于区分法半夏颗粒与其他规格炮制品颗粒；峰8(6-姜辣素)在姜半夏颗粒、竹沥半夏颗粒中测得，可用于区分该二者与其他炮制品颗粒；峰4、峰7仅在竹沥半夏颗粒中测得，为其专属成分，可用于区分竹沥半夏颗粒与其他炮制品颗粒。与竹沥半夏饮片、标准汤剂和清半夏、法半夏、姜半夏饮片、标准汤剂的区分相同，故该特征图谱可用于区分不同类型竹沥半夏与各类型的清半夏、法半夏、姜半夏。

Claims (10)

1.一种区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：分别将竹沥半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒研细，称量，加入溶剂，称定重量，提取，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，2～10℃静置8h以上，离心，过滤，取续滤液，即得供试溶液；
(2)制备对照品溶液：分别称定对照品酪氨酸、色氨酸和6-姜辣素，加入10％甲醇溶液作为对照品参照物溶液；
(3)高效液相图谱检测：分别取供试溶液或对照品溶液，注入液相色谱仪，按220nm～270nm波长、以乙腈～0.15％磷酸为流动相的条件下进行高效液相图谱检测，记录色谱图；
(4)分析：在色谱图中选取相对保留时间稳定的峰作为特征峰，再与对照品溶液图谱的峰进行比较，确定竹沥半夏的8个特征峰；
(5)区分：分别将供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图进行比较；当供试品溶液色谱图仅有峰1、峰5时，该供试品为法半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6时，该供试品为清半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰8时，该供试品为姜半夏饮片、标准汤剂或其颗粒；当供试溶液色谱图含有8个峰时，该供试品为竹沥半夏饮片、标准汤剂或其配方颗粒。
2.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶剂为10％～80％甲醇或30％乙醇。
3.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取方式为振荡、超声或回流。
4.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取时间为15～60min。
5.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取量为5～25ml。
6.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(3)中所述高效液相图谱检测中的色谱柱为CORTECS UPLC T3、ACQUITY UPLC HSS T3或ZORBAX Eclipse Plus C18。
7.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(3)中所述高效液相图谱检测中的色谱柱柱温为20～30℃，流速为0.25～0.32ml/min。
8.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(3)中所述供试品溶液或对照品溶液的进样量为2μl。
9.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(4)中的相对保留时间是若干组实验结果的平均值。
10.根据权利要求1所述区分竹沥半夏和清半夏、法半夏、姜半夏的方法，其特征在于，步骤(4)中取酪氨酸为对照品时，峰1为酪氨酸的色谱峰；取色氨酸为对照品，峰5为色氨酸的色谱峰；取6-姜辣素为对照品，峰8为酪氨酸的色谱峰，与酪氨酸参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围以内，峰2规定值为1.77，与色氨酸参照物相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内，峰3、峰4、峰6、峰7规定值分别为：0.83、0.90、1.21、1.56。
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