CN109374789B - 黄柏药材hplc特征图谱的构建方法和检测方法 - Google Patents

黄柏药材hplc特征图谱的构建方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法和检测方法。该构建方法包括：参照物溶液制备：制备黄柏对照药材参照物溶液，盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱对照品参照物溶液；供试品溶液制备：制备黄柏药材供试品溶液，汤剂供试品溶液；高效液相色谱测试：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、药材供试品溶液、汤剂供试品溶液，注入液相色谱仪，比较所得药材供试品图谱与汤剂供试品图谱，确定水溶性共有峰，获得黄柏药材的HPLC特征图谱。该构建方法获得的HPLC特征图谱不仅能定性、定量分析黄柏药材的质量优劣，还能以此为参照反映黄柏标准汤剂的质量。

Description

黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法和检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法和检测方法。
背景技术
黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮。具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的功效，用于湿热泻痢，黄疽尿赤，带下阴痒，热淋涩痛，骨蒸劳热，盗汗，疮疡肿毒，湿疹湿疮等病症。黄柏主要有效成分为生物碱类，包括小檗碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀，其中小檗碱、黄柏碱具有抗炎、抗菌、解热镇痛等药理作用，是其主要的药理活性成分。其具有较强的临床应用价值，市场需求广阔，被开发成中药配方颗粒及相关复方制剂广泛用于临床。
中药的临床使用多以传统汤剂为主。中药汤剂的物质基础，是中医理论指导下防治疾病的基础。现行的法定标准仅针对单一成分进行定量控制，量效关系不能全面反映中药成分的整体作用。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，中药指纹图谱/特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。
《中国药典》2015年版将小檗碱、黄柏碱作为黄柏质量评价指标，仅对小檗碱、黄柏碱含量进行控制并不能全面反映其质量。目前文献研究报道的关于黄柏指纹图谱多采用的是常规的HPLC法，且均只针对原药材的物质基础，指标成分多以脂溶性成分为研究对象，不能全部反映中药汤剂的物质基础特征。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法。该构建方法获得的HPLC特征图谱不仅能定性、定量分析黄柏药材的质量优劣，还能以此为参照反映黄柏标准汤剂的质量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，所述的构建方法包括：
参照物溶液制备：取黄柏对照药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品，精密称定，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；
供试品溶液制备：取黄柏药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为药材供试品溶液；取黄柏标准汤剂，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为标准汤剂供试品溶液；
高效液相色谱测试：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、药材供试品溶液、标准汤剂供试品溶液，注入液相色谱仪，比较所得药材供试品图谱与汤剂供试品图谱，确定水溶性共有峰，获得黄柏药材的HPLC特征图谱。
在其中一些实施例中，供试品溶液制备中，所述的黄柏药材来自全国黄柏产量较大的4个道地或主要产区共22批次样品及不同基原的关黄柏药材4批，样品具有充分的代表性。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈为流动相A，0.35~0.45mol/L NH4Cl溶液为流动相B，采用梯度洗脱；
洗脱梯度包括：0min ~5min，5%流动相A，95%流动相B；5min ~ 40 min，5%→25%流动相A，95%→75%流动相B；40 min ~45 min，25%→35%流动相A，75%→65%流动相B；50 min ~51 min，55%→5%流动相A，45%→95%流动相B；51 min ~65 min，5%流动相A，95%流动相B。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：
固定相：Waters symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；
流动相：乙腈为流动相A，0.4mol/L NH4Cl溶液为流动相B，采用梯度洗脱；
洗脱梯度包括：0 min ~5min, 5%流动相A, 95%流动相B；5 min ~ 40 min，5%→25%流动相A，95%→75%流动相B；40 min ~45 min，25%→35%流动相A，75%→65%流动相B；50min ~51 min，55%→5%流动相A，45%→95%流动相B；51 min ~65 min，5%流动相A，95%流动相B。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：检测波长为210nm~280nm，柱温为25℃~35℃，流速为0.8ml/L~1.2ml/L。
在其中一些实施例中，所述检测波长为210nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/L。
在其中一些实施例中，参照物溶液制备、供试品溶液制备中，所述提取采用的溶剂为水、体积分数为50%的甲醇溶液、甲醇、体积分数为50%的乙醇溶液、乙醇、乙腈与体积分数为0.1％磷酸溶液按体积比为36：64的混合溶液、乙腈与体积分数为0.1％磷酸溶液按体积比为50：50的混合溶液；所述提取的方式采用超声或者加热回流。
在其中一些实施例中，所述提取采用的溶剂为体积分数为50%的甲醇溶液；所述提取的方式采用超声。
本发明的另一目的是提供一种黄柏药材的检测方法，所述的检测方法包括：
参照物溶液制备：取黄柏对照药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品，精密称定，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；
供试品溶液制备：取待测黄柏药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为待测药材溶液；
高效液相色谱测试：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、待测药材溶液，注入液相色谱仪，确定水溶性共有峰，获得待测药材HPLC图谱；比较所述待测药材HPLC图谱与上述构建的HPLC特征图谱。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈为流动相A，0.35 mol/L ~0.45mol/L NH4Cl溶液为流动相B，采用梯度洗脱；
洗脱梯度包括：0 min ~5min，5%流动相A, 95%流动相B；5 min ~ 40 min，5%→25%流动相A，95%→75%流动相B；40 min ~45 min，25%→35%流动相A，75%→65%流动相B；50 min~51 min，55%→5%流动相A，45%→95%流动相B；51 min ~65 min，5%流动相A，95%流动相B。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：
固定相：Waters symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；
流动相：乙腈为流动相A，0.4mol/L NH4Cl溶液为流动相B，采用梯度洗脱；
洗脱梯度包括：0 min ~5min，5%流动相A，95%流动相B；5 min ~ 40 min，5%→25%流动相A，95%→75%流动相B；40 min ~45 min，25%→35%流动相A，75%→65%流动相B；50 min~51 min，55%→5%流动相A，45%→95%流动相B；51 min ~65 min，5%流动相A，95%流动相B。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明同时以黄柏对照药材、酸小檗碱对照品和盐酸黄柏碱对照品为参照物，配合合适的色谱条件，通过对黄柏药材和黄柏标准汤剂图谱的比较确黄柏药材HPLC特征图谱。该特征图谱不仅能用于定性、定量分析黄柏药材的质量，而且能够确保采用该药材制备的黄柏传统汤剂的质量，也适用于检测汤剂的质量。具体地，本发明在构建黄柏药材HPLC特征图谱的过程中：通过合适的色谱条件，在构建黄柏药材HPLC特征图谱时引入黄柏标准汤剂的特征图谱进行比较分析，针对其汤剂与药材共有的水溶性成分特征成分（4个水溶性特征成分，分别为3-O-阿魏酰奎尼酸、5-O阿魏酰奎尼酸、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱成分；）进行研究，并作为黄柏药材特征图谱特征峰确定的依据，并且水溶性成分色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好；本发明同时采用了对照品、对照药材双重对照，可以有效克服液相条件指纹图谱固有存在的耐用性偏差问题，更加全面，实现对真伪、不同基原的鉴别。
另外，采用本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对黄柏药材多个特征成分的质量监控，既提升了黄柏药材的质量控制水平，又提升和稳定黄柏药材的内在质量；为临床提供符合黄柏标准汤剂要求的原料，为黄柏相关的制剂工艺生产过程提供重要的多指标参数依据。
附图说明
图1、黄柏药材对照特征图谱；
图2、黄柏对照药材图谱；
图3、黄柏药材、标准汤剂对照特征图谱；
图4、22批黄柏标准汤剂特征图谱的叠加图；
图5、22批黄柏药材特征图谱的叠加图；
图6、黄柏药材3D色谱图；
图7、黄柏药材210nm色谱图；
图8、黄柏药材265nm色谱图；
图9、黄柏药材280nm色谱图；
图10、采用乙腈-0 .4mol/L NH4Cl作为流动相所得黄柏药材色谱图；
图11、优化洗脱条件下所得黄柏药材色谱图；
图12、黄柏药材特征图谱提取溶剂考察结果；
图13、黄柏药材特征图谱提取方式考察结果；
图14、不同提取时间色谱图；
图15、22批次黄柏药材共有模式图；
图16、黄柏药材特征图谱；
图17、黄柏药材特征图谱专属性考察；
图18、整体性色谱图；
图19、不同柱温考察色谱图；
图20、不同流速考察色谱峰；
图21、不同色谱柱色谱图；
图22、黄柏药材对照特征图谱(浓度：每毫升相当于0 .002g药材) ；
图23、关黄柏药材特征图谱；
图24、黄柏药材、关黄柏药材特征图谱对比图；
图25、关黄柏药材特征图谱；
图26、供试品溶液与3个对照品溶液色谱峰叠加图；
图27、色谱峰指认对应的质谱图；
图28、实施例3所涉黄柏药材的色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、黄柏药材的HPLC特征图谱的构建方法
本实施例提供一种黄柏药材的HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
（1）参照物溶液的制备
取黄柏对照药材0.1g，置具塞锥形瓶中，加50%（v/v）甲醇溶液50ml，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
另取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.1mg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
（2）供试品溶液的制备
取黄柏药材约0.1g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，作为黄柏药材供试品溶液。
取黄柏标准汤剂，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，作为标准汤剂供试品溶液。
本发明所述的黄柏标准汤剂，是通过如下制备方法制备的：
取黄柏药材，清洗，粗碎。取黄柏饮片100g，加水煎煮二次，第一次加10倍量水，浸泡30分钟，武火（500W）加热至沸腾后，文火（200W）保持微沸30分钟，用350目筛网趁热过滤，滤液用冷水浴迅速冷却至室温；第二次加8倍量水，武火加热至沸后，文火保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液用冷水浴迅速冷却至室温，合并两次滤液；将滤液转移至旋转蒸发仪中减压低温浓缩（温度：65℃；转速：70～90r/min-1；压力：真空度-0.10）至约150ml；在磁力搅拌下，分装至10ml西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，半加塞，放至冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。
本实施例药材来源：收集了共22批黄柏原药材，其中来自四川17批、广西4批、重庆2批、贵州1批。
Figure 821787DEST_PATH_IMAGE001
（3）测定法
照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定。分别精密吸取对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、黄柏药材供试品溶液、标准汤剂供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，其中，色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.4mol/L的NH4Cl溶液为流动相B；按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为210nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于8000。
表2、梯度洗脱表
Figure 43821DEST_PATH_IMAGE002
供试品色谱中应呈现5个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的5个特征峰保留时间相对应，其中2个峰应分别与对照品参照物峰保留时间相对应；与盐酸小檗碱参照物相应的峰为S峰，计算峰1、2、3与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.34（峰1）、0.37（峰2）、0.45（峰3）；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对保留保留峰面积应在规定范围内，规定值为：0.021~0.075（峰1）、0.085~0.52（峰2）、0.015~0.064（峰3）、0.24~0.40（峰4）。结果参见图1、图2、图3、图4、图5。图中，峰1：3-O-阿魏酰奎尼酸；峰2：5-O阿魏酰奎尼酸；峰4：盐酸黄柏碱；峰5（S）：盐酸小檗碱。
实施例2、黄柏药材的HPLC特征图谱构建条件的确定
1 特征图谱
黄柏是芸香科黄檗属植物黄皮树的干燥树皮是传统中药黄柏的基源植物。主要含小檗碱、木兰碱、黄柏碱、掌叶防己碱等多种生物碱及内酯、甾醇、粘液质等。小檗碱类生物碱为黄柏中的主要有效成分，具抗菌作用,而黄柏碱为川黄柏中的特征成分。经过研究，采用HPLC建立了黄柏药材指纹图谱,为黄柏药材的质量控制提供有效的方法。
1.1仪器、试剂与试药
仪器：Waters高效液相色谱仪（沃特斯公司，Waters e2695），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），phenomenex Gemini NX-C18（4.6×250mm，5μm），Waters symmetryC18（4.6×250mm，5μm），万分之一天平（梅特勒-托利多公司，ME204E），百万分之一天平（梅特勒-托利多公司，XP26）。
试剂：乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯），液相用乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯。
试药：盐酸小檗碱（中国食品药品检定研究院，含量：86.8%，批号：110713-201613）；盐酸黄柏碱（中国食品药品检定研究院，94.9%，批号：111895-201504）；研究所用22批药材样品信息如表1；方法学考擦用黄柏药材（批号：HB01）。
1.2色谱条件的确定
（1）最佳吸收波长的确定
黄柏主要有效成分为生物碱类，其吸收波长主要有210nm、265nm、280nm，在进行全波扫描后对各波长出峰情况进行对比，确定最佳吸收波长。
供试品溶液制备：取黄柏药材粉末（批号HB01）0.1g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物溶液制备：参照实施例1。
色谱条件：Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器；Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1%（v/v）磷酸溶液为流动相B，按下表规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl。
表3、梯度洗脱表
Figure 348026DEST_PATH_IMAGE003
实验结果表明：根据DAD全波扫描结果发现（见图6），色谱峰主要在22分钟以前出峰；分析多个波长处的色谱图发现（见图7、图8、图9），210nm处出峰数量最多，色谱峰分离度及峰型较好，故确定采用210nm作为检测波长，并对该色谱条件进行优化。
（2）流动相的考察
在确定的检测波长条件下，对色谱条件的流动相进行优化。
供试品溶液制备：取黄柏药材粉末（批号HB01）0.1g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物溶液制备：参照实施例1。
色谱条件：Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸、以乙腈-0.4mol/L NH4Cl为流动相，按下表规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl；检测波长为210nm。
表4、梯度洗脱表
Figure 641604DEST_PATH_IMAGE004
结果：采用乙腈-0.4mol/LNH4Cl作为流动相所得色谱图信息更丰富，使生物碱类的色谱峰形较好，确定采用乙腈-0.4mol/L NH4Cl作为黄柏药材色谱图的流动相（见图谱10）。
（3）梯度条件进行优化：
色谱条件：Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；乙腈-0.4mol/LNH4Cl溶液为流动相，按下表规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl；检测波长为210nm。
表5、梯度洗脱表
Figure 26449DEST_PATH_IMAGE005
根据实验结果可知（见图11），优化后梯度条件能够使色谱峰得到较好的分离，色谱峰分布均匀，色谱图信息更丰富，且基线相对平稳，故确定为黄柏药材特征图谱色谱条件。
（4）最终确定色谱条件的包括：
色谱条件：Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈-0.4mol/LNH4Cl溶液为流动相，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl；检测波长为210nm。
表6、梯度洗脱表
Figure 137493DEST_PATH_IMAGE006
1.3 参照物溶液的制备
取黄柏碱、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL分别含黄柏碱150μg、盐酸小檗碱100μg的混合溶液，即得。
取黄柏药材约0.1g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.4 供试品溶液的制备考察
（1）提取溶剂考察
本次实验分别考察了不同提取溶剂对黄柏药材色谱图的影响，选取水、50（v/v）%甲醇溶液、甲醇、稀乙醇（体积分数为50%的乙醇溶液）、乙醇、黄柏碱含量测定流动相（中国药典2015版黄柏项中黄柏碱含量测定流动相）、小檗碱流含量测定动相（中国药典2015版黄柏项中小檗碱含量测定流动相）作为提取溶剂，对不同提取溶剂样品进行HPLC色谱分析，确定最佳提取溶剂。
取黄柏药材粉末（批号HB01）0.1g，精密称定，平行7份，置100mL锥形瓶中，分别精密加入水、50%甲醇、甲醇、稀乙醇（体积分数为50%的乙醇溶液）、乙醇、黄柏碱流动相、小檗碱流动相50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用水、50%甲醇、甲醇、稀乙醇（体积分数为50%的乙醇溶液）、乙醇、黄柏碱流动相（乙腈-0.1％磷酸溶液(36：64)）、小檗碱流动相（乙腈-0.1％磷酸溶液(50：50)）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
按“1.2”项下确定的色谱条件，进样，记录色谱图，计算特征峰峰面积/称样量、总特征峰面积/称样量，实验结果见下表、图12。结果表明，采用上述几种溶剂制备样品得到的色谱图，各色谱图中峰个数没有差异，峰面积及峰型有一定的差异，乙醇和小檗碱流动相作为提取溶剂时，峰1和峰4峰型差，比较水、甲醇和乙醇提取溶剂，以50%甲醇提取各特征峰及总峰峰面积/称样量均较大，与黄柏碱流动相提取效果相当；综合考虑溶剂的提取能力、溶液的稳定性和溶剂效应，选择50%（v/v）甲醇溶液作为提取溶剂。
表7、不同提取溶剂考察结果
Figure 302895DEST_PATH_IMAGE007
（2）提取溶剂方式考察
分别考察不同提取方式对黄柏药材特征图谱的影响，本研究选取超声提取和加热回流两种提取方式进行对比。
取黄柏药材粉末（批号HB01）0.1g，精密称定，平行2份，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，分别超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟、水浴回流30分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照“1.2”项下确定的色谱条件，进样，记录特征图谱，计算特征峰面积/称样量、总特征峰面积/称样量，实验结果见下表、图13。结果表明，超声和回流提取峰型无明显差别，加热回流的“总特征峰面积/称样量”差异不大，考虑到操作的简便性，采用超声提取方式。
表8、不同提取方式结果
Figure 275530DEST_PATH_IMAGE008
（3）提取时间考察
取黄柏药材粉末（批号HB01）0.1g，精密称定，平行3份，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，分别超声处理（功率250W，频率40kHz）20分钟、30分钟、40分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照“1.2”项下确定的色谱条件，进样，记录特征图谱，计算特征峰面积/称样量、总特征峰面积/称样量，实验结果见下表、图14。结果表明，超声处理20分钟、30分钟和40分钟，其“总特征峰面积/称样量”相差不大，峰型无明显差异，综合考虑，30分钟是较为合适的提取时间。
表9、不同提取时间结果
Figure 842778DEST_PATH_IMAGE009
（4）供试品溶液制备的确定
由上述实验考察结果，最终确定黄柏药材特征图谱的供试品溶液制备方法为：取黄柏药材粉末适量，取约0.1g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.5 黄柏药材特征图谱建立
取22批黄柏药材，按“1.2”项下确定的色谱条件与“1.4”项下确定的供试品制备方法，对22批黄柏药材进行HPLC分析，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行结果分析，选择其共有峰，再以盐酸小檗碱峰为参照峰（即S峰），选择其中相对保留时间和相对峰面积较为稳定的共有峰作为特征峰（图15、图16）。图15中，S1-S29依次为HB01~HB29。图16中，峰1：3-O-阿魏酰奎尼酸；峰2：5-O阿魏酰奎宁酸；峰4：盐酸黄柏碱；峰5（S）：盐酸小檗碱。
色谱仪：Waters e2695液相色谱仪；色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱
实验结果：对22批黄柏药材特征图谱进行分析，可确定的共有峰为：峰1（未知）、峰2（未知）、峰3（未知）、峰4（盐酸黄柏碱）、峰5（盐酸小檗碱）。
1.6 方法学验证
（1）专属性考察
精密吸取黄柏药材供试品溶液、参照物溶液与50%（v/v）甲醇溶液（阴性对照）各10μl，注入液相色谱仪，按“1.2”项下色谱条件测定。结果见图17。图17中，峰1：3-O-阿魏酰奎尼酸；峰2：5-O阿魏酸奎宁酸；峰4：盐酸黄柏碱；峰5（S）：盐酸小檗碱。实验结果表明，该分析方法能准确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂的干扰。
（2）整体性考察
精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，按照“1.2”项下确定的色谱条件，在梯度终点（去除后平衡时间）的流动相比例下再延长60分钟，进样，考察后续是否有杂质影响，记录色谱图，结果见图18。实验结果表明，延长的60分钟除了空白溶剂峰之外没有其他色谱峰出现，说明后续没有杂质的影响，本方法整体性良好。
（3）精密度试验
精密吸取供试品溶液，按照“1.2”项下确定的色谱条件，重复进样6次，记录色谱图，以与盐酸小檗碱参照物相应的峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表。实验结果表明，峰1至峰5的相对保留时间和相对峰面积RSD<2%，仪器精密度良好。
表10、精密度实验结果（相对保留时间）
Figure 422926DEST_PATH_IMAGE010
表11、精密度实验结果（相对峰面积）
Figure 950990DEST_PATH_IMAGE011
（4）稳定性试验
精密吸取供试品溶液，按照“1.2”项下确定的色谱条件，分别在0h，4h，8h，16h，20h，24h进样，记录色谱图，以盐酸小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表。各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD<3%，供试液在24小时内稳定性良好。
表12、稳定性试验结果（相对保留时间）
Figure 507743DEST_PATH_IMAGE012
表13、稳定性试验结果（相对峰面积）
Figure 195076DEST_PATH_IMAGE013
（5）重复性和中间精密度考察
取同一批黄柏药材粉末（过四号筛，批号HB01）适量，取约0.1g，共6份，精密称定，按照“1.4”项下确定的方法制备供试品溶液，按照“1.2”项下确定的色谱条件，进样，记录色谱图；两个不同的实验操作者，分别在不同的仪器，不同时间点，同一色谱柱按照同一色谱条件采用重复性样品进样，考察中间精密度。以盐酸小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，重复性结果见下表；中间精密度结果见下表。结果表明，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD<3%，该方法的重复性良好。
表14、重复性试验结果（相对保留时间）
Figure 133076DEST_PATH_IMAGE014
表15、重复性试验结果（相对峰面积）
Figure 695907DEST_PATH_IMAGE015
表16、中间精密度实验结果（相对保留时间）
Figure 400558DEST_PATH_IMAGE016
表17、中间精密度实验结果（相对峰面积）
Figure 552184DEST_PATH_IMAGE017
结果表明，在不同样品制备人员、不同制备时间和不同仪器分析条件下，各特征峰相对保留时间的RSD<3%，该方法中间精密度良好。
（6）耐用性考察
①不同柱温考察
采用Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱和Waters e2695液相色谱仪，按照“1.2”项下色谱条件，分别在25℃、30℃、35℃不同柱温下，进样，记录色谱图，以盐酸小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表、图19。结果表明，用上述3种温度对样品进行检测时，特征峰相对保留时间的RSD为2.013%~3.111%，特征峰相对峰面积的RSD为0.703%~9.578%。柱温对各峰相对保留时间影响较小，但对个色谱峰的相对峰面积有较大影响，峰3在柱温为25℃时峰面积略小于柱温为30℃和40℃，30℃和40℃的柱温对峰3峰面积没有显著影响，综合考虑选择30℃为特征图谱柱温。
表18、不同柱温考察结果（相对保留时间）
Figure 51299DEST_PATH_IMAGE018
表19、不同柱温考察结果（相对峰面积）
Figure 803223DEST_PATH_IMAGE019
②不同流速考察
采用Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱和Waters e2695液相色谱仪，按照“1.2”项下确定的色谱条件，分别用0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min不同流速，进样测定，记录色谱图，以盐酸小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表，图20。结果表明，3种不同流速特征峰相对保留时间的RSD为2.141%~3.835%，特征峰相对峰面积的RSD为0.141%~4.220%。表明该分析方法不同流速耐用性较好。流速小的变动能满足系统适应性要求。
表20、不同流速考察结果（相对保留时间）
Figure 452510DEST_PATH_IMAGE020
表21、不同流速考察结果（相对峰面积）
Figure 197657DEST_PATH_IMAGE021
③不同色谱柱考察
分别采用不同型号的色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），phenomenex Gemini NX-C18（4.6×250mm，5μm），Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）在同一色谱仪上，按照“1.2”项下色谱条件，进样，记录色谱图，以盐酸小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表，图21。结果表明，3种不同色谱柱特征峰相对保留时间的RSD为0.938%~3.003%，特征峰相对峰面积的RSD为0.169%~5.384%。由图可知，Waters symmetry C18色谱柱所得色谱图中色谱峰峰形良好，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱所得色谱图中目标峰峰型较差，在phenomenex Gemini NX-C18色谱柱所得色谱图中未知峰1的峰型较差，建议选择Waters symmetry C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱进行测定。
表22、不同色谱柱考察结果（相对保留时间）
Figure 54623DEST_PATH_IMAGE022
表23、不同色谱柱考察结果（相对峰面积）
Figure 778997DEST_PATH_IMAGE023
2 黄柏药材特征图谱的确定
对22批黄柏药材特征图谱进行分析，以盐酸小檗碱峰为参照峰，计算其相对峰面积与相对保留时间，实验结果见下表。
表24、22批黄柏药材特征图谱结果（相对保留时间）
Figure 982708DEST_PATH_IMAGE024
表25、22批黄柏药材特征图谱结果（相对峰面积）
Figure 499139DEST_PATH_IMAGE025
将22批黄柏药材特征图谱通过匹配，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成对照图谱，建立黄柏药材对照特征图谱，如图22所示。图22中，峰1：3-O-阿魏酰奎尼酸；峰2：5-O阿魏酰奎尼酸；峰4：盐酸黄柏碱；峰5（S）：盐酸小檗碱，浓度：每毫升相当于0.002g药材。
色谱仪：Waters e2695 HPLC；色谱柱：Waters symmetry C18。
结果分析与讨论：结果显示，22批黄柏药材特征图谱具有5个共有峰，与黄柏标准汤剂特征图谱选定共有峰一致。以峰5盐酸小檗碱峰为参照峰，22批黄柏药材特征图谱的5个特征峰相对保留时间RSD值在0.136%~0.563%，均小于3.0%，符合黄柏药材特征图谱的标准要求；22批黄柏药材特征图谱的5个特征峰相对峰面积的RSD在12.28%~31.83%，结果表明不同产地黄柏药材的特征峰对应成分存在一定差异，峰1相对峰面积范围为0.022~0.074，峰2相对峰面积范围为0.085~0.508，峰3相对峰面积范围为0.016~0.063，峰4相对峰面积范围为0.243~0.404。
3 黄柏与关黄柏特征图谱比较
关黄柏为芸香科植物黄檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥树皮，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的功效，用于湿热泻痢，黄疽尿赤，带下阴痒，热淋涩痛，脚气痿蹵，骨蒸劳热，盗汗，遗精，疮疡肿毒，湿疹湿疮。盐关黄柏滋阴降火。用于阴虚火旺，盗汗骨蒸，关黄柏和黄柏的主治功效相同。关黄柏和黄柏的均来源于芸香科，化学成分相近，但各成分含量存在一定的差异，2015年版中国药典将两个品种分别收载，并规定黄柏小檗碱含量限度不得少于3.0%，黄柏碱含量限度不得少于0.34%，关黄柏小檗碱含量限度不得少于0.6%，巴马汀含量限度不得少于0.30%，可见小檗碱含量在两者之间存在较大差异。
在本次研究中我们将黄柏特征图谱的方法运用到关黄柏和黄柏的鉴别研究中，并根据关黄柏和黄柏的图谱信息差异建立鉴别关黄柏和黄柏的方法，具体研究内容如下：
（1）实验样品：关黄柏药材（批号：GHB01、GHB02、GHB03）
（2）特征图谱测定：按实施例1项下供试品溶液、参照物溶液制备方法和色谱条件，制备样品，进样测定，实验结果见下表与图23、图24、图25。
表26、关黄柏药材特征图谱样品测定结果（相对保留时间）
Figure 949844DEST_PATH_IMAGE026
表27、关黄柏药材特征图谱样品测定结果（相对峰面积）
Figure 551726DEST_PATH_IMAGE027
由实验结果可知，在关黄柏药材特征图谱中，峰4的相对峰面积值均大于0.50，而黄柏药材的特征图谱范围在0.243~0.404，通过峰4（盐酸黄柏碱）的相对峰面积，可以鉴别黄柏与关黄柏。
4 黄柏配方颗粒色谱峰指认研究
4.1 仪器、试剂与试药
（1）实验仪器：Agilent 1260分析型高效液相色谱仪(G311C四元泵, G1329B自动进样器, G1316A柱温箱, G1314F紫外检测器，Agilent色谱工作站)；Agilent 6210 LC/MSDTOF质谱仪。T-114万分之一天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-3000E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Direct-Q5型超纯水机(美国Millipore公司)。
（2）试剂试药：乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；水为自制超纯水；磷酸等其它试剂均为分析纯。黄柏配方颗粒样品(批号: GT1611083)由广东一方药业提供。
表28、对照品信息表
Figure 260925DEST_PATH_IMAGE028
4.2实验条件
（1）液相条件
色谱柱：Waters XBridge C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：以乙腈-0.4mol/L的NH4Cl溶液为流动相，按下表规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm。
表29、梯度洗脱条件
Figure 303967DEST_PATH_IMAGE029
（2）质谱条件
离子源：ESI (正离子模式)；干燥器温度：325℃；干燥气流速：10 L/min；毛细管电压：4.0 kV；扫描质核比范围：100~1500；自动参比离子：121.0509和922.0098。
4.3供试品溶液的制备
取批号为GT1611083的黄柏配方颗粒样品适量，研细，精密称定约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%（v/v）甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用50%（v/v）甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.4对照品溶液的制备
分别精密称取5-O-阿魏酸奎尼酸、黄柏碱和小檗碱对照品适量，加入甲醇溶解，制成质量浓度分别约为100 μg/mL的对照品储备液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
4.5色谱峰的指认
（1）相关色谱峰的明确指认
采用上述色谱和质谱分析方法，分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测。通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及与对照品进行比对，黄柏配方颗粒样品HPLC特征图谱中的3个主要色谱峰得到了明确的化学指认。根据保留时间先后，分别为5-O-阿魏酰奎尼酸(峰2)、黄柏碱(峰4)和小檗碱(峰5，S)。
供试品溶液与3个对照品溶液色谱峰叠加图见图26。各色谱峰的峰号、在HPLC色谱图中的保留时间、名称、CAS号、分子式和结构式见表30。
表30、相关色谱峰的指认
Figure 315786DEST_PATH_IMAGE030
（2）其它相关色谱峰的推测
在LC-MS色谱图中，保留时间为12.956 min的色谱峰在一级质谱图中给出m/z369.118，为准分子离子峰[M+H]+ (C17H20O9)，其高分辨质谱图见图27，根据其准分子离子峰信息，结合文献调研，推测其可能为5-O-阿魏酰奎尼酸的同分异构体3-O-阿魏酰奎尼酸。
在LC-MS色谱图中，保留时间为18.037 min的色谱峰在一级质谱图中给出m/z298.1438，为准分子离子峰[M+H]+ (C18H19NO3)，根据其准分子离子峰信息，结合文献调研，尚未找到相应的化合物。
实施例3、黄柏药材的HPLC特征图谱的构建方法
本实施例提供一种黄柏药材的检测方法，步骤如下：
（1）参照物溶液的制备
取黄柏对照药材0.1g，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇50ml，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.1mg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
（2）供试品溶液的制备
取供试品（批号：HB23）0.1g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（3）色谱条件与系统适用性试验
固定相：Waters symmetry C18为色谱柱（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.4mol/L的NH4Cl溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为210nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于8000。
表31
Figure 765484DEST_PATH_IMAGE031
（4）测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得。
（5）结果
将该待测黄柏药材特征图谱（图28）与黄柏药材对照特征图谱（图1）进行比较：该待测黄柏药材能检出5个特征峰，并与对照特征图谱中的5个特征峰相对应；数据结果显示（表23），其相对峰面积和相对保留时间均在标准规定的范围内，由此说明，该批次黄柏药材质量合格，且质量较稳定，满足临床汤剂的使用要求。
表32、供试品特征图谱相对保留时间和相对峰面积
Figure 888161DEST_PATH_IMAGE032
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：
参照物溶液制备：取黄柏对照药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品，精密称定，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；
供试品溶液制备：取黄柏药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为药材供试品溶液；取黄柏标准汤剂，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为标准汤剂供试品溶液；
高效液相色谱测试：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、药材供试品溶液、标准汤剂供试品溶液，注入液相色谱仪，比较所得药材供试品图谱与汤剂供试品图谱，确定水溶性共有峰，获得黄柏药材的HPLC特征图谱；
高效液相色谱测试采用的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈为流动相A，0.35mol/L～0.45mol/L NH4Cl溶液为流动相B，采用梯度洗脱；洗脱梯度包括：
0min～5min，5％流动相A，95％流动相B；
5min～40min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B；
40min～45min，25％→35％流动相A，75％→65％流动相B；
45min～50min，35％→55％流动相A，65％→45％流动相B；
50min～60min，55％→90％流动相A，45％→10％流动相B；
60min～65min，90％→5％流动相A，10％→5％流动相B；
65min～80min，5％流动相A，95％流动相B。
2.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，高效液相色谱测试采用的条件包括：
固定相：Waters symmetry C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：乙腈为流动相A，0.4mol/L NH4Cl溶液为流动相B。
3.根据权利要求1或者2所述的黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，高效液相色谱测试采用的条件包括：检测波长为210nm～280nm，柱温为25℃～35℃，流速为0.8ml/L～1.2ml/L。
4.根据权利要求3所述的黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述检测波长为210nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/L。
5.根据权利要求1或者2所述的黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，参照物溶液制备、供试品溶液制备中，所述提取采用的溶剂为水、体积分数为50％的甲醇溶液、甲醇、体积分数为50％的乙醇溶液、乙醇、乙腈与体积分数为0.1％磷酸溶液按体积比为36：64的混合溶液、乙腈与体积分数为0.1％磷酸溶液按体积比为50：50的混合溶液；所述提取的方式采用超声或者加热回流。
6.根据权利要求5所述的黄柏药材HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述提取采用的溶剂为体积分数为50％的甲醇溶液；所述提取的方式采用超声。
7.一种黄柏药材的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
参照物溶液制备：取黄柏对照药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品，精密称定，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；
供试品溶液制备：取待测黄柏药材，加溶剂提取，滤过，所得滤液作为待测药材溶液；
高效液相色谱测试：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、待测药材溶液，注入液相色谱仪，确定水溶性共有峰，获得待测药材HPLC图谱；比较所述待测药材HPLC图谱与权利要求1至6任一项构建的HPLC特征图谱；
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈为流动相A，0.35～0.45mol/L NH4Cl溶液为流动相B，采用梯度洗脱；洗脱梯度包括：
0min～5min，5％流动相A，95％流动相B；
5min～40min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B；
40min～45min，25％→35％流动相A，75％→65％流动相B；
45min～50min，35％→55％流动相A，65％→45％流动相B；
50min～60min，55％→90％流动相A，45％→10％流动相B；
60min～65min，90％→5％流动相A，10％→5％流动相B；
65min～80min，5％流动相A，95％流动相B。
8.根据权利要求7所述的黄柏药材的检测方法，其特征在于，高效液相色谱测试采用的条件包括：
固定相：Waters symmetry C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：乙腈为流动相A，0.4mol/L NH4Cl溶液为流动相B。
9.根据权利要求7所述的黄柏药材的检测方法，其特征在于，所述提取采用的溶剂为体积分数为50％的甲醇溶液；所述提取的方式采用超声。
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