CN113759034A - 麦门冬汤物质基准的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麦门冬汤物质基准的建立方法,其包括:采用薄层色谱法对麦冬、人参、大枣、甘草进行鉴别;构建特征图谱对麦门冬汤中的成分进行鉴别;测定麦门冬汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷、甘草酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。本发明的方法可全面反映出麦门冬汤传统汤剂的质量属性,确保麦门冬汤制剂与汤剂质量的一致性,全面、有效地控制产品质量。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量分析检测技术领域,尤其涉及一种麦门冬汤物质基准的建立方法。
背景技术
麦门冬汤出自汉代张仲景的《金匮要略》:“大逆上气,咽喉不利,止逆下气者,麦门冬汤主之。麦门冬七升,半夏一升,人参二两,甘草二两,粳米三合,大枣十二枚。上六味,以水一斗二升,煮取六升,温服一升,日三夜一服。”现代常用于治疗慢性支气管炎、支气管扩张症、肺结核、矽肺、慢性肺纤维化、慢性咽喉炎、胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎、糖尿病和干燥综合征等,辨证属于肺阴不足或胃阴不足者。麦门冬汤目前在国内尚未开发成为中成药,但在日本已被开发为汉方制剂使用,在日本销售额排名前列,该方已被收录在国家药品监督管理局制定并公布的《古代经典名方目录(第一批)》,具有很强的开发价值和前景。
但是,日本在售的麦门冬汤颗粒汉方药的处方剂量小,其处方组方、剂量、制法及服用方法与古籍记载不相符,治疗效果尚有待对比检验。近年来,国内许多学者对麦门冬汤中的化学成分和有效组分进行药理学、药效学和药动学等方面的研究,主要集中在药理学的研究方面,对其汤剂的物质基础、提取工艺、多指标成分含量测定及特征图谱研究较少,缺少系统性研究。且对于如何衡量大生产制剂与传统汤剂质量的一致性也研究较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种麦门冬汤物质基准的建立方法,该方法可为麦门冬汤大生产质量控制提供数据基础,保证麦门冬汤产品质量的稳定性和可控性。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种麦门冬汤物质基准的建立方法,所述麦门冬汤由以下组分组成:麦冬、法半夏、人参、甘草、粳米和大枣;所述建立方法包括:
(1)采用薄层色谱法对麦冬、人参、大枣、甘草进行鉴别;
(2)构建特征图谱对麦门冬汤中的成分进行鉴别;
(3)测定麦门冬汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷、甘草酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
作为上述方案的改进,采用薄层色谱法对麦冬、人参同时进行鉴别,采用薄层色谱法对麦冬、大枣、甘草同时进行鉴别;
构建UPLC-UV特征图谱以对麦门冬汤中黄酮类成分进行鉴别,同时,测定甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷和甘草酸的含量;
构建HPLC-ELSD特征图谱以对麦门冬汤中皂苷类成分进行鉴别,同时,测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
作为上述方案的改进,所述麦冬、人参的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤制剂,加溶剂提取或溶解后得到人参薄层供试品溶液;
(2)分别取麦冬对照药材、人参对照药材,加溶剂提取或溶解后分别得到第一麦冬薄层对照药材溶液和人参薄层对照药材溶液;
(3)取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品,加甲醇溶解,得到人参薄层对照品溶液;
(4)分别吸取人参薄层供试品溶液、第一麦冬薄层对照药材溶液、人参薄层对照药材溶液和人参薄层对照品溶液,点于同一硅胶G板上,以三氯甲烷、甲醇和水的混合溶液为展开剂,展开;供试品色谱中,在与对照药材及对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
作为上述方案的改进,所述麦冬、人参的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤制剂1~3g,研细,加水20~50mL,超声溶解,溶液用水饱和正丁醇振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并正丁醇液,加2~4倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇0.5~1.5mL使溶解,作为人参薄层供试品溶液;
(2)取麦冬对照药材1~3g,加水30~80mL,加热煮沸20~60分钟,离心,取上清液,上清液用水饱和正丁醇振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并正丁醇液,加2~4倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇0.5~1.5mL使溶解,作为第一麦冬薄层对照药材溶液;
取人参对照药材1~3g,加水30~80mL,加热煮沸20~60分钟,离心,取上清液,上清液用水饱和正丁醇振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并正丁醇液,加2~4倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇0.5~1.5mL使溶解,作为人参薄层对照药材溶液;
(3)取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品,加甲醇制成每1mL各含1mg人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品的混合溶液,作为人参薄层对照品溶液;
(4)吸取人参薄层供试品溶液5~15μL,第一麦冬薄层对照药材溶液3~8μL,人参薄层对照药材溶液和人参薄层对照品溶液各1~3μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为13:7:2的三氯甲烷、甲醇和水的混合溶液的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,分别置日光和波长为365nm的紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
作为上述方案的改进,所述麦冬、甘草、大枣的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤制剂,加溶剂提取或溶解后得到大枣薄层供试品溶液;
(2)分别取大枣对照药材、麦冬对照药材、甘草对照药材,加溶剂提取或溶解后分别得到大枣薄层对照药材溶液、第二麦冬薄层对照药材溶液和甘草薄层对照药材溶液;
(3)分别吸取大枣薄层供试品溶液、大枣薄层对照药材溶液、第二麦冬薄层对照药材溶液和甘草薄层对照药材溶液,点于同一硅胶G板上,以三氯甲烷、丙酮的混合溶液为展开剂,展开;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
作为上述方案的改进,所述麦冬、甘草、大枣的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤试剂1.0~3.0g,研细,加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇3~8mL使溶解,作为大枣薄层供试品溶液;
(2)取大枣对照药材0.5~1.5g,加水30~80mL煎煮20~60min后,过滤,煎液加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1~3mL使溶解,得到大枣薄层对照药材溶液;
取麦冬对照药材0.5~1.5g,加水30~80mL煎煮20~60min后,过滤,煎液加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1~3mL使溶解,得到第二麦冬薄层对照药材溶液;
取甘草对照药材0.5~1.5g,加水30~80mL煎煮20~60min后,过滤,煎液加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇3~8mL使溶解,得到甘草薄层对照药材溶液;
(3)吸取大枣薄层供试品溶液3~8μL,第二麦冬薄层对照药材溶液3~8μL,大枣薄层对照药材溶液5~15μL和甘草薄层对照药材溶液1~3μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为8:1的三氯甲烷、丙酮的混合溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,分别置日光和波长为365nm的紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点或荧光斑点。
作为上述方案的改进,所述UPLC-UV特征图谱的构建方法为:
(1)取甘草酸铵、甘草素、甘草苷、异甘草苷对照品,加入溶剂溶解或提取,制得甘草特征图谱对照品溶液;
取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品,加入溶剂溶解或提取,制得麦冬黄酮对照品溶液;
(2)取麦门冬汤制剂,加提取溶剂提取,制得UPLC-UV特征图谱供试品溶液;
(3)取预设量的甘草特征图谱对照品溶液、麦冬黄酮对照品溶液和UPLC-UV特征图谱供试品溶液,注入液相色谱仪,所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱,构建麦门冬汤的UPLC-UV特征图谱,并测定麦冬门汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A对照品、甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷和甘草酸含量。
作为上述方案的改进,所述梯度洗脱按下述程序进行:
0~8min,流动相A从5%→18%,流动相B从95%→82%;
8~11min,流动相A从18%→20%,流动相B从82%→80%;
11~21min,流动相A从20%→21%,流动相B从80%→79%;
21~23min,流动相A从21%→28%,流动相B从79%→72%;
23~29min,流动相A从28%→30%,流动相B从72%→70%;
29~38min,流动相A从30%→38%,流动相B从70%→62%;
38~47min,流动相A从38%→55%,流动相B从62%→45%;
47~54min,流动相A从55%→65%,流动相B从45%→35%。
作为上述方案的改进,步骤(3)中,分别吸取甘草特征图谱对照品溶液、麦冬黄酮对照品溶液和UPLC-UV特征图谱供试品溶液各1~3μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以0.08vol%~0.12vol%的磷酸水溶液为流动相B,流速为0.28~0.32mL/min;柱温为28~32℃,检测波长为250~300nm。
作为上述方案的改进,步骤(3)中,分别吸取甘草特征图谱对照品溶液1μL、麦冬黄酮对照品溶液1μL和UPLC-UV特征图谱供试品溶液2μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm;所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以0.1vol%的磷酸水溶液为流动相B;流速为0.3mL/min;柱温为30℃,检测波长为252~296nm。
作为上述方案的改进,所述UPLC-UV特征图谱的构建方法中,当检测时间为0~46分钟时,检测波长为252nm;检测时间为46~54分钟时,检测波长为296nm。
作为上述方案的改进,步骤(1)中,取甘草酸铵、甘草素、甘草苷、异甘草苷对照品,加甲醇制成每1mL含甘草酸20μg、甘草素35μg、甘草苷10μg、异甘草苷10μg的混合溶液,即得甘草特征图谱对照品溶液;
分别精密称取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品适量,加甲醇制成每1mL含甲基麦冬二氢高异黄酮A5μg、甲基麦冬二氢高异黄酮B 5μg的混合溶液,即得麦冬黄酮对照品溶液。
作为上述方案的改进,步骤(2)中,所述提取溶剂为75vol%甲醇或50vol%乙醇,提取时间为20~40min,提取方式为超声提取或回流提取。
作为上述方案的改进,步骤(2)包括:
取麦门冬汤制剂1g,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理30min,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理30min,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得UPLC-UV特征图谱供试品溶液。
作为上述方案的改进,所述UPLC-UV特征图谱包括15个特征峰;其中,峰2为甘草苷峰,峰5为异甘草苷峰,峰6为甘草素峰,峰10为甘草酸峰,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A峰,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B峰;
以峰6为S1峰,峰1~峰6与S1峰的相对保留时间在第一规定值的±10%之内;所述第一规定值:峰1为0.55、峰2为0.56、峰3为0.87、峰4为0.90、峰5为0.94、峰6为1.00;
以峰10为S2峰,峰7~峰15与S2峰的相对保留时间在第二规定值的±10%之内;所述第二规定值为:峰7为0.75、峰8为0.80、峰9为0.93、峰10为1.00、峰11为1.04、峰12为1.05、峰13为1.08、峰14为1.24、峰15为1.26。
作为上述方案的改进,所述HPLC-ELSD特征图谱的构建方法为:
(1)取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品,加入溶剂溶解或提取,制得人参皂苷对照品溶液;
(2)取麦门冬汤制剂,加提取溶剂提取,制得HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液;
(3)取预设量的人参皂苷对照品溶液和HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液,注入液相色谱仪,所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,水为流动相B进行梯度洗脱,构建麦门冬汤的HPLC-ELSD特征图谱,并测定麦冬门汤中人参皂苷Rb1、人参皂苷Re和人参皂苷Rg1含量。
作为上述方案的改进,所述梯度洗脱按下述程序进行:
0~15min,流动相A从19%→21%,流动相B从81%→79%;
15~20min,流动相A从21%→30%,流动相B从79%→70%;
20~32min,流动相A从30%→31%,流动相B从70%→69%;
32~40min,流动相A从31%→38%,流动相B从69%→62%;
40~45min,流动相A从38%→41%,流动相B从62%→59%;
45~55min,流动相A从41%→85%,流动相B从59%→15%。
作为上述方案的改进,步骤(3)中,分别吸取人参皂苷对照品溶液和HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液各5~15μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其柱温为30~34℃;所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以水为流动相B,流速为0.43~0.47mL/min;所述液相色谱仪的检测器的气体流速为2.5~3.5L/min,漂移管温度为90~110℃。
作为上述方案的改进,步骤(3)中,分别吸取人参皂苷对照品溶液和HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液各15μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm,柱温为32℃;所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以水为流动相B,流速为0.45mL/min;所述液相色谱仪的检测器的气体流速为3L/min,漂移管温度为100℃。
作为上述方案的改进,步骤(1)中,取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,加50%甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品各0.10mg,人参皂苷Rb1对照品0.15mg的混合溶液,即得人参皂苷对照品溶液。
作为上述方案的改进,步骤(2)中,所述提取溶剂为水和水饱和正丁醇,提取时间为15~45min,提取次数为3~4次,提取方式为超声提取或萃取提取。
作为上述方案的改进,步骤(2)包括:
取麦门冬汤制剂1~2g,研细,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水20~80mL,水饱和正丁醇20~50mL,超声处理20~40分钟,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇萃取2~4次,每次20~50mL,合并正丁醇层溶液至蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加40~60%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液。
作为上述方案的改进,所述HPLC-ELSD特征图谱包括8个特征峰;其中,峰1为人参皂苷Rg1峰,峰2为人参皂苷Re峰,峰4为人参皂苷Rb1峰;
以峰4为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间在第三规定值的±10%范围之内;其中,所述第三规定值为:峰3为0.87,峰5为1.08,峰6为1.19,峰7为1.33,峰8为1.35。
作为上述方案的改进,还包括:
(4)将麦门冬汤蒸干,测定其出膏率;
(5)测定麦门冬汤的浸出物。
作为上述方案的改进,所述麦门冬汤由以下重量份的组分组成:麦冬130.55份,法半夏18.65份,人参7.46份,甘草7.46份,粳米5.60份,大枣9.70份。
作为上述方案的改进,所述麦门冬汤的制备方法为:取麦冬、法半夏、人参、甘草、粳米和大枣,以水浸泡,武火煮沸,文火沸腾后经筛网滤过即得。
作为上述方案的改进,所述麦门冬汤的制备方法为:取麦冬130.55g,法半夏18.65g,人参7.46g,甘草7.46g,粳米5.60g,大枣9.70g,加水2400mL浸泡,武火煮沸,文火沸腾至药液为1100~1300mL,经筛网滤过即得。
实施本发明,具有如下有益效果:
(1)本发明所述建立的麦门冬汤的药物制剂质量控制方法,采用高效液相色谱法测定麦门冬汤各药味指标成分的含量,同时采用薄层色谱技术对各药味进行鉴别,结合麦门冬汤的药物制剂定量和定性分析,更加有利于其全面质量检测和整体质量控制,从而有助于提高该药物制剂使用的安全性和稳定性。
(2)本发明鉴别麦门冬汤中的麦冬、人参采用的是同一个供试品和鉴别方法,主要针对麦冬和人参中的皂苷类成分,本发明不仅采用人参对照药材样品,还增加了人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品的鉴别,更全面完整的对麦门冬汤中人参药味的专属性鉴别,同时麦冬药味中的专属性皂苷类成分在此方法中也得到了鉴别。本发明还用同一个供试品和鉴别方法鉴别麦门冬汤中的麦冬、大枣、甘草,其中麦冬、大枣为同一个鉴别斑点,应为苷类成分水解后的β-谷甾醇、皂苷元成分等低极性成分,而甘草水解后产生甘草次酸、甘草素、甘草皂苷甘元等物质,斑点清晰,且具专属性,应为甘草皂苷水解后皂甘元成分。供试品色谱呈现出与对照药材色谱一致的斑点,且阴性无干扰,具有专属性。本发明多采用同一个供试品、同一块薄层板及同一种显色检视可同时鉴别多个味药材,降低了检验成本,节省了检验时间。
(3)本发明对麦门冬汤中的主要药效成分黄酮、皂苷主成分,分别采用不同的紫外和蒸发光检测仪器,建立了双特征图谱,同时对其主成分进行了多指标含量测定。本发明的特征图谱可充分展示麦门冬汤的化学成分的特征,特征峰信息量丰富,该方法稳定,准确可靠,实现对麦门冬汤中多个药味的特征成分的质量监控。
附图说明
图1是本发明中麦冬、人参的专属性薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为第一麦冬薄层阴性样品,2为人参薄层阴性样品,3~5为人参薄层供试品,6为第一麦冬对照药材,7为人参薄层对照药材,8为人参薄层对照品;
图2是本发明中麦冬、人参的专属性薄层色谱图(日光),其中,1为第一麦冬薄层阴性样品,2为人参薄层阴性样品,3~5为人参薄层供试品,6为第一麦冬对照药材,7为人参薄层对照药材,8为人参薄层对照品;
图3是不同点样量下麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,点样量分别为5μL、10μL、15μL,4~6为第一麦冬薄层对照药材,点样量分别为3μL、5μL、10μL,7~9为人参薄层对照药材,点样量分别为2μL、5μL、10μL;10~12为人参薄层对照品,点样量分别为1μL、3μL、5μL;
图4是不同点样量下麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,点样量分别为5μL、10μL、15μL,4~6为第一麦冬薄层对照药材,点样量分别为3μL、5μL、10μL,7~9为人参薄层对照药材,点样量分别为2μL、5μL、10μL;10~12为人参薄层对照品,点样量分别为1μL、3μL、5μL;
图5是23℃下麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图6是23℃下麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图7是6℃下麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图8是6℃下麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图9是相对湿度为38%时麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图10是相对湿度为38%时麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图11是相对湿度为80%时麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图12是相对湿度为80%时麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图13是采用海洋硅胶G板时麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图14是采用海洋硅胶G板时麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图15是采用默克硅胶G板时麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图16是采用默克硅胶G板时麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~3为人参薄层供试品,4为第一麦冬对照药材,5为人参薄层对照药材,6为人参薄层对照品;
图17是不同批次麦冬门汤的麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~7为S1~S7批次人参薄层供试品,8为第一麦冬对照药材,9为人参薄层对照药材,10为人参薄层对照品;
图18是不同批次麦冬门汤的麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~7为S1~S7批次人参薄层供试品,8为第一麦冬对照药材,9为人参薄层对照药材,10为人参薄层对照品;
图19是不同批次麦冬门汤的麦冬、人参的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~8为S8~S15批次人参薄层供试品,9为第一麦冬对照药材,10为人参薄层对照药材,11为人参薄层对照品;
图20是不同批次麦冬门汤的麦冬、人参的薄层色谱图(日光),其中,1~7为S1~S7批次人参薄层供试品,8为第一麦冬对照药材,9为人参薄层对照药材,10为人参薄层对照品;
图21是本发明中麦冬、大枣、甘草的专属性薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图22是本发明中麦冬、大枣、甘草的专属性薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图23是不同点样量下麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~3为大枣薄层供试品,点样量分别为1μL、3μL、5μL,4~6为第二麦冬薄层对照药材,点样量分别为1μL、3μL、5μL,7~9为大枣薄层对照药材,点样量分别为5μL、10μL、15μL;10~12为甘草薄层对照药材,点样量分别为1μL、3μL、5μL;
图24是不同点样量下麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1~3为大枣薄层供试品,点样量分别为1μL、3μL、5μL,4~6为第二麦冬薄层对照药材,点样量分别为1μL、3μL、5μL,7~9为大枣薄层对照药材,点样量分别为5μL、10μL、15μL;10~12为甘草薄层对照药材,点样量分别为1μL、3μL、5μL;
图25是22℃下麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图26是22℃下麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图27是4℃下麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图28是4℃下麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图29是相对湿度为30%时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图30是相对湿度为30%时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图31是相对湿度为90%时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图32是相对湿度为90%时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图33是采用默克硅胶G板时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图34是采用默克硅胶G板时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图35是采用海洋硅胶G板时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图36是采用海洋硅胶G板时麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1为半夏甘草薄层双阴性样品,2为甘草薄层阴性样品,3为麦冬大枣薄层双阴性溶液,4~6为大枣薄层供试品,7为第二麦冬对照药材,8为大枣薄层对照药材,9为甘草薄层对照药材;
图37是不同批次麦冬门汤的麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~7为S1~S7批次大枣薄层供试品,8为第二麦冬对照药材,9为大枣薄层对照药材,10为甘草薄层对照药材;
图38是不同批次麦冬门汤的麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1~7为S1~S7批次大枣薄层供试品,8为第二麦冬对照药材,9为大枣薄层对照药材,10为甘草薄层对照药材;
图39是不同批次麦冬门汤的麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(365nm紫外光),其中,1~8为S8~S15批次大枣薄层供试品,9为第二麦冬对照药材,10为大枣薄层对照药材,11为甘草薄层对照药材;
图40是不同批次麦冬门汤的麦冬、大枣、甘草的薄层色谱图(日光),其中,1~7为S1~S7批次大枣薄层供试品,8为第二麦冬对照药材,9为大枣薄层对照药材,10为甘草薄层对照药材;
图41是本发明麦门冬汤采用不同色谱柱测定时的UPLC-UV特征图谱;
图42是本发明麦门冬汤采用不同检测波长测定时的UPLC-UV特征图谱;
图43是本发明麦门冬汤采用不同流动相测定时的UPLC-UV特征图谱;
图44是本发明麦门冬汤采用不同流速测定时的UPLC-UV特征图谱;
图45是本发明麦门冬汤采用不同柱温测定时的UPLC-UV特征图谱;
图46是本发明麦门冬汤UPLC-UV特征图谱专属性考察中供试品、单味药麦冬、单味药人参、单味药大枣、单味药粳米的特征图谱;其中,峰2为甘草苷,峰5为异甘草苷,峰6为甘草素,峰10为甘草酸,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图47是本发明麦门冬汤UPLC-UV特征图谱专属性考察中供试品、单味药麦冬、缺麦冬阴性样品的特征图谱;其中,峰2为甘草苷,峰5为异甘草苷,峰6为甘草素,峰10为甘草酸,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图48是本发明麦门冬汤UPLC-UV特征图谱专属性考察中供试品、单味药甘草、单味药法半夏、缺甘草法半夏双阴性样品的特征图谱;其中,峰2为甘草苷,峰5为异甘草苷,峰6为甘草素,峰10为甘草酸,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图49是本发明麦门冬汤的UPLC-UV对照特征图谱;其中,峰2为甘草苷,峰5为异甘草苷,峰6为甘草素,峰10为甘草酸,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图50是多批次麦门冬汤的UPLC-UV特征图谱叠加图;其中,峰2为甘草苷,峰5为异甘草苷,峰6为甘草素,峰10为甘草酸,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图51是麦门冬汤的总离子流图(ESI-),其中,A为供试品,B为甘草特征图谱对照品,C为麦冬黄酮对照品;
图52是麦门冬汤的总离子流图(ESI+),其中,A为供试品,B为甘草特征图谱对照品,C为麦冬黄酮对照品;
图53是麦门冬汤的UPLC-UV特征图谱色谱峰的指认图,其中峰2为甘草苷,峰5为异甘草苷,峰6为甘草素,峰10为甘草酸,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图54是本发明麦门冬汤采用不同色谱柱测定时的HPLC-ELSD特征图谱;
图55是本发明麦门冬汤采用不同流速测定时的HPLC-ELSD特征图谱;
图56是本发明麦门冬汤采用不同柱温测定时的HPLC-ELSD特征图谱;
图57是本发明麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱专属性考察中供试品、麦冬阴性样品、人参阴性样品、人参皂苷对照品的特征图谱;其中,峰1为人参皂苷Rg1,峰2为人参皂苷Re,峰3为人参皂苷Rf,峰4为人参皂苷Rb1,峰5为人参皂苷Rc,峰6为人参皂苷Rb2,峰8为人参皂苷Rd;
图58是本发明麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱专属性考察中供试品、单味药甘草、单味药粳米、单味药大枣、单味药法半夏、单味药人参、单味药麦冬的特征图谱;其中,峰1为人参皂苷Rg1,峰2为人参皂苷Re,峰3为人参皂苷Rf,峰4为人参皂苷Rb1,峰5为人参皂苷Rc,峰6为人参皂苷Rb2,峰8为人参皂苷Rd;
图59是麦门冬汤的HPLC-ELSD对照特征图谱;其中,峰1为人参皂苷Rg1,峰2为人参皂苷Re,峰3为人参皂苷Rf,峰4为人参皂苷Rb1,峰5为人参皂苷Rc,峰6为人参皂苷Rb2,峰8为人参皂苷Rd;
图60是15批次麦门冬汤的HPLC-ELSD特征图谱的叠加图;其中,峰1为人参皂苷Rg1,峰2为人参皂苷Re,峰3为人参皂苷Rf,峰4为人参皂苷Rb1,峰5为人参皂苷Rc,峰6为人参皂苷Rb2,峰8为人参皂苷Rd;
图61是麦冬门汤的总离子流图(ESI-);
图62是麦冬门汤的总离子流图(ESI+);
图63是麦门冬汤的HPLC-ELSD特征图谱的对照品指认结果图,其中峰1为人参皂苷Rg1、峰2为人参皂苷Re、峰3为人参皂苷Rf、峰4为人参皂苷Rb1、峰5为人参皂苷Rc、峰6为人参皂苷Rb2、峰8为人参皂苷Rd;
图64是本发明麦门冬汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量测定方法专属性考察的UPLC叠加图谱;其中,1为甲基麦冬二氢高异黄酮A,2为甲基麦冬二氢高异黄酮B;
图65是本发明麦门冬汤中甘草苷和甘草酸含量的测定方法专属性考察的HPLC叠加图谱;
图66是本发明麦门冬汤中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1含量的测定方法专属性考察的HPLC叠加图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明的麦门冬汤出自汉代张仲景的《金匮要略》基于古籍文献进行多方面循古考证,所确定的麦门冬汤方剂如下:麦门冬130.55g,法半夏18.65g,人参7.46g,甘草7.46g,粳米5.60g,大枣9.70g。各药材饮片经鉴定符合2020年版药典一部相关项下规定。由于生半夏含有刺激性毒性成分,不经现代炮制,可能存在用药安全性的问题,结合麦门冬汤中含有甘草饮片,最终确定半夏炮制方法为法半夏。根据考证文献陶弘景《论合药分剂料理法则》中记载一升半夏合五两,一升十合,且根据实测,半夏、麦冬、粳米用量具量取的密度基本一致,因此不考虑密度差别,剂量由容积比例等同于重量比例7:1:0.3,根据明朝李时珍汉唐“一两”约合明代“一钱为3.73g”的标准,换算结果为:人参用量3.73g/钱×2钱=7.46g。以人参用量为基准,等比例换算出其他药味剂量。
进一步的,基于古籍文献考证确定麦门冬汤传统汤剂的制法为:取上述六味饮片,以水2400ml,浸泡30分钟,武火(500W,30分钟)煮沸,文火(300W)保持沸腾至药液约1200ml,筛网滤过即得麦门冬汤标准汤剂;减压低温(55℃)浓缩至约450ml的浸膏,搅匀分装棕色西林瓶中,转移至真空循环泵真空冷冻干燥机中冷冻干燥,取出,得冻干粉。进一步的,发明人收集了各药材不少于3个主产地15批次以上原料,炮制成饮片后,随机组方15批次(组方结果见下表4)以上,并制备麦门冬汤冻干粉制剂。
进一步的,在制备过程中,对出膏率进行了研究,其具体包括:取麦门冬汤标准汤剂25ml,精密称定,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量,根据所用药材的重量计算出膏率。出膏率平均值为46.1%,范围应在42.5%~48.8%。
此外,还对麦门冬汤的浸出物进行了研究。具体的,取麦门冬汤2g,精密称定,精密加入90%乙醇100ml,100ml,密塞,称定重量,静置1小时后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1小时。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取滤液25ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量。除另有规定外,以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(%);浸出物平均值为37.3%,范围应在27.9%~47.9%。
为了全面地反映麦门冬汤的质量信息,实现全面、有效地控制麦门冬汤产品质量,本发明提供了一种麦门冬汤物质基准的建立方法,以下对其进行详细说明:
一、仪器与试药
本发明所用到的仪器、试剂、试药以及组方所采用药物的信息如表1~表4所示:
表1仪器信息汇总表
表2试剂信息汇总表
表3对照品信息
表4 15批麦门冬汤的组方饮片批号及对应产地组合和相关单味药及阴性饮片组合
二、麦门冬汤中麦冬、人参的薄层色谱鉴别方法
2.1鉴别方法
(1)供试品溶液制备:取麦门冬汤冻干粉2.0g,研细,加水30mL,超声溶解,溶液用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,加3倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为人参薄层供试品溶液。
(2)对照药材溶液制备:取麦冬对照药材1.0g,加水50mL,加热煮沸30分钟,离心,取上清液,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,加3倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为第一麦冬薄层对照药材溶液;
再取人参对照药材1.0g,加水50mL,加热煮沸30分钟,离心,取上清液,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,加3倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为人参薄层对照药材溶液;
(3)对照品溶液制备:取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品,加甲醇制成每1mL各含1mg人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品的混合溶液,作为人参薄层对照品溶液。
(4)分别吸取人参薄层供试品溶液10μL,第一麦冬薄层对照药材溶液5μL,人参薄层对照药材溶液2μL和人参薄层对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
2.2方法学验证
2.2.1专属性
取缺麦冬麦门冬汤冻干粉2g,按照供试品溶液的制备方法制成第一麦冬薄层阴性样品溶液。取缺人参麦门冬汤冻干粉2g,按照供试品溶液的制备方法制成人参薄层阴性样品溶液。
分别吸取人参薄层供试品溶液10μL、第一麦冬薄层对照药材溶液5μL、人参薄层对照药材溶液2μL、人参薄层对照品溶液3μL、第一麦冬薄层阴性样品溶液5μL和人参薄层阴性样品溶液5μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(银龙硅胶G板)上,在常温常湿(T:23℃,RH:58%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图1、图2。
由图可见麦门冬汤样品色谱和麦冬、人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品色谱的相应位置显相同颜色的斑点,且阴性样品无干扰。说明该薄层方法专属性好。
2.2.2耐用性
(1)不同点样量考察
分别吸取人参薄层供试品溶液5μL、10μL、15μL,第一麦冬薄层对照药材溶液3μL、5μL、10μL,人参薄层对照药材溶液2μL、5μL、10μL和人参薄层对照品溶液各1μL、3μL、5μL,点样于同一硅胶G薄层板(银龙硅胶G板)上,在常温常湿(T:23℃,RH:58%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果见图3、图4。
由上图可见,当人参薄层供试品点样量为10μL,第一麦冬薄层对照药材点样量为5μL,人参薄层对照药材点样量为2μL,人参薄层对照品点样量为3μL时,供试品与对照药材、对照品斑点Rf值一致且清晰,无其他干扰,因此选择点样量为人参薄层供试品溶液10μL,第一麦冬薄层对照药材溶液5μL,人参薄层对照药材溶液2μL,人参薄层对照品溶液点样量为3μL。
(2)不同温度考察
分别吸取人参薄层供试品溶液10μL、第一麦冬薄层对照药材溶液5μL、人参薄层对照药材溶液2μL和人参薄层对照品溶液3μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(银龙硅胶G板)上,按上述薄层色谱条件,分别在常温(T:23℃,RH:58%)和低温(T:6℃,RH:69%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果见图5~图8。
由上图可见,常温和低温条件下,麦门冬汤供试品分离效果都较好,且供试品色谱与对照药材、对照品色谱的相应位置显相同颜色的斑点。实验结果表明,温度对麦门冬汤-麦冬人参薄层鉴别无明显影响,说明该薄层鉴别方法对不同温度耐用性好。
(3)不同湿度考察
分别吸取人参薄层供试品溶液10μL、第一麦冬薄层对照药材溶液5μL、人参薄层对照药材溶液2μL和人参薄层对照品溶液3μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(银龙硅胶G板)上,按上述薄层色谱条件,按上述薄层色谱条件,分别在高湿(T:23℃,RH:80%)和低湿(T:23℃,RH:38%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图9~图12。
由上图可见,高湿和低湿条件下,人参薄层供试品分离效果都较好,且供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的相应位置显相同颜色的斑点。实验结果表明,湿度对麦门冬汤-麦冬人参薄层鉴别无影响,说明该薄层鉴别方法对不同湿度耐用性好。
(4)不同厂家薄层板考察
分别吸取人参薄层供试品溶液10μL、第一麦冬薄层对照药材溶液5μL、人参薄层对照药材溶液2μL和人参薄层对照品溶液3μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(默克硅胶G板、海洋硅胶G板)上,按上述薄层色谱条件,分别在常温常湿(T:23℃,RH:58%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图13~图16。
由上图可见,不同厂家硅胶G薄层板对麦门冬汤-麦冬人参薄层鉴别无显著影响,供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱显色及斑点的呈现效果较清晰稳定,说明该薄层鉴别方法对不同厂家的硅胶G薄层板的耐用性良好。
2.3不同批次麦门冬汤薄层鉴别色谱
分别吸取15批次人参薄层供试品溶液10μL、第一麦冬薄层对照药材溶液5μL、人参薄层对照药材溶液2μL和人参薄层对照品溶液3μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(银龙硅胶G板)上,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图17~图20。
由图可见,15批麦门冬汤供试品色谱和与对照药材色谱、对照品色谱在相应的位置显相同颜色的斑点。
三、麦门冬汤中麦冬、大枣、甘草的薄层色谱鉴别方法
3.1鉴别方法
(1)供试品溶液制备:取麦门冬汤冻干粉2g,研细,加水30mL使溶解,再加盐酸3mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2次,每次20mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇5mL使溶解,作为大枣薄层供试品溶液。
(2)对照药材溶液制备:取大枣对照药材1g,加水50mL煎煮30min后,过滤,煎液加盐酸3mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2次,每次20mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇2mL使溶解,得到大枣薄层对照药材溶液;
取麦冬对照药材1g,加水50mL煎煮30min后,过滤,煎液加盐酸3mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2次,每次20mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇2mL使溶解,得到第二麦冬薄层对照药材溶液;
取甘草对照药材1g,加水50mL煎煮30min后,过滤,煎液加盐酸3mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2次,每次20mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇5mL使溶解,得到甘草薄层对照药材溶液;
(3)吸取大枣薄层供试品溶液5μL,大枣薄层对照药材溶液10μL,第二麦冬薄层对照药材溶液5μL,甘草薄层对照药材溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上;以三氯甲烷-丙酮(8∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
3.2方法学验证
3.2.1专属性
取麦冬大枣双阴性麦门冬汤冻干粉2g,按照供试品溶液的制备方法制成麦冬大枣薄层双阴性样品溶液。取甘草阴性麦门冬汤冻干粉2g,按照供试品溶液的制备方法制成甘草薄层阴性样品溶液。取半夏甘草双阴性麦门冬汤冻干粉2g,按照供试品溶液的制备方法制成半夏甘草薄层双阴性样品溶液。
分别吸取大枣薄层供试品溶液3μL、第二麦冬薄层对照药材溶液3μL、大枣薄层对照药材溶液10μL、甘草薄层对照药材溶液2μL、麦冬大枣薄层双阴性样品溶液3μL、半夏甘草薄层双阴性样品溶液3μL和甘草薄层阴性样品溶液3μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(海洋硅胶G板)上,在常温常湿(T:22℃,RH:62%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图21~图22。
由图可见,供试品色谱和对照药材色谱的相应位置显相同颜色的斑点,且阴性样品无干扰,说明该薄层方法专属性好。
3.2.2耐用性
(1)不同点样量
分别吸取大枣薄层供试品溶液1μL、3μL、5μL,第二麦冬薄层对照药材溶液1μL、3μL、5μL,大枣薄层对照药材溶液5μL、10μL、15μL和甘草薄层对照药材溶液1μL、3μL、5μL,点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上,在常温常湿(T:22℃,RH:62%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果见图23~图24。
由图可见,当大枣薄层供试品点样量为3μL,第二麦冬薄层对照药材点样量为3μL,大枣薄层对照药材点样量为10μL,甘草薄层对照药材为1~2μL时,供试品与对照药材斑点Rf值一致且清晰,无其他干扰,因此选择点样量为大枣薄层供试品溶液3μL,第二麦冬薄层对照药材溶液3μL,大枣对照药材溶液10μL,甘草对照药材溶液1~2μL。
(2)不同温度
分别吸取大枣薄层供试品溶液3μL、第二麦冬薄层对照药材溶液3μL、大枣薄层对照药材溶液10μL、甘草薄层对照药材溶液2μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上,按上述薄层色谱条件,分别在常温(T:22℃,RH:62%)和低温(T:4℃,RH:69%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果见图25~图28。
由图可见,常温和低温条件下,供试品色谱分离效果都较好,且供试品色谱与对照药材色谱在相应的位置显相同颜色的斑点。实验结果表明,温度对该薄层鉴别方法无明显影响,说明该薄层鉴别方法对不同温度耐用性好。
(3)不同湿度
分别吸取大枣薄层供试品溶液3μL、第二麦冬薄层对照药材溶液3μL、大枣薄层对照药材溶液10μL、甘草薄层对照药材溶液2μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上,按上述薄层色谱条件,分别在高湿(T:21℃,RH:90%)和低湿(T:21℃,RH:30%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图29~图32。
由上图可见,高湿和低湿条件下,供试品色谱分离效果都较好,且供试品色谱与对照药材色谱在相应的位置显相同颜色的斑点。实验结果表明,湿度对该薄层鉴别方法无影响,说明该薄层鉴别方法对不同湿度耐用性好。
(4)不同厂家薄层板
分别吸取大枣薄层供试品溶液3μL、第二麦冬薄层对照药材溶液3μL、大枣薄层对照药材溶液10μL、甘草薄层对照药材溶液2μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(默克硅胶G板、海洋硅胶G板)上,按上述薄层色谱条件,分别在常温常湿(T:22℃,RH:62%)条件下展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图33~图36。
由上图可见,不同厂家硅胶G薄层板对该薄层鉴别方法无显著影响,供试品色谱与对照药材色谱的显色及斑点的呈现效果较清晰稳定,说明该薄层鉴别方法对不同厂家的硅胶G薄层板的耐用性良好。
3.3不同批次麦门冬汤薄层鉴别色谱
分别吸取15批次麦门冬汤的大枣薄层供试品溶液3μL,第二麦冬薄层对照药材溶液3μL、大枣薄层对照药材溶液10μL、甘草薄层对照药材溶液2μL,分别点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)和日光灯下检视。实验结果图37~图40。
由上图可见,15批麦门冬汤供试品和麦冬、大枣、甘草对照药材色谱在相应的位置显相同颜色的斑点。
四、麦门冬汤的UPLC-UV特征图谱构建方法
4.1色谱条件与参照物溶液、供试品溶液的制备
4.1.1色谱条件
色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters CORTECS T3,柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸为流动相B,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;柱温为30℃;检测波长在0~46min为252nm,46~54min为296nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于5000。
表5 UPLC-UV特征图谱梯度洗脱表
4.1.2对照品溶液的制备
分别精密称取甘草酸铵、甘草素、甘草苷、异甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含甘草酸20μg、甘草素35μg、甘草苷10μg、异甘草苷10μg的混合溶液,即得甘草特征图谱对照品溶液;
分别精密称取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品适量,加甲醇制成每1mL含甲基麦冬二氢高异黄酮A5μg、甲基麦冬二氢高异黄酮B 5μg的混合溶液,即得麦冬黄酮对照品溶液。
4.1.3供试品溶液的制备
取麦门冬汤冻干粉1g,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得UPLC-UV特征图谱供试品溶液。
4.1.4测定法
分别精密吸取甘草特征图谱对照品溶液1μL、麦冬黄酮对照品溶液1μL、UPLC-UV特征图谱供试品溶液2μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
其中,供试品UPLC-UV特征图谱中应呈现15个特征峰,其中6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相对应,具体的,峰2为甘草苷峰,峰5为异甘草苷峰,峰6为甘草素峰,峰10为甘草酸峰,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A峰,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B峰。选定与甘草素对照品峰相对应的峰为S1峰,计算特征峰1~峰6与S1峰的相对保留时间,选定与甘草酸对照品峰相对应的峰为S2峰,计算特征峰7~峰15与S2峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:0.55(峰1)、0.87(峰3)、0.90(峰4)、0.75(峰7)、0.80(峰8)、0.93(峰9)、1.04(峰11)、1.05(峰12)、1.08(峰13)。
4.2色谱条件的确定
4.2.1色谱柱
对不同厂家超高色谱柱进行考察,包括:Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×150mm,1.6μm);ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×150mm,1.8μm)色谱柱;BEH C18(2.1×150mm,1.7μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;柱温为30℃;进样量为2μL;检测波长在0~46分钟为252nm,46~54分钟为296nm。结果见图41。
结果显示,三个不同厂家色谱柱对各色谱峰分离效果不同,Waters CORTECS T3色谱柱对各色谱峰的分离效果较好,峰型较佳。因此,选择Waters CORTECS T3(2.1×150mm,1.6μm)作为分析色谱柱。
4.2.2最佳吸收波长
对不同吸收波长进行考察;吸收波长分别为237nm、252nm、292nm和296nm。采用Waters CORTECS T3(2.1×150mm,1.6μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;进样量为2μL;结果见图42。
通过对比4种检测波长色谱图,可发现:选取237nm作为检测波长时,第12分钟的色谱峰的响应相对较高,影响其它色谱峰的呈现效果;选取252nm作为检测波长时,整体色谱峰的响应值较为一致,但甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B在此波长下都没有紫外吸收。对比292nm和296nm检测波长时可发现:两者呈现的色谱峰效果较为一致,甘草酸的色谱峰在两波长下都没有紫外吸收,但甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B均有吸收,而且296nm下其吸收值最大。
综合以上考虑,为尽可能体现各药材的特征峰、保证各色谱峰的响应值以及保证基线平稳,选择测试时间为0~46分钟时,检测波长为252nm;测试时间为46~54分钟时,检测波长为296nm。
4.2.3流动相
对流动相中缓冲液(流动相B)的种类进行考察,分别选用0.1vol%磷酸水溶液、水;采用Waters CORTECS T3(2.1×150mm,1.6μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;柱温为30℃;进样量为2μL;检测波长在0~46分钟为252nm,46~54分钟为296nm。结果见图43。
由图可知,采用乙腈-水为流动相时,色谱图在25分钟时基线发生波动,特征峰个数减少且甘草酸色谱峰无法呈现,因此流动相B应选择0.1%磷酸溶液。
4.2.4流速
对流动相流速进行考察,流速分别为每分钟0.28mL、0.3mL、0.32mL;采用WatersCORTECS T3(2.1×150mm,1.6μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸为流动相B,按4.1.1小节的规定进行梯度洗脱;柱温为30℃;进样量为2μL;检测波长在0~46分钟为252nm,46~54分钟为296nm。结果见图44。
由图可知,流速为每分钟0.3mL时,各色谱峰分离效果较好,峰型较佳,且流速上下浮动0.02mL/min影响不大,也表明本发明的方法对流速耐用性好。
4.2.5柱温
对柱温进行考察,柱温分别为28℃、30℃、32℃;采用Waters CORTECS T3(2.1×150mm,1.6μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸为流动相B,按4.1.1小节的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;进样量为2μL;检测波长在0~46分钟为252nm,46~54分钟为296nm。结果见图45。
由图可知,柱温为30℃时,各色谱峰分离效果较好,峰型较佳,且流速上下浮动2℃皆可接受,方法柱温耐用性好。
4.2.6色谱条件的确定
根据以上实验,确定色谱条件如下:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersCORTECS T3,柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;柱温为30℃;检测波长在0~46min为252nm,46~54min为296nm。
4.3供试品溶液制备方法考察
4.3.1提取溶剂考察
本次实验分别考察不同提取溶剂对麦门冬汤UPLC-UV特征图谱的影响,分别选取100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇作为提取溶剂。通过观察麦门冬汤中15个特征峰的峰型和分离度,并计算15个特征峰的“总峰面积/称样量”比较不同提取溶剂对麦门冬汤UPLC-UV特征图谱的影响,选择最佳提取溶剂。
具体的,取同一批麦门冬汤冻干粉适量,研细,取约1.0g,平行6组,每组2份,精密称定,置50mL离心管中,分别加100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,离心,取上清液,残渣再分别加100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加入对应提取溶剂溶解并转移至5mL量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。实验结果见表6。
表6麦门冬汤冻干粉UPLC-UV特征图谱不同提取溶剂考察
结果显示:100%甲醇、100%乙醇、50%甲醇作为提取溶剂时提取不完全,其它溶剂对各特征峰的提取效果相近,各特征峰的峰型及分离效果无明显差异,其中以75%甲醇、50%乙醇为提取溶剂时,15个特征峰的“总峰面积/称样量”最大,75%甲醇作为提取溶剂时,各特征峰的峰型更佳,因此选择75%甲醇为提取溶剂。
4.3.2提取方式考察
对不同提取方式对麦门冬汤UPLC-UV特征图谱的影响进行考察,分别考察超声与回流两种提取方式,观察15个特征峰的峰型和分离度,并计算15个特征峰的“总峰面积/称样量”,比较不同提取方式对麦门冬汤UPLC-UV特征图谱的影响。
具体的,取同一批次麦门冬汤冻干粉适量,研细,取约1.0g,平行2组,每组2份,精密称定,一组置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干;另一组置具塞锥形瓶中,加75%甲醇25mL,水浴加热回流30分钟,过滤,残渣再加75%甲醇25mL,超水浴加热回流30分钟,过滤,合并两次滤液至蒸发皿中,水浴蒸至近干;加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。实验结果见表7:
表7麦门冬汤UPLC-UV特征图谱提取方式考察
结果显示:采用不同的提取方式,各特征峰的峰型、分离效果都无明显区别,而且“总峰面积/称样量”相差不大,考虑超声处理方法较为简便,故选择超声处理。
4.3.3提取时间考察
考察提取时间对麦门冬汤UPLC-UV特征图谱的影响,通过15个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同的提取时间对麦门冬汤UPLC-UV特征图谱的影响。
具体的,取麦门冬汤适量,研细,取约1.0g,平行3组,每组2份,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,分别超声处理(功率300W,频率50kHz)20、30、40分钟,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,分别超声处理(功率300W,频率50kHz)20、30、40分钟,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干;加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。实验结果见表8:
表8麦门冬汤UPLC-UV特征图谱提取时间考察
结果显示:采用不同的提取时间,15个特征峰的“总峰面积/称样量”无明显差别,为保证方法的耐用性及提取完全,选择回流提取时间为30分钟。
4.3.4供试品溶液制备方法的确定
根据上述实验结果,麦门冬汤UPLC-UV特征图谱样品前处理方法确定为:
取麦门冬汤冻干粉1g,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
4.4方法学验证
4.4.1专属性考察
取缺麦冬的阴性样品、缺甘草、半夏(法半夏)的双阴性样品和空白溶剂按供试品制备方法制备缺麦冬阴性溶液、缺甘草法半夏双阴性样品溶液。
分别取麦冬、大枣、甘草、人参、糙米、半夏对照药材适量,按照麦门冬汤煎煮方法制成单味药,取适量按供试品制备方法制备每味药材的单味对照药材参照物溶液。
分别取甘草苷、甘草酸、异甘草苷、甘草素、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B适量,加50%甲醇制备每种对照品的对照品溶液。
将UPLC-UV特征图谱供试品溶液、缺麦冬阴性溶液、缺甘草法半夏双阴性样品溶液、单味药对照药材溶液、每种对照品的对照品溶液各1~2μL注入液相色谱仪,按4.1.1小节的色谱条件进样分析,结果如图46~图48所示。
由图46~图48可知:峰1、峰2(甘草苷)、峰3、峰4、峰5(异甘草苷)、峰6(甘草素)、峰7、峰8、峰9、峰10(甘草酸)、峰11、峰12、峰13为甘草的特征成分;峰14(甲基麦冬二氢高异黄酮A)、峰15(甲基麦冬二氢高异黄酮B)为麦冬的特征成分;法半夏中检出有峰1、峰2(甘草苷)、峰10(甘草酸)、峰12该成分是由于法半夏炮制过程使用甘草药材,结合甘草药材图谱,确定该成分为甘草的成分;人参在该色谱条件下,人参皂苷紫外吸收程度较低,未能检测出来;大枣、粳米中主要成分在前15分钟被洗脱,但响应较低且色谱峰分离效果不佳,易受背景影响,故在确定的色谱条件下,无特征峰属于上述药材。
由图可知,供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处有相同的色谱峰,阴性无干扰,综上所述,说明该方法专属性良好。
4.4.2精密度考察
取同一批麦门冬汤冻干粉的UPLC-UV特征图谱供试品溶液,按4.1.1小节的色谱条件下连续进样6次,以与甘草素对照品峰相对应的峰(峰6)为S1峰,计算特征峰1~峰6与S1峰的相对保留时间和相对峰面积,与甘草酸对照品峰相对应的峰(峰10)为S2峰,计算特征峰7~峰15与S2峰的相对保留时间和相对峰面积,计算其RSD值。结果见表9~表10。
表9麦门冬汤UPLC-UV特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)
表10麦门冬汤UPLC-UV特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)
结果显示,各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.00%~0.09%范围内,相对峰面积RSD在0.18%~1.78%范围内,均小于3.0%,表明仪器精密度良好。
4.4.3重复性考察
取同批次麦门冬汤冻干粉6份,制备UPLC-UV特征图谱供试品溶液,按4.1.1小节色谱条件下测定,与甘草素对照品峰相对应的峰(峰6)为S1峰,计算特征峰1~峰6与S1峰的相对保留时间和相对峰面积,与甘草酸对照品峰相对应的峰(峰10)为S2峰,计算特征峰7~峰15与S2峰的相对保留时间和相对峰面积,计算其RSD值。结果见表11~表12。
表11麦门冬汤UPLC-UV特征图谱重复性考察结果表(相对保留时间)
表12麦门冬汤UPLC-UV特征图谱重复性考察结果表(相对峰面积)
结果显示,各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.00%~0.07%范围内,相对峰面积RSD在0.07%~2.19%范围内,均小于3.0%,表明该方法重复性良好。
4.4.4稳定性考察
取同一批麦门冬汤冻干粉的UPLC-UV特征图谱供试品溶液,按4.1.1小节的色谱条件,分别在0、2、4、8、12、18、24小时进行分析,与甘草素对照品峰相对应的峰(峰6)为S1峰,计算特征峰1~峰6与S1峰的相对保留时间和相对峰面积,与甘草酸对照品峰相对应的峰(峰10)为S2峰,计算特征峰7~峰15与S2峰的相对保留时间和相对峰面积,计算其RSD值。结果见表13~表14。
表13麦门冬汤UPLC-UV特征图谱稳定性考察结果表(相对保留时间)
表14麦门冬汤UPLC-UV特征图谱稳定性考察结果表(相对峰面积)
结果显示,各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.00%~0.06%范围内,相对峰面积RSD在0.19%~1.45%范围内,均小于3.0%,表明UPLC-UV特征图谱供试品溶液在24h内相对稳定。
4.4.5中间精密度考察
由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作,取同一批麦门冬汤冻干粉的UPLC-UV特征图谱供试品溶液,按4.1.1小节的色谱条件测定;与甘草素对照品峰相对应的峰(峰6)为S1峰,计算特征峰1~峰6与S1峰的相对保留时间和相对峰面积,与甘草酸对照品峰相对应的峰(峰10)为S2峰,计算特征峰7~峰15与S2峰的相对保留时间和相对峰面积,计算其RSD值。结果见表15~表16。
表15麦门冬汤UPLC-UV特征图谱中间精密度考察结果表(相对保留时间)
表16麦门冬汤UPLC-UV特征图谱中间精密度考察结果表(相对峰面积)
结果显示,各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.30%~1.97%范围内,相对峰面积RSD在1.65%~38.36%范围内,相对峰面积RSD值大于10.0%,建议不规定相对峰面积范围,由于各色谱峰的相对保留时间均小于3.0%,说明各特征峰中间精密度良好。
4.5不同批次样品的测定及共有峰的确定
4.5.1样品测定及共有峰确定
取15批次麦门冬汤冻干粉,按确定的供试品溶液制备方法(4.1.3小节),制得UPLC-UV特征图谱供试品溶液,在规定的色谱条件下(4.1.1小节)测得15批麦门冬汤UPLC-UV特征图谱,并进行分析。与甘草素对照品峰相对应的峰(峰6)为S1峰,计算特征峰1~峰6与S1峰的相对保留时间和相对峰面积,与甘草酸对照品峰相对应的峰(峰10)为S2峰,计算特征峰7~峰15与S2峰的相对保留时间和相对峰面积,计算其RSD值。结果见图49~图50;表17~表20。
表17 15批次麦门冬汤UPLC-UV特征图谱共有峰相对保留时间表(峰1-峰8)
表18 15批次麦门冬汤UPLC-UV特征图谱共有峰相对保留时间表(峰9-峰15)
表19 15批次麦门冬汤UPLC-UV特征图谱共有峰相对峰面积表(峰1-峰8)
表20 15批次麦门冬汤UPLC-UV特征图谱共有峰相对峰面积表(峰9-峰15)
结果表明,以甘草素色谱峰为参照峰S1,甘草酸色谱峰为参照峰S2,参照以上特征图谱结果,确定麦门冬汤UPLC-UV特征图谱标准为:供试品色谱中应呈现15个特征峰,其中6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相对应,具体的,峰2为甘草苷峰,峰5为异甘草苷峰,峰6为甘草素峰,峰10为甘草酸峰,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A峰,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B峰。与甘草素对照品峰相对应的峰为S1峰,与甘草酸对照品峰相对应的峰为S2峰,计算峰1~峰6与S1峰的相对保留时间、峰7~峰15与S2峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:0.55(峰1)、0.87(峰3)、0.90(峰4)、0.75(峰7)、0.80(峰8)、0.93(峰9)、1.04(峰11)、1.05(峰12)、1.08(峰13)、1.24(峰14)、1.26(峰15)。
15批麦门冬汤共有峰相对保留时间RSD值在0.00%~0.08%范围内,相对峰面积RSD值在12.7%~57.8%范围内。由此可见,不同产地不同批次药材制备的麦门冬汤共有峰相对保留时间稳定,而相对峰面积差异较大,可见其成分种类稳定,但含量差异较大。
4.5.2特征图谱相似性评价
将15批麦门冬汤冻干粉的UPLC-UV特征图谱cdf格式导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”(2012版)软件中,计算各个特征图谱的相似度,结果见表21~表22。
表21 15批麦门冬汤UPLC-UV特征图谱相似度(S1-S6,S11,S14)
表22 15批麦门冬汤UPLC-UV特征图谱相似度(S7-S10,S12,S13,S15)
结果表明,以甘草素色谱峰(峰6)为参照峰S1,甘草酸色谱峰(峰10)为参照峰S2,按平均数法生成对照图谱,建立麦门冬汤冻干粉对照特征图谱(图49),得到麦门冬汤特征图谱叠加图谱(见图50),计算相似度,15份麦门冬汤特征图谱相似度在0.993~0.999之间,相似度较高。
4.6UPLC-UV特征图谱的化学成分试验研究
根据麦门冬汤方中各药味所含化学成分,采用高分辨质谱,对麦门冬汤所含化学成分进行高分辨质谱指认。
质谱条件:UHPLC-Q-Orbitrap液质联用系统:Ultimate 3000型超高效液相色谱仪(美国Thermo公司)串联Thermo Q Exactive型高分辨质谱(美国Thermo FisherScientific公司,美国,型号:UltiMate 3000-Q-Orbitrap),数据处理系统为Xcalibar 4.1工作站(美国Thermo Fisher Scientific公司),在线数据库分析软件:Compound Discover3.1(美国Thermo Fisher Scientific公司)。Waters CORTECS T3(2.1mm×150mm,1.6μm)色谱柱。HESI离子源,正、负离子监测模式;裂解电压3.80kV;辅助气流量10mL/min;离子传输管温度320℃;辅助气温度350℃;扫描模式Full MS/dd-MS2,Full MS分辨率70000,dd-MS2分辨率17500;质量扫描范围m/z 100~1500。MS/MS模式时,正负离子模式下的碰撞能分别为20和40eV以亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin)为内标校正质量精度。
色谱条件:Waters CORTECS T3(2.1mm×150mm,1.6μm)色谱柱;流动相:以乙腈为流动相A,0.1%甲酸为流动相B,按表23规定进行梯度洗脱;流速:0.3mL/min;柱温:30℃,检测波长在0~46min为252nm,46~54min为296nm。
供试品溶液:按4.1.3小节方法制备。
对照品溶液:按4.1.2小节方法制备。
表23UPLC-UV特征图谱化学成分指认梯度洗脱表
相关色谱峰的明确指认:采用上述色谱和质谱分析条件,分别对UPLC-UV特征图谱供试品溶液和甘草特征图谱对照品溶液进行检测。通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及与对照品进行比对,共确定了6个色谱峰所对应的化合物,分别为甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸铵、甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B。采用上述色谱和质谱分析条件,对供试品溶液和对照品溶液进行检测。通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及二级质谱信息、与对照品进行比对以及结合文献资料,共确定了41个化合物,供试品和对照品的总离子流图见图51~图52,详细鉴定结果详见表24【表中,*表示通过对照品指认;1#为(3β,18α,22β)-22-Acetoxy-24,30-dihydroxy-11,30-dioxoolean-12-en-3-yl2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosiduronicacid;2#:18β-Olean-12-ene-11-oxo-3β,30-diol-3-O-β-D-glucuronopyranosyl(1->2)β-D-glucuronopyranoside)】。
表24麦门冬汤UPLC-UV特征图谱成分指认结果
五、麦门冬汤的HPLC-ELSD特征图谱构建方法
5.1色谱条件与对照品溶液、供试品溶液的制备
5.1.1色谱条件
色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XBridge BEH C18,3.0mm×150mm,2.5μm);以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按表25中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.45mL;柱温为32℃;气体流速为每分钟3.0L,漂移管温度为100℃。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。
表25麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱梯度洗脱表
5.1.2对照品溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,加50%甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品各0.10mg,人参皂苷Rb1对照品0.15mg的混合溶液,即得人参皂苷对照品溶液。
精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd适量,加50%甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rd对照品各0.02mg、人参皂苷Rf对照品0.03mg、人参皂苷Rb2对照品0.09mg,即得人参皂苷混合对照品溶液。
5.1.3供试品溶液的制备
取麦门冬汤冻干粉1.6g,精密称定,置150mL锥形瓶中,加水50mL,水饱和正丁醇30mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇萃取2次,每次30mL,合并正丁醇层溶液至蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加50%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液。
5.1.4测定法
分别精密吸取人参皂苷对照品溶液15μL、HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液15μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
其中,供试品HPLC-ELSD特征图谱中应呈现8个特征峰,其中3个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相对应,具体的,峰1为人参皂苷Rg1峰,峰2为人参皂苷Re峰,峰4为人参皂苷Rb1峰。选定与人参皂苷Rb1对照品峰相对应的峰为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内;规定值为:0.87(峰3)、1.08(峰5)、1.19(峰6)、1.33(峰7)、1.35(峰8)。
5.2色谱条件的确定
5.2.1色谱柱
对不同填料普高色谱柱进行考察,包括:Waters XBridge BEH C18色谱柱(3.0×150mm,2.5μm);Waters XBridge C18(4.6×250mm,5.0μm)色谱柱;Waters Xselect HSS T3(3.0×150mm,2.5μm)色谱柱;Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×150mm,5.0μm)色谱柱。以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按“1色谱条件”中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.45mL;柱温为32℃;气体流速为每分钟3.0L,漂移管温度为100℃。结果见图54。
结果显示,四个不同填料色谱柱对各色谱峰分离效果不同,Waters XBridge BEHC18色谱柱能分离重要成分人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对各色谱峰的分离效果较好,峰型较佳。因此,选择Waters XBridge BEH C18,3.0mm×150mm,2.5μm)作为分析色谱柱。
5.2.2流速
对流动相流速进行考察,流速分别为每分钟0.43mL、0.45mL、0.47mL;采用WatersXBridge BEH C18(3.0mm×150mm,2.5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按5.1.1小节的规定进行梯度洗脱;柱温为32℃;气体流速为每分钟3.0L,漂移管温度为100℃。结果见图55。
由图可知,流速为每分钟0.45mL时,各色谱峰分离效果较好,峰型较佳,且流速上下浮动0.02mL/min影响不大,也表明本发明的方法对流速耐用性好。
5.2.3柱温
对柱温进行考察,柱温分别为30℃、32℃、34℃;采用Waters XBridge BEH C18(3.0mm×150mm,2.5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按5.1.1小节的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.45mL;气体流速为每分钟3.0L,漂移管温度为100℃。结果见图56。
由图可知,柱温为32℃时,各色谱峰分离效果较好,峰型较佳,且流速上下浮动2℃皆可接受,方法柱温耐用性好。
5.2.4色谱条件的确定
根据以上实验,确定色谱条件如下:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersXBridge BEH C18,3.0mm×150mm,2.5μm);以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按表25中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.45mL;柱温为32℃;气体流速为每分钟3.0L,漂移管温度为100℃。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。
5.3供试品溶液制备方法考察
5.3.1提取溶剂考察
分别选取100%甲醇、水/水饱和正丁醇作为提取溶剂,考察提取溶剂对麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱的影响。
具体的,取麦门冬汤冻干粉适量,研细,取约1.6g,平行2组,每组2份,精密称定,置具塞锥形瓶中,一组分别精密加入甲醇50mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,过滤,蒸干,残渣加水50mL使溶解;用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次30mL,合并正丁醇液,蒸干;另一组分别加水50mL,水饱和正丁醇30mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇振摇提取2次,每次30mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加50%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。实验结果见表26。
表26麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱不同提取溶剂考察
结果显示:先用甲醇提取再用水饱合正丁醇萃取与直接采用水饱合正丁醇溶剂萃取对各特征峰的提取效果相近,各特征峰的峰型及分离效果无明显差异,其中直接水饱合正丁醇溶剂为提取溶剂时,15个特征峰的“总峰面积/称样量”最大,水/水饱合正丁醇作为提取溶剂时,各特征峰的峰型更佳,因此选择水/水饱合正丁醇为提取溶剂。
5.3.2提取时间考察
考察提取时间对麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱的影响,通过特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同的提取时间对麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱的影响。
具体的,取麦门冬汤冻干粉适量,研细,取约1.6g,平行3组,每组2份,精密称定,置150mL锥形瓶中,加水50mL,水饱和正丁醇30mL,分别超声处理(功率300W,频率50kHz)15、30、45分钟,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇振摇提取2次,每次30mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加50%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。实验结果见表27。
表27麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱提取时间考察
结果显示:采用不同的提取时间,8个特征峰的“总峰面积/称样量”无明显差别,超声目的是为了样品更好的溶解到水层,为保证方法的耐用性及提取完全,选择回流提取时间为30分钟。
5.3.3提取次数考察
考察提取次数对麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱的影响,通过特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同的提取次数对麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱的影响。
具体的,取麦门冬汤冻干粉适量,研细,取约1.6g,平行3组,每组2份,精密称定,置150mL锥形瓶中,加水50mL,水饱和正丁醇30mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇振摇提取2次、3次和4次,每次30mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加50%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。实验结果见表28。
表28麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱提取次数考察
实验结果表明:样品提取2次以上才能保证样品提取完全,但是样品提取3和提取4次时,8个特征峰的“总峰面积/称样量”无明显差别,为保证方法的耐用性及提取完全,选择提取次数为3次。
5.3.4供试品溶液制备方法的确定
综上所述,最终确定供试品溶液的制备方法为:
取麦门冬汤冻干粉适量,研细,取约1.6g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水50mL,水饱和正丁醇30mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30分钟,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇振摇提取2次,每次30mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加50%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
5.4方法学验证
5.4.1专属性考察
分别取缺麦冬的阴性样品,缺人参的阴性样品,按照5.1.3小节的方法制备麦冬阴性样品溶液和人参阴性样品溶液。
分别取麦冬、大枣、甘草、人参、糙米、法半夏随行对照药材适量,按照麦门冬汤煎煮方法制成单味药,取适量按5.1.3小节的方法制备每味药材的对照药材参照物溶液。
分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量,按照5.1.2小节的方法制备。
将HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液、麦冬阴性样品溶液、人参阴性样品溶液、单味药随行对照药材溶液、人参皂苷对照品溶液各1~2μL注入液相色谱仪,按色谱条件进样分析,结果如图57~图58所示。
由图58可知:峰1(人参皂苷Rg1)、峰2(人参皂苷Re)、峰3、峰4(人参皂苷Rb1)、峰5、峰6、峰8为人参的特征成分;峰7为麦冬的特征成分;粳米、法半夏和大枣的成分基本检测不出,法半夏和甘草中主要成分在前15分钟被洗脱,但响应较低且色谱峰分离效果不佳,故在确定的色谱条件下,无特征峰属于上述药材。
由图可知,供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处有相同的色谱峰,阴性无干扰,综上所述,说明该方法专属性良好。
5.2.2精密度考察
取人参皂苷对照品溶液,在规定色谱条件下连续进样6次,计算各色谱峰的保留时间和峰面积并计算RSD值。结果见表29、表30。
表29麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)
表30麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)
结果显示,各特征峰的保留时间RSD在0.07%~0.08%范围内,峰面积RSD在1.66%~1.95%范围内,均小于3.0%,表明仪器精密度良好。
5.2.3重复性考察
取同批次麦门冬汤冻干粉6份,制备HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液,按5.1.1小节色谱条件下测定,以人参皂苷Rb1峰(峰4)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积并计算RSD值。结果见表31、表32。
表31麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱重复性考察结果表(相对保留时间)
表32麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱重复性考察结果表(相对峰面积)
结果显示,供试品特征色谱中峰1、峰2、峰4分别与相应的对照品峰保留时间相对应,具体的,峰1为人参皂苷Rg1峰,峰2为人参皂苷Re峰,峰4为人参皂苷Rb1峰。选定与人参皂苷Rb1对照品峰相对应的峰为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.03%~0.05%范围内,均小于3.0%,表明该方法重复性良好。相对峰面积RSD在3.94%~10.65%范围内,均大于3.0%,建议不规定相对峰面积范围。
5.2.4稳定性考察
取同一批麦门冬汤冻干粉的HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液,按5.1.1小节的色谱条件,分别在0、2、4、6、8、12、24小时进行分析,以人参皂苷Rb1峰(峰4)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积并计算RSD值。结果见表33、表34。
表33麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱稳定性考察结果表(相对保留时间)
表34麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱稳定性考察结果表(相对峰面积)
结果显示,供试品特征色谱中峰1、峰2、峰4分别与相应的对照品峰保留时间相对应,具体的,峰1为人参皂苷Rg1峰,峰2为人参皂苷Re峰,峰4为人参皂苷Rb1峰。选定与人参皂苷Rb1对照品峰相对应的峰为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.04%~0.11%范围内,均小于3.0%,表明供试品溶液在24h内相对稳定。相对峰面积RSD在1.22%~11.65%范围内,大于10.0%,建议不规定相对峰面积范围。
5.5不同批次样品的测定及共有峰的确定
5.5.1样品测定及共有峰确定
取15批次麦门冬汤冻干粉,按确定的供试品溶液制备方法(5.1.3小节),制得HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液,在规定的色谱条件下(5.1.1小节)测得15批麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱,并进行分析。以人参皂苷Rb1为参照峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见图59~图60,表35、表36。
表35 15批次麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱共有峰相对保留时间表
表36 15批次麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱共有峰相对峰面积表
结果表明,以人参皂苷Rb1色谱峰为参照峰S,参照以上特征图谱结果,确定麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱标准为:供试品色谱中应呈现8个特征峰,其中3个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相对应,与人参皂苷Rb1对照品峰相对应的峰为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:0.87(峰3)、1.08(峰5)、1.19(峰6)、1.33(峰7)、1.35(峰8)。
15批麦门冬汤共有峰相对保留时间RSD值在0.05%~0.69%范围内,相对峰面积RSD值在15.69%~92.85%范围内。由此可见,不同产地不同批次药材制备的麦门冬汤共有峰相对保留时间稳定,而相对峰面积差异较大,可见其成分种类稳定,但含量差异较大。
5.5.2特征图谱相似性评价
将15批麦门冬汤冻干粉的HPLC-ELSD特征图谱cdf格式导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”(2012版)软件中,计算各个特征图谱的相似度,结果见表37~表38。
表37 15批麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱相似度(S1~S8)
表38 15批麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱相似度(S9-S15)
结果表明,以人参皂苷Rb1(峰4)为参照峰S,按平均数法生成对照图谱,建立麦门冬汤冻干粉对照特征图谱(图59),得到麦门冬汤特征图谱叠加图谱(见图60),计算相似度,15批麦门冬汤特征图谱相似度在0.974~1.000之间,相似度较高。
5.6HPLC-ELSD特征图谱的化学成分试验研究
根据麦门冬汤方中各药味所含化学成分,采用高分辨质谱,对麦门冬汤所含化学成分进行高分辨质谱指认。
质谱条件:UHPLC-Q-Orbitrap液质联用系统:Ultimate 3000型超高效液相色谱仪(美国Thermo公司)串联Thermo Q Exactive型高分辨质谱(美国Thermo FisherScientific公司,美国,型号:UltiMate 3000-Q-Orbitrap),数据处理系统为Xcalibar 4.1工作站(美国Thermo Fisher Scientific公司),在线数据库分析软件:Compound Discover3.1(美国Thermo Fisher Scientific公司)。Waters XBridge BEH C18(3.0mm×150mm,2.5μm)色谱柱。HESI离子源,正、负离子监测模式;裂解电压3.80kV;辅助气流量10mL/min;离子传输管温度320℃;辅助气温度350℃;扫描模式Full MS/dd-MS2,Full MS分辨率70000,dd-MS2分辨率17500;质量扫描范围m/z 100~1500。MS/MS模式时,正负离子模式下的碰撞能分别为20和40eV以亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin)为内标校正质量精度。
色谱条件:Waters XBridge BEH C18(3.0mm×150mm,2.5μm)色谱柱;流动相:以乙腈为流动相A,水为流动相B,按表39规定进行梯度洗脱;流速:0.45mL/min;柱温:32℃。
供试品溶液:按5.1.3小节方法制备。
对照品溶液:按5.1.2小节方法制备。
表39 HPLC-ELSD特征图谱化学成分指认梯度洗脱表
相关色谱峰的明确指认:采用上述色谱和质谱分析条件,分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测。通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及与对照品进行比对,共确定了7个色谱峰所对应的化合物。其中,人参皂苷Rc、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2和人参皂苷Re 7个化合物分别与对照品的色谱保留行为及质谱精确分子量信息进行了比对验证。采用上述色谱和质谱分析条件,对供试品溶液和对照品溶液进行检测。通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及二级质谱信息、与对照品进行比对以及结合文献资料,共确定了42个化合物,供试品和对照品溶液总离子流图见图61~图62,详细鉴定结果详见表40【表中,*表示通过对照品指认,3#为(1β,3β,16α,17α,25R)-3-Hydroxyspirost-5-en-1-yl 3,4,6-tri-O-acetyl-2-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-galactopyranoside】。
表40麦门冬汤HPLC-ELSD特征图谱成分指认结果
六、麦门冬汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量的测定方法
6.1测定方法
6.1.1色谱条件
同4.1.1小节;即以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters CORTECS T3,柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸为流动相B,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;柱温为30℃;检测波长在0~46min为252nm,46~54min为296nm。
6.1.2对照品溶液的制备
分别精密称取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品适量,加甲醇制成每1mL含甲基麦冬二氢高异黄酮A5μg、甲基麦冬二氢高异黄酮B 5μg的混合溶液,即得麦冬黄酮对照品溶液。
6.1.3供试品溶液的制备
同4.1.3小节,即取麦门冬汤冻干粉1g,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得麦冬黄酮供试品溶液。
6.1.4测定法
分别吸取麦冬黄酮供试品溶液2μL、麦冬黄酮对照品溶液1μL,注入液相色谱仪,测定,以外标两点法计算甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量,即得。
6.2方法学验证
6.2.1专属性考察
取缺麦冬的阴性样品按供试品制备方法制备缺麦冬阴性溶液。取麦冬黄酮供试品溶液、缺麦冬阴性溶液、麦冬黄酮对照品溶液与空白溶剂注入液相色谱仪,按6.1.1小节的色谱条件测定,结果如图64所示。
从图中可以看出,空白溶剂、缺麦冬阴性溶液的色谱中,在与甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B相应的保留时间没有色谱峰,说明溶剂和组方中其他组份对甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B的测定无干扰,以本法测定麦门冬汤冻干粉中甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量具有专属性。
6.2.2线性关系考察
精密称定甲基麦冬二氢高异黄酮A对照品2.198mg和甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品2.331mg,分别置10mL容量瓶中,加甲醇制成每1mL含甲基麦冬二氢高异黄酮A218.108μg和每1mL含甲基麦冬二氢高异黄酮B 231.026μg的对照品贮备溶液,精密量取不同体积上述对照品贮备溶液,逐级稀释,得到不同浓度级别甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品溶液。
甲基麦冬二氢高异黄酮A对照品浓度分别为每1mL含54.527μg、27.263μg、13.632μg、10.905μg、5.453μg、2.726μg、1.363μg的对照品溶液和甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品浓度分别为每1mL含115.513μg、57.756μg、23.103μg、11.551μg、5.776μg、2.888μg、1.444μg的对照品溶液,分别精密吸取上述7个不同浓度的混合对照品溶液1μL进样,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y),对照品浓度为横坐标(x),并绘制标准曲线。
其中,甲基麦冬二氢高异黄酮A的回归方程为:y=10268x-147,其相关系数R2=1.0000,表明甲基麦冬二氢高异黄酮A在进样浓度1.363~54.527μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
其中,甲基麦冬二氢高异黄酮B的回归方程为:y=9181.9x+1080.4,其相关系数R2=1.0000,表明甲基麦冬二氢高异黄酮B在进样浓度1.444~115.513μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
6.2.3纯度考察
精密吸取麦冬黄酮供试品溶液和麦冬黄酮对照品溶液各1μL注入液相色谱仪,按6.1.1小节的色谱条件以UV检测器进行190~400nm扫描检测,计算供试品和对照品中甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B峰纯度。结果见表41。
表41麦冬黄酮供试品溶液中麦冬黄酮的峰纯度
结果显示,麦门冬汤冻干粉中的甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B峰纯度分别为999和992,均大于990,表明麦门冬汤冻干粉中甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B峰纯度良好。
6.2.4精密度考察
精密吸取浓度为甲基麦冬二氢高异黄酮A6.5285μg/mL,甲基麦冬二氢高异黄酮B6.5872μg/mL的混合对照品溶液,按6.1.1小节的色谱条件重复进样6次,以甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B峰面积,计算其RSD值。
结果显示,甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B峰面积RSD分别为0.63%和0.58%,说明仪器精密度良好。
6.2.5稳定性考察
精密吸取同一麦冬黄酮供试品溶液10μL,分别在0、2、4、8、12、18、24小时进样1次,测定供试品溶液中甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积,计算RSD值。
结果显示24小时内甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积RSD分别为0.15%和0.38%,说明供试品溶液在24小时内稳定可测。
6.2.6重复性考察
取同一批次麦门冬汤冻干粉,平行6份,按照6.1.3小节的方法制备麦冬黄酮供试品溶液,按6.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定供试品溶液中甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量,计算含量RSD值。
实验结果显示,甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量的RSD分别为2.90%和2.40%,表明该分析方法的重复性良好。
6.2.7中间精密度考察
选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2),取同一批次麦门冬汤冻干粉,平行6份,按照6.1.3小节的方法制备麦冬黄酮供试品溶液,按6.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定供试品溶液中甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量,与重复性项下结果比较。
实验结果表明,不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作,甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量RSD分别为3.67%和2.04%,该分析方法中间精密度较好。
6.2.8准确度考察
采用加样回收法,取已知含量的麦门冬汤冻干粉样品约0.5g,精密称定,平行称定9份,3份一组,分别按照样品含量0.5:1.0、1.0:1.0、1.5:1.0加入甲基麦冬二氢高异黄酮A及甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品,按6.1.3小节的制备方法制备麦冬黄酮供试品溶液9份,并分别测定,计算加样回收率,结果见表42。
表42麦门冬汤麦冬黄酮含量测定加样回收率结果
结果显示,甲基麦冬二氢高异黄酮A的加样回收率范围85.131%~103.258%,平均加样回收率为98.107%,RSD为5.78%,甲基麦冬二氢高异黄酮B的加样回收率范围为88.203%~102.328%,平均加样回收率为95.183%,RSD为5.59%,说明该方法准确度良好。
6.3样品测定
取不同批次(S1~S15)麦门冬汤冻干粉样品适量,分别按照6.1.3小节的方法制备麦冬黄酮供试品溶液。按6.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定不同批次麦冬黄酮供试品溶液中甲基麦冬二氢高异黄酮A及甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量。结果如表43所示。
表43不同批次麦门冬汤麦冬黄酮含量测定结果
根据上述结果,确定麦门冬汤中应控制甲基麦冬二氢高异黄酮A的含量为0.001%~0.004%,转移率为6.5%~20.3%;甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量为0.002%~0.011%,转移率为7.0%~19.0%。
七、麦门冬汤中甘草苷和甘草酸含量的测定方法
7.1测定方法
7.1.1色谱条件
同4.1.1小节;即以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters CORTECS T3,柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸为流动相B,按表5中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3mL;柱温为30℃;检测波长在0~46min为252nm,46~54min为296nm。
7.1.2对照品溶液的制备
分别精密称取甘草酸铵、甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含甘草酸20μg、甘草苷10μg的混合溶液,即得甘草对照品溶液;
7.1.3供试品溶液的制备
同4.1.3小节,即取麦门冬汤冻干粉1g,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得甘草供试品溶液。
7.1.4测定法
分别精密吸取甘草对照品溶液、甘草供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,测定,以外标两点法计算甘草苷、甘草酸的含量,即得。
7.2方法学验证
7.2.1专属性考察
取缺甘草的阴性样品和缺甘草法半夏的双阴性样品按7.1.3小节的方法制备缺甘草阴性溶液和缺甘草法半夏双阴性溶液。分别取甘草酸供试品溶液、缺甘草阴性溶液、缺甘草法半夏双阴性溶液、甘草酸对照品溶液注入液相色谱仪,按7.1.1小节的色谱条件测定,结果如图65所示。
从图中可以看出,缺甘草阴性样品色谱图中在与甘草苷和甘草酸相应的保留时间有色谱峰,说明用甘草炮制成的法半夏存在少量的甘草成分,但缺甘草法半夏双阴性样品色谱图中在与甘草苷和甘草酸相应的保留时间没有色谱峰,说明溶剂对甘草苷和甘草酸的测定无干扰,以本法测定麦门冬汤冻干粉中甘草苷和甘草酸的含量具有专属性。
7.2.2线性关系考察
精密称定甘草苷对照品1.992mg和甘草酸铵对照品3.577mg,置10mL容量瓶中,加甲醇制成每1mL含甘草苷185.455μg和每1mL含甘草酸342.386μg的混合对照品贮备液,分别稀释2、4、8、16、32倍得到5种不同浓度的混合对照品溶液,甘草苷对照品浓度分别为每1mL含92.728μg、46.364μg、23.182μg、11.591μg、5.7955μg的对照品溶液和甘草酸对照品浓度分别为每1mL含171.193μg、85.596μg、42.798μg、21.399μg、10.700μg的对照品溶液,分别精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液10μL进样,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y),对照品浓度为横坐标(x),并进行拟合。
其中,甘草苷的回归方程为:y=19964.6472x+17802.8060,其相关系数R2=1.0000,表明甘草苷在进样浓度5.795~185.455μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。甘草酸的回归方程为:y=5419.8515x+1292.2736,其相关系数R2=0.9999,表明甘草酸在进样浓度10.700~342.386μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
7.2.3纯度考察
精密吸取甘草酸供试品溶液和甘草酸对照品溶液各1μL注入液相色谱仪,按7.1.1小节的色谱条件以UV检测器进行190~400nm扫描检测,计算供试品和对照品中甘草苷和甘草酸峰纯度。结果见表44。
表44甘草酸供试品溶液中甘草苷和甘草酸的峰纯度
结果显示,麦门冬汤冻干粉中的甘草苷和甘草酸峰纯度分别为999.1和999.7,均大于990,表明麦门冬汤冻干粉中甘草苷、甘草酸峰纯度良好。
7.2.4精密度考察
吸取甘草苷浓度为26.6499μg/mL,甘草酸浓度为55.8040μg/mL的混合对照品溶液,按7.1.1小节的色谱条件重复进样6次,测定甘草酸、甘草苷的峰面积,并计算RSD值。实验结果显示,甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为1.17%和1.11%,说明仪器精密度良好。
7.2.5稳定性考察
精密吸取同一批次的甘草酸供试品溶液10μL,按7.1.1小节的色谱条件,分别在0、2、4、8、12、24小时进样1次,测定甘草酸供试品溶液中甘草苷和甘草酸的峰面积,计算RSD值。
结果显示24小时内甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.97%和0.64%,说明供试品溶液在24小时内稳定可测。
7.2.6重复性考察
取同一批次麦门冬汤冻干粉,平行6份,按照7.1.3小节的供试品制备方法制备供试品溶液,按7.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定甘草酸供试品溶液中甘草苷和甘草酸的含量,计算含量RSD值。
实验结果显示,甘草苷和甘草酸含量的RSD分别为1.42%和1.77%,表明该分析方法的重复性良好。
7.2.7中间精密度考察
选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2),取同一批次麦门冬汤,平行6份,按照7.1.3小节的供试品制备方法制备供试品溶液,按7.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定甘草酸供试品溶液中甘草苷和甘草酸含量,与重复性项下结果比较。
实验结果表明,不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作,甘草苷和甘草酸含量RSD分别为1.32%和2.23%,该分析方法中间精密度较好。
7.2.8准确度试验
采用加样回收法,取已知含量的样品约0.4g,精密称定,平行称定9份,3份一组,分别按照样品含量0.5:1.0、1.0:1.0、1.5:1.0加入甘草苷及甘草酸对照品,按甘草苷甘草酸供试品制备方法制备供试品溶液9份,并分别测定,计算加样回收率,结果见表45。
表45麦门冬汤甘草苷甘草酸含量测定加样回收率结果
结果显示,甘草苷的加样回收率范围为96.80%~99.35%,平均加样回收率为98.16%,RSD为1.01%,甘草酸的加样回收率范围为96.40%~102.37%,平均加样回收率为98.13%,RSD为1.86%,说明该方法准确度良好。
7.3样品测定
取不同批次(S1~S15)麦门冬汤冻干粉适量,按7.1.3小节的方法分别制备甘草酸供试品溶液;按7.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定不同批次麦门冬汤下供试品溶液中甘草酸和甘草苷的含量。结果如表46所示。
表46不同批次麦门冬汤中甘草苷和甘草酸含量测定结果
根据上述结果,确定麦门冬汤中应控制甘草苷的含量为0.014%~0.093%,转移率为12.9%~93.3%;甘草酸的含量为0.058%~0.183%,转移率为19.1%~78.3%。
八、麦门冬汤中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1含量的测定方法8.1测定方法
8.1.1色谱条件
同5.1.1小节,即以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XBridge BEH C18,3.0mm×150mm,2.5μm);以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按表25中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.45mL;柱温为32℃;气体流速为每分钟3.0L,漂移管温度为100℃。
8.1.2对照品溶液的制备
同5.1.2小节,即精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,加50%甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品各0.10mg,人参皂苷Rb1对照品0.15mg的混合溶液,即得人参皂苷对照品溶液。
8.1.3供试品溶液的制备
同5.1.3小节,即取麦门冬汤冻干粉1.6g,精密称定,置150mL锥形瓶中,加水50mL,水饱和正丁醇30mL,超声处理(功率300W,频率50kHz)30min,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇萃取2次,每次30mL,合并正丁醇层溶液至蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加50%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得人参皂苷供试品溶液。
8.1.4测定法
分别精密吸取人参皂苷供试品溶液15μL,人参皂苷对照品溶液5、10、15μL,注入液相色谱仪,测定,以外标两点法对数方程计算人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品的含量,即得。
8.2方法学验证
8.2.1专属性考察
取缺人参的阴性样品按供试品制备方法制备缺人参阴性样品溶液。
将人参皂苷供试品溶液、缺人参阴性溶液与人参皂苷对照品溶液注入液相色谱仪,按8.1.1小节的色谱条件测定。结果如图66所示:
从图中可以看出,阴性样品色谱图中在与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1相应的保留时间没有色谱峰,说明溶剂和组方中其他组份对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的测定无干扰,以本法测定麦门冬汤冻干粉中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量具有专属性。
8.2.2线性关系考察
精密称定人参皂苷Rg1对照品5.187mg、人参皂苷Re对照品3.186mg和人参皂苷Rb1对照品7.005mg,分别置10mL容量瓶中,加50%甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1对照品479.279μg、每1mL含人参皂苷Re对照品297.572μg和每1mL含人参皂苷Re对照品638.856μg的对照品贮备溶液,精密量取不同体积上述对照品贮备溶液,逐级稀释,得到不同浓度级别人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品溶液。
人参皂苷Rg1对照品浓度分别为每1mL含479.279μg、239.639μg、119.820μg、59.910μg、29.955μg、11.982μg的对照品溶液,人参皂苷Re对照品浓度分别为每1mL含297.572μg、148.786μg、74.393μg、37.197μg、18.598μg、7.439μg的对照品溶液和人参皂苷Rb1对照品浓度分别为每1mL含638.856μg、319.428μg、159.714μg、79.857μg、39.929μg、15.971μg的对照品溶液,分别精密吸取上述6个不同浓度的混合对照品溶液15μL进样,记录色谱峰面积。以Log峰面积为纵坐标(y),Log进样量为横坐标(x),进行拟合。
其中,人参皂苷Rg1的回归方程为:y=1.7001x+5.6154,其相关系数R2=0.999,表明人参皂苷Rg1在进样浓度11.982~479.279μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
人参皂苷Re的回归方程为:y=1.7729x+5.6053,其相关系数R2=0.999,表明人参皂苷Re在进样浓度7.439~297.572μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
人参皂苷Rb1的回归方程为:y=1.7448x+5.6232,其相关系数R2=0.999,表明人参皂苷Re在进样浓度15.971~638.856μg/mL的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
8.2.3精密度考察
精密吸取浓度为C人参皂苷Rg1=104.5044μg/mL,C人参皂苷Re=116.75μg/mL和C人参皂苷Rb1=179.664μg/mL的混合对照品溶液,按8.1.1小节的色谱条件进样5μL,重复6次,以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积,计算其RSD值。
结果显示,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为1.18%、1.44%和0.84%,说明仪器精密度良好。
8.2.4稳定性考察
精密吸取同一人参皂苷供试品溶液15μL,分别在0、2、4、8、12、18、24小时进样1次,测定供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的峰面积,计算RSD值。
结果显示24小时内人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的峰面积RSD分别为1.83%、2.88%和2.27%,说明人参皂苷供试品溶液在24小时内稳定可测。
8.2.5重复性考察
取同一批次麦门冬汤,平行6份,按8.1.3小节的方法制备人参皂苷供试品溶液,按8.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量,计算含量RSD值。
实验结果显示,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1含量的RSD分别为2.11%、2.72%和2.25%,表明该分析方法的重复性良好。
8.2.6准确度试验
采用加样回收法,取已知含量的样品约0.8g,精密称定,平行称定9份,3份一组,分别按照样品含量0.5:1.0、1.0:1.0、1.5:1.0加入人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品,按人参皂苷供试品制备方法制备供试品溶液9份,并分别测定,计算加样回收率,结果见表47。
表47麦门冬汤人参皂苷含量测定加样回收率结果
结果显示,人参皂苷Rg1的加样回收率范围99.95%~107.88%,平均加样回收率为102.82%,RSD为3.02%,人参皂苷Re的加样回收率范围为98.64%~106.49%,平均加样回收率为102.02%,RSD为3.16%,人参皂苷Re的加样回收率范围为99.07%~107.53%,平均加样回收率为103.56%,RSD为2.42%,说明该方法准确度良好。
8.3样品测定
取不同批次麦门冬汤适量,分别按照8.1.3小节的方法制备得到人参皂苷供试品溶液;按8.1.1小节的色谱条件进行测定,分别进样,测定不同批次人参皂苷供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量的含量。结果如表48所示。
表48不同批次麦门冬汤中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量测定结果
根据上述结果,确定麦门冬汤中应控制人参皂苷Rb1的含量为0.001%~0.050%,转移率为57.3%~98.2%;人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量为0.019%~0.100%,转移率为53.4%~96.5%。
以上所述是发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (27)
1.一种麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦门冬汤由以下组分组成:麦冬、法半夏、人参、甘草、粳米和大枣;所述建立方法包括:
(1)采用薄层色谱法对麦冬、人参、大枣、甘草进行鉴别;
(2)构建特征图谱对麦门冬汤中的成分进行鉴别;
(3)测定麦门冬汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷、甘草酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
2.如权利要求1所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,采用薄层色谱法对麦冬、人参同时进行鉴别,采用薄层色谱法对麦冬、大枣、甘草同时进行鉴别;
构建UPLC-UV特征图谱以对麦门冬汤中黄酮类成分进行鉴别,同时,测定甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷和甘草酸的含量;
构建HPLC-ELSD特征图谱以对麦门冬汤中皂苷类成分进行鉴别,同时,测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
3.如权利要求2所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦冬、人参的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤制剂,加溶剂提取或溶解后得到人参薄层供试品溶液;
(2)分别取麦冬对照药材、人参对照药材,加溶剂提取或溶解后分别得到第一麦冬薄层对照药材溶液和人参薄层对照药材溶液;
(3)取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品,加甲醇溶解,得到人参薄层对照品溶液;
(4)分别吸取人参薄层供试品溶液、第一麦冬薄层对照药材溶液、人参薄层对照药材溶液和人参薄层对照品溶液,点于同一硅胶G板上,以三氯甲烷、甲醇和水的混合溶液为展开剂,展开;供试品色谱中,在与对照药材及对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
4.如权利要求3所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦冬、人参的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤制剂1~3g,研细,加水20~50mL,超声溶解,溶液用水饱和正丁醇振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并正丁醇液,加2~4倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇0.5~1.5mL使溶解,作为人参薄层供试品溶液;
(2)取麦冬对照药材1~3g,加水30~80mL,加热煮沸20~60分钟,离心,取上清液,上清液用水饱和正丁醇振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并正丁醇液,加2~4倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇0.5~1.5mL使溶解,作为第一麦冬薄层对照药材溶液;
取人参对照药材1~3g,加水30~80mL,加热煮沸20~60分钟,离心,取上清液,上清液用水饱和正丁醇振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并正丁醇液,加2~4倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上层液蒸干,残渣加甲醇0.5~1.5mL使溶解,作为人参薄层对照药材溶液;
(3)取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品,加甲醇制成每1mL各含1mg人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rg1对照品的混合溶液,作为人参薄层对照品溶液;
(4)吸取人参薄层供试品溶液5~15μL,第一麦冬薄层对照药材溶液3~8μL,人参薄层对照药材溶液和人参薄层对照品溶液各1~3μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为13:7:2的三氯甲烷、甲醇和水的混合溶液的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,分别置日光和波长为365nm的紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
5.如权利要求2所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦冬、甘草、大枣的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤制剂,加溶剂提取或溶解后得到大枣薄层供试品溶液;
(2)分别取大枣对照药材、麦冬对照药材、甘草对照药材,加溶剂提取或溶解后分别得到大枣薄层对照药材溶液、第二麦冬薄层对照药材溶液和甘草薄层对照药材溶液;
(3)分别吸取大枣薄层供试品溶液、大枣薄层对照药材溶液、第二麦冬薄层对照药材溶液和甘草薄层对照药材溶液,点于同一硅胶G板上,以三氯甲烷、丙酮的混合溶液为展开剂,展开;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
6.如权利要求5所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦冬、甘草、大枣的薄层色谱鉴别方法为:
(1)取麦门冬汤试剂1.0~3.0g,研细,加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇3~8mL使溶解,作为大枣薄层供试品溶液;
(2)取大枣对照药材0.5~1.5g,加水30~80mL煎煮20~60min后,过滤,煎液加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1~3mL使溶解,得到大枣薄层对照药材溶液;
取麦冬对照药材0.5~1.5g,加水30~80mL煎煮20~60min后,过滤,煎液加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1~3mL使溶解,得到第二麦冬薄层对照药材溶液;
取甘草对照药材0.5~1.5g,加水30~80mL煎煮20~60min后,过滤,煎液加水20~50mL使溶解,再加盐酸2~5mL,加热回流1小时,放冷,滤过,滤液用乙醚振摇提取2~5次,每次15~30mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇3~8mL使溶解,得到甘草薄层对照药材溶液;
(3)吸取大枣薄层供试品溶液3~8μL,第二麦冬薄层对照药材溶液3~8μL,大枣薄层对照药材溶液5~15μL和甘草薄层对照药材溶液1~3μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为8:1的三氯甲烷、丙酮的混合溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,分别置日光和波长为365nm的紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点或荧光斑点。
7.如权利要求2所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述UPLC-UV特征图谱的构建方法为:
(1)取甘草酸铵、甘草素、甘草苷、异甘草苷对照品,加入溶剂溶解或提取,制得甘草特征图谱对照品溶液;
取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品,加入溶剂溶解或提取,制得麦冬黄酮对照品溶液;
(2)取麦门冬汤制剂,加提取溶剂提取,制得UPLC-UV特征图谱供试品溶液;
(3)取预设量的甘草特征图谱对照品溶液、麦冬黄酮对照品溶液和UPLC-UV特征图谱供试品溶液,注入液相色谱仪,所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱,构建麦门冬汤的UPLC-UV特征图谱,并测定麦冬门汤中甲基麦冬二氢高异黄酮A对照品、甲基麦冬二氢高异黄酮B、甘草苷和甘草酸含量。
8.如权利要求7所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述梯度洗脱按下述程序进行:
0~8min,流动相A从5%→18%,流动相B从95%→82%;
8~11min,流动相A从18%→20%,流动相B从82%→80%;
11~21min,流动相A从20%→21%,流动相B从80%→79%;
21~23min,流动相A从21%→28%,流动相B从79%→72%;
23~29min,流动相A从28%→30%,流动相B从72%→70%;
29~38min,流动相A从30%→38%,流动相B从70%→62%;
38~47min,流动相A从38%→55%,流动相B从62%→45%;
47~54min,流动相A从55%→65%,流动相B从45%→35%。
9.如权利要求7所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(3)中,分别吸取甘草特征图谱对照品溶液、麦冬黄酮对照品溶液和UPLC-UV特征图谱供试品溶液各1~3μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以0.08vol%~0.12vol%的磷酸水溶液为流动相B,流速为0.28~0.32mL/min;柱温为28~32℃,检测波长为250~300nm。
10.如权利要求9所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(3)中,分别吸取甘草特征图谱对照品溶液1μL、麦冬黄酮对照品溶液1μL和UPLC-UV特征图谱供试品溶液2μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm;所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以0.1vol%的磷酸水溶液为流动相B;流速为0.3mL/min;柱温为30℃,检测波长为252~296nm。
11.如权利要求7所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述UPLC-UV特征图谱的构建方法中,当检测时间为0~46分钟时,检测波长为252nm;检测时间为46~54分钟时,检测波长为296nm。
12.如权利要求7所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(1)中,取甘草酸铵、甘草素、甘草苷、异甘草苷对照品,加甲醇制成每1mL含甘草酸20μg、甘草素35μg、甘草苷10μg、异甘草苷10μg的混合溶液,即得甘草特征图谱对照品溶液;
分别精密称取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品适量,加甲醇制成每1mL含甲基麦冬二氢高异黄酮A5μg、甲基麦冬二氢高异黄酮B 5μg的混合溶液,即得麦冬黄酮对照品溶液。
13.如权利要求7所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(2)中,所述提取溶剂为75vol%甲醇或50vol%乙醇,提取时间为20~40min,提取方式为超声提取或回流提取。
14.如权利要求13所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(2)包括:
取麦门冬汤制剂1g,精密称定,置50mL离心管中,加75%甲醇25mL,超声处理30min,离心,取上清液,残渣再加75%甲醇25mL,超声处理30min,离心,合并两次提取上清液至蒸发皿中,水浴蒸至近干,加75%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得UPLC-UV特征图谱供试品溶液。
15.如权利要求7所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述UPLC-UV特征图谱包括15个特征峰;其中,峰2为甘草苷峰,峰5为异甘草苷峰,峰6为甘草素峰,峰10为甘草酸峰,峰14为甲基麦冬二氢高异黄酮A峰,峰15为甲基麦冬二氢高异黄酮B峰;
以峰6为S1峰,峰1~峰6与S1峰的相对保留时间在第一规定值的±10%之内;所述第一规定值:峰1为0.55、峰2为0.56、峰3为0.87、峰4为0.90、峰5为0.94、峰6为1.00;
以峰10为S2峰,峰7~峰15与S2峰的相对保留时间在第二规定值的±10%之内;所述第二规定值为:峰7为0.75、峰8为0.80、峰9为0.93、峰10为1.00、峰11为1.04、峰12为1.05、峰13为1.08、峰14为1.24、峰15为1.26。
16.如权利要求2所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述HPLC-ELSD特征图谱的构建方法为:
(1)取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品,加入溶剂溶解或提取,制得人参皂苷对照品溶液;
(2)取麦门冬汤制剂,加提取溶剂提取,制得HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液;
(3)取预设量的人参皂苷对照品溶液和HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液,注入液相色谱仪,所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,水为流动相B进行梯度洗脱,构建麦门冬汤的HPLC-ELSD特征图谱,并测定麦冬门汤中人参皂苷Rb1、人参皂苷Re和人参皂苷Rg1含量。
17.如权利要求16所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述梯度洗脱按下述程序进行:
0~15min,流动相A从19%→21%,流动相B从81%→79%;
15~20min,流动相A从21%→30%,流动相B从79%→70%;
20~32min,流动相A从30%→31%,流动相B从70%→69%;
32~40min,流动相A从31%→38%,流动相B从69%→62%;
40~45min,流动相A从38%→41%,流动相B从62%→59%;
45~55min,流动相A从41%→85%,流动相B从59%→15%。
18.如权利要求16所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(3)中,分别吸取人参皂苷对照品溶液和HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液各5~15μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其柱温为30~34℃;所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以水为流动相B,流速为0.43~0.47mL/min;所述液相色谱仪的检测器的气体流速为2.5~3.5L/min,漂移管温度为90~110℃。
19.如权利要求18所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(3)中,分别吸取人参皂苷对照品溶液和HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液各15μL,注入液相色谱仪进行检测,所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,其柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为1.6μm,柱温为32℃;所述液相色谱仪以乙腈为流动相A,以水为流动相B,流速为0.45mL/min;所述液相色谱仪的检测器的气体流速为3L/min,漂移管温度为100℃。
20.如权利要求16所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(1)中,取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,加50%甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品各0.10mg,人参皂苷Rb1对照品0.15mg的混合溶液,即得人参皂苷对照品溶液。
21.如权利要求16所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(2)中,所述提取溶剂为水和水饱和正丁醇,提取时间为15~45min,提取次数为3~4次,提取方式为超声提取或萃取提取。
22.如权利要求16所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,步骤(2)包括:
取麦门冬汤制剂1~2g,研细,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水20~80mL,水饱和正丁醇20~50mL,超声处理20~40分钟,转移至分液漏斗中,分取上层溶液,下层溶液加水饱和正丁醇萃取2~4次,每次20~50mL,合并正丁醇层溶液至蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加40~60%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得HPLC-ELSD特征图谱供试品溶液。
23.如权利要求16所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述HPLC-ELSD特征图谱包括8个特征峰;其中,峰1为人参皂苷Rg1峰,峰2为人参皂苷Re峰,峰4为人参皂苷Rb1峰;
以峰4为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间在第三规定值的±10%范围之内;其中,所述第三规定值为:峰3为0.87,峰5为1.08,峰6为1.19,峰7为1.33,峰8为1.35。
24.如权利要求1所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,还包括:
(4)将麦门冬汤蒸干,测定其出膏率;
(5)测定麦门冬汤的浸出物。
25.如权利要求1所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦门冬汤由以下重量份的组分组成:麦冬130.55份,法半夏18.65份,人参7.46份,甘草7.46份,粳米5.60份,大枣9.70份。
26.如权利要求1所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦门冬汤的制备方法为:取麦冬、法半夏、人参、甘草、粳米和大枣,以水浸泡,武火煮沸,文火沸腾后经筛网滤过即得。
27.如权利要求26所述的麦门冬汤物质基准的建立方法,其特征在于,所述麦门冬汤的制备方法为:取麦冬130.55g,法半夏18.65g,人参7.46g,甘草7.46g,粳米5.60g,大枣9.70g,加水2400mL浸泡,武火煮沸,文火沸腾至药液为1100~1300mL,经筛网滤过即得。
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吴茵 等: "玄麦甘桔颗粒化学成分的UPLC-Q-TOF-MS快速分析方法", 《中国实验方剂学杂志》 * |
段瑞 等: "高效液相色谱-蒸发光散射法测定红药片中三七皂苷R_1及人参皂苷Rg_1、Re、Rb_1的含量", 《沈阳药科大学学报》 * |
高菲 等: "复方刺五加颗粒的质量控制", 《中国医院药学杂志》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114441685A (zh) * | 2022-02-08 | 2022-05-06 | 湖南新汇制药股份有限公司 | 一种重楼标准汤剂质量检测方法 |
CN114441685B (zh) * | 2022-02-08 | 2023-06-27 | 湖南新汇制药股份有限公司 | 一种重楼标准汤剂质量检测方法 |
CN115343383A (zh) * | 2022-07-18 | 2022-11-15 | 神威药业集团有限公司 | 沙参麦冬汤中8种化学成分的含量测定方法 |
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