CN111323491B - 防风药材的uplc特征图谱的构建方法、质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防风药材的UPLC特征图谱的构建方法、质量检测方法。该构建方法包括：参照物溶液制备：制备对照药材参照物溶液；制备升麻素苷、5‑O‑甲基维斯阿米醇苷对照品参照物溶液；供试品溶液的制备：取防风药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为药材供试品溶液；取防风标准汤剂，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为汤剂供试品溶液；超高效液相色谱检测：吸取对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、药材供试品溶液、汤剂供试品溶液，注入液相色谱仪，比较所得药材供试品图谱与汤剂供试品图谱，获得UPLC特征图谱。该特征图谱能用于定性、定量分析防风药材的质量，能够确保采用该药材制备的防风传统汤剂的质量，也适用于检测汤剂。

Description

防风药材的UPLC特征图谱的构建方法、质量检测方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及防风药材的UPLC特征图谱的构建方法、质量检测方法。

背景技术

防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根，为临床常用中药。其具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的作用，临床上多用于治疗感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风等，具有较强的临床应用价值，市场需求广阔，被开发成相关复方制剂如玉屏风颗粒，以及中药配方颗粒广泛用于临床。

中药的临床使用多以传统汤剂为主。中药汤剂的物质基础，是中医理论指导下防治疾病的基础。现行的法定标准仅针对单一成分进行定量控制，量效关系不能全面反映中药成分的整体作用。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，中药指纹图谱/特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。

《中国药典》2015年版防风药材收载了升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定项等，并不能全面地评价防风质量。目前文献研究报道的关于防风指纹图谱或特征图谱多采用的是常规的HPLC法，且均只针对原药材的物质基础，指标成分多以脂溶性成分为研究对象，不能全部反映中药汤剂的物质基础特征。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种防风药材的UPLC特征图谱的构建方法。该构建方法获得的UPLC特征图谱不仅能定性、定量分析防风药材的质量优劣，还能以此为参照反映防风传统汤剂的质量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，所述的构建方法包括：

参照物溶液的制备：取防风对照药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；

供试品溶液的制备：取防风药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、药材供试品溶液、汤剂供试品溶液，注入液相色谱仪，比较所得药材供试品图谱与汤剂供试品图谱，获得防风药材的UPLC特征图谱。

在其中一些实施例中，供试品溶液的制备中，所述防风药材包含有不同产地的防风药材、野生防风药材、栽培防风药材。本发明的供试品原料来自全国防风产量较大的5个道地或主要产区共31批次栽培样品及相关伪品、野生品7批次，具有充分的代表性。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min～10min，流动相A1％→29％，流动相B100％→71％；10min～11min，流动相A29％→49％，流动相B 71％→51％；11min～13min，流动相A49％→99％，流动相B 51％→1％；13min～13.1min，流动相A 99％→1％，流动相B 1％→99％；13.1min～17min，流动相A 1％，流动相B 99％。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：Waters CORTECS T3(100mm×2.1mm×1.6μm)或WatersCSH柱(100mm×2.1mm×1.6μm)；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min～10min，流动相A1％→29％，流动相B100％→71％；10min～11min，流动相A 29％→49％，流动相B 71％→51％；11min～13min，流动相A 49％→99％，流动相B 51％→1％；13min～13.1min，流动相A 99％→1％，流动相B 1％→99％；13.1min～17min，流动相A 1％，流动相B 99％。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：流速为0.3ml/min～0.5ml/min，柱温为30℃～40℃，检测波长为200nm～400nm。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：流速为0.4ml/min，柱温为30℃，检测波长为210nm。

在其中一些实施例中，参照物溶液的制备、供试品溶液的制备中：所述提取采用的溶剂选自水、体积分数为50％的甲醇溶液、甲醇、体积分数为50％的乙醇溶液，所述提取的方式采用超声、加热回流；所述溶解采用的溶剂为甲醇。

在其中一些实施例中，所述提取采用的溶剂为体积分数为50％的甲醇溶液，所述提取的方式采用超声。

本发明的另一目的是提供一种防风药材的质量检测方法，所述质量检测方法包括如下步骤：

参照物溶液的制备：取防风对照药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；

供试品溶液的制备：取待测防风药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，获得所述待测防风药材的UPLC图谱；比较所述待测防风药材的UPLC图谱与权利要求1至7任一项所述构建方法获得的防风药材的UPLC特征图谱。

在其中一些实施例中，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min～10min，流动相A1％→29％，流动相B100％→71％；10min～11min，流动相A 29％→49％，流动相B 71％→51％；11min～13min，流动相A 49％→99％，流动相B 51％→1％；13min～13.1min，流动相A 99％→1％，流动相B 1％→99％；13.1min～17min，流动相A1％，流动相B 99％。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：固定相：WatersCORTECS T3(100mm×2.1mm×1.6μm)或WatersCSH柱(100mm×2.1mm×1.6μm)；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min～10min，流动相A1％→29％，流动相B100％→71％；10min～11min，流动相A 29％→49％，流动相B 71％→51％；11min～13min，流动相A 49％→99％，流动相B 51％→1％；13min～13.1min，流动相A 99％→1％，流动相B 1％→99％；13.1min～17min，流动相A 1％，流动相B 99％。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明同时以防风为对照药材、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷作为对照品，配合合适的色谱条件，通过对防风药材和防风标准汤剂图谱的比较确UPLC特征图谱。该特征图谱不仅能用于定性、定量分析防风药材的质量，而且能够确保采用该药材制备的防风传统汤剂的质量，也适用于检测汤剂的质量。具体地，本发明在构建防风药材UPLC特征图谱的过程中：对其汤剂与药材共有的水溶性成分特征成分(采用UPLC-MS-MS及相关对照品确认其中4个水溶性特征成分，分别为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷成分)进行研究，并作为特征图谱特征峰确定的依据，能够很好的表征药材原料到汤剂的物质传递，不仅能够很好的把控药材质量，而且也能够确保汤剂的质量；采用了对照品、对照药材双重对照，可以有效克服液相条件指纹图谱固有存在的耐用性偏差问题，比较更加全面，能够对野生与栽培品，真品与习用品、伪品的鉴别；以含量测定峰(升麻素苷)作为参照峰，规定每个特征峰的相对保留时间和相对峰面积限量范围，实现多个特征成分的定量化，符合中药的整体作用理念。

另外，本发明采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，更加高效、快速、环保；采用本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对防风药材多个特征成分的质量监控，既提升了防风药材的质量控制水平，又提升和稳定防风药材的内在质量；保持了防风药材与临床汤剂质量的一致性，为临床提供符合防风标准汤剂要求的原料，为防风相关的制剂工艺生产过程提供重要的多指标参数依据。

附图说明

图1为31批次防风标准汤剂UPLC特征图谱(峰2(S)：升麻素苷；峰3：升麻素；峰4：5-O-甲基维斯阿米醇苷；峰5：亥茅酚苷)。

图2为31批次防风药材UPLC特征图谱。

图3为防风标准汤剂UPLC特征图谱。

图4为防风药材UPLC对照特征图谱。

图5为防风标准汤剂、防风药材UPLC对照特征图谱比较图。

图6为4批野生防风药材UPLC特征图谱。

图7为3个不同伪品防风药材UPLC特征图谱。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1、防风药材的UPLC特征图谱的构建方法

本实施例提供一种防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，包括如下：

1、仪器与试药

表1、仪器信息表

表2、试剂信息表

试剂名称	厂家	级别	批号
				色谱乙腈	上海星可	HPLC级	011470303
色谱甲醇	BCR	HPLC级	170320104001
				水	M MILLIPORE Synergy UV	超纯水	当天

表3、对照品信息表

表4、防风药材信息表

表中，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷是按中国药典(2015版)防风项下含量测定方法测定。

本发明所述的防风标准汤剂，其制备方法包括：防风药材，拣选除去杂质，洗净，润透，切厚片；取防风饮片100g，称定重量，加水煎煮二次，第一次煎煮加9倍量水，浸泡30分钟，武火煮沸后再文火煎煮20分钟，用350目标准筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；第二次煎煮加7倍量水，武火煮沸后改文火煎煮20分钟，用350目标准筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；滤液减压浓缩至适量，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，取出，轧铝盖即得。

2、色谱条件与供试品溶液的制备

2.1色谱条件

以Waters CORTECS T3(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相的A，以水为流动相B，梯度洗脱(表5)；流速为每分钟0.4ml；检测波长为210nm。

2.2参照物溶液的制备

取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含60μg的混合溶液，摇匀，即得对照品溶液。

取防风对照药材0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％(v/v)甲醇溶液10ml，称定重量，超声(500W，40kHz)处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为防风对照药材溶液。

2.3供试品溶液的制备

取防风药材粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50(v/v)％甲醇溶液10ml，称定重量，超声(500W，40kHz)处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4测定法

分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定的方法按照如下“3、色谱条件优化”确定的条件。

3、色谱条件优化

3.1检测波长的确定

采用Waters H-class(PDA)对防风药材供试品溶液在200nm至400nm处进行全波长扫描，记录光谱信息。

通过移动波长，在210nm处各峰的整体响应较好，故本法采用210nm波长。

3.2梯度条件的优化

对原始梯度条件进行优化，得到一个优化的梯度条件。见表5。

表5、优化梯度表

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	1→29	99→71
10～11	29→49	71→51
			11～13	49→99	51→1
13～13.1	99→1	1→99
			13.1～17	1	99

3.3流动相的优化

①有机相的考察

取防风药材(序号为1号)约0.25g，按“2.3”项方法制备供试品溶液；按“3.2”色谱条件，注入超高效液相色谱仪中，分别采用甲醇和乙腈作为色谱分离的有机相。

实验结果：相近的洗脱能力下，乙腈和甲醇的分离效果相差不大，因使用的是小粒径柱，甲醇产生的柱压较高且基线不平，故本法选用乙腈。

②水相的选择

采用与香港中药材标准相同的水作为水相，实验结果显示分离效果及峰形均好，故本法水相选用水。

3.4不同柱温考察

取防风药材(序号为1号)约0.25g，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，注入液相色谱仪，在30℃、35℃、40℃的柱温下分别考察。

实验结果：不同柱温对整体分离效果影响不大，耐用性较好，本法选用高于室温的30℃进行研究。

3.5不同流速考察

取防风药材(序号为1号)约0.25g，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，注入液相色谱仪，在0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min的流速分别考察。

实验结果：不同流速对整体分离效果影响不大，耐用性较好，本法选用0.4ml/min的流速进行研究。

4、供试品溶液制备方法考察

4.1提取溶媒考察

取防风药材(序号为1号)约0.25g，精密称定，平行5份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、水、50％(v/v)甲醇溶液、50％(v/v)乙醇溶液、乙醇10ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率45kHz)30分钟，放冷，分别用甲醇、水、50％甲醇、50％乙醇、乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取1μl，注入液相色谱仪，测定。

实验结果：通过对比5种提取溶剂的特征图谱可发现：乙醇的提取效果较差，导致峰1丢失；50％(v/v)甲醇溶液提取的峰个数最多且易得，故选取50％(v/v)甲醇溶液作为提取溶剂。

4.2提取方式考察

本次实验考察不同提取方式对防风药材特征图谱的影响，选取加热回流与超声处理两种方式。

取防风药材(序号为1号)约0.25g，精密称定，平行2份，置具塞锥形瓶中，精密加入水10ml，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率45kHz)30分钟、加热回流30分钟，放冷，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取1μl，注入液相色谱仪，测定。

通过对比超声与回流两种提取方式对防风药材特征图谱，可发现提取方式对防风药材特征图谱的影响较小，从操作方便考虑，选择超声作为提取方式。

4.3提取时间考察

本次实验考察不同提取时间对防风药材特征图谱的影响，选取超声时间分别为：10分钟、20分钟、30分钟。

取防风药材(序号为1号)约0.25g，精密称定，平行3份，置具塞锥形瓶中，精密加入水10ml，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率45kHz)10分钟、20分钟、30分钟，放冷，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取1μl，注入液相色谱仪，测定。

通过对比不同提取时间的特征图谱，发现超声时间10分钟后，各成分峰峰面积差异较小，为保证提取完全，选取超声时间为20分钟。

4.4特征峰的确定

取31批防风药材样品，每份0.25g，按照上述供试品溶液、参照物溶液制备方法和优选色谱条件测定样品特征图谱，参见图2。

另取31批防风汤剂标准样品，研细，每份取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水10ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率45kHz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照上述色谱条件(“3、色谱条件优化”)测定样品特征图谱，参见图1。

实验结果表明，31批防风标准汤剂具有5个特征峰，且5个特征峰均能从防风药材稳定转移到防风标准汤剂中；即防风药材特征图谱与标准汤剂特征图谱中的5个特征峰相对应，因此，选择此5个特征峰为防风药材的共有峰；并以峰2(升麻素苷)为参照峰进行标准研究。参见图3、图4、图5。

5、方法学考察

(1)专属性考察

取防风药材供试品溶液(序号为1号)、空白溶剂(水)、参照物溶液，按已确定的色谱条件(3、色谱条件优化)进样测定，记录色谱图。

结果：防风药材5个色谱峰不受阴性空白溶剂的干扰，其中防风药材中升麻素苷与5-O-维斯阿米醇苷峰与参照物溶液的保留时间一致，本方法具有良好的专属性。

(2)精密度考察

取防风药材(序号为1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，连续进样6次测定，每次1μl，以升麻素苷峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积，实验结果见表6、表7。

表6、精密度实验结果(相对保留时间)

表7、精密度实验结果(相对峰面积)

结果表明：在连续进样6次的精密度考察中防风药材5个色谱峰相对保留时间RSD<2％，表明该特征图谱方法精密度良好。

(3)稳定性考察

取防风药材(序号为1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，20，24小时进样，以升麻素苷峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积，结果见表8、表9。

表8、稳定性实验结果(相对保留时间)

表9、稳定性实验结果(相对峰面积)

结果表明：5个色谱峰，24小时内相对保留时间的RSD<2％，表明该方法下特征峰的5个峰在24小时内稳定。

(4)重复性考察

取防风药材(序号为1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，考察特征峰相对保留时间的一致性，结果见表10、表11。

表10、重复性实验结果(相对保留时间)

表11、重复性实验结果(相对峰面积)

结果表明：防风标准汤剂5个特征峰的相对保留时间RSD<2％，表明该方法的重复性良好。

(5)中间精密度考察

由不同分析人员，在不同时间，不同仪器上，取防风药材(1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，考察特征峰相对保留时间的一致性，结果见表12、表13。

表12、中间精密度结果(相对保留时间)

表13、中间精密度结果(相对峰面积)

结果表明：在中间精密度考察中5个特征峰的相对保留时间RSD<2.0％，表明该方法的中间精密度良好。

(6)耐用性考察

①不同流速考察

取防风药材(1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，比较流速分别为0.35ml/min、0.40ml/min、0.45ml/min的特征图谱，以升麻素苷色谱峰为参照峰S，计算其它色谱峰的相对保留时间；并计算RSD值。实验结果如表14、表15。

表14、耐用性考察：不同流速考察结果(相对保留时间)

表15、耐用性考察：不同流速考察结果(相对峰面积)

结果显示：在不同流速下5个色谱峰相对保留时间的RSD>3.0％；不同流速下对各色谱峰的保留时间有较大影响，故流速设定为0.4ml/min。

②不同柱温考察

取防风药材(1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，比较柱温分别为25℃、30℃、35℃时的色谱图，以升麻素苷色谱峰为参照峰S，计算其它色谱峰的相对保留时间；并计算RSD值。实验结果如表16、表17。

表16、耐用性考察：不同柱温考察结果(相对保留时间)

表17、耐用性考察：不同柱温考察结果(相对峰面积)

结果显示：在不同柱温下5个色谱峰相对保留时间的RSD<2.0％；表明当柱温±5℃时对各色谱峰相对峰面积与相对保留时间影响较小，柱温微小的变动对特征图谱结果影响不大。

③不同色谱柱考察

取防风药材(序号为1号)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，选择三根保留性能相近的色谱柱(WatersBEH、Waters CORTECS T3、WatersCSH)，比较3根色谱柱，以升麻素苷色谱峰为参照峰S，计算其它色谱峰的相对保留时间；并计算RSD值。实验结果如表18、19。

表18、耐用性考察：不同色谱柱考察结果(相对保留时间)

表19、耐用性考察：不同色谱柱考察结果(相对峰面积)

结果显示：当使用不同色谱柱时5个色谱峰相对保留时间因BEH柱的影响，RSD>3.0％，表明使用不同色谱柱时对相对保留时间有较大影响，故建议使用Waters CORTECST3柱或WatersCSH柱。

6、防风药材特征图谱的测定

6.1取防风药材样品31批，每份0.25g，按照上述参照物溶液、供试品溶液制备方法和色谱条件(“3、色谱条件优化”确定)测定样品特征图谱，测定结果见表20、表21，图谱如附图2所示。

表20、31批防风药材特征图谱(相对保留时间)

表21、31批防风药材特征图谱(相对峰面积)

结果：31批防风药材特征图谱的4个特征峰相对峰面积的RSD在30.09％～69.13％，结果表明不同产地防风药材的各特征峰峰面积存在一定差异，峰1相对峰面积范围为0.10～0.75，峰3相对峰面积范围为0.03～0.52，峰4相对峰面积范围为0.39～1.16，峰5相对峰面积范围为0.02～0.14。

为严格控制防风药材的质量，为防风的临床汤剂提供质优且稳定的原料药材，根据31批次不同产地防风药材的峰1、峰3、峰4、峰5的相对峰面积波动范围，考虑31批次不同产地样品的代表性，综合取各特征峰相对峰面积的最小、最大值，或均值的70％～130％、±3SD为范围，规定：与升麻素苷参照物峰相应的峰2为S峰，各特征峰与S峰的相对峰面积，规定各峰相对峰面积范围为：0.10～0.75(峰1)，0.03～0.52(峰3)，0.39～1.16(峰4)，0.02～0.14(峰5)。

6.2特征图谱标准的拟定

将31批防风标准汤剂UPLC特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》匹配，生成对照图谱，建立防风标准汤剂对照特征图谱；相对保留时间确定：依据31批次防风药材特征图谱相对保留时间均值的±8％；相对峰面积范围的确定：依据31批次防风药材的相对峰面积均值的70％～130％范围。

供试品色谱中应呈现5个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的5个特征峰相对应，其中峰2、4应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相同；与升麻素苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为：0.48(峰1)、1.14(峰3)、1.22(峰4)、1.53(峰5)；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定值为：0.10～0.75(峰1)，0.03～0.52(峰3)，0.39～1.16(峰4)，0.02～0.14(峰5)。

7.防风药材特征图谱特征峰的指认

7.1仪器与试药

仪器：UPLC-MS-MS高分辨质谱仪Q Exactive Focus(赛默飞世尔科技有限公司，CompoundDiscoverer2.1数据库)；同实施例项下“仪器与试药”。

7.2色谱条件和质谱条件

色谱条件：同实施例1“2.1”项下“色谱条件”。

质谱条件：质谱条件：Waters Xevo G2-XS四级杆串联飞行时间质谱；质谱参数最终优化为：ESI模式：正、负离子扫描，质量数范围：m/z 500–1500；干燥气体流速(N2)：800L/h；干燥气体温度：400℃；毛细管电压：2.5kV；锥孔电压：40V。为了得到更多的碎片信息，应用MSE一级二级全扫描的采集模式。

7.3参照物溶液的制备：同实施例1“2.2”项下“参照物溶液的制备”。

7.4供试品溶液的制备：同实施例1“2.3”项下“供试品溶液的制备”。

7.5测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入高分辨质谱仪，测定，即得。

实验结果及数据分析：将供试品溶液与对照品参照物溶液各进样2μl注入高分辨质谱仪，数据采用MassLynxTM 4.1进行分析处理。

7.6结果分析

根据一级和二级质谱及相关数据库分析以及文献检索结果，采用相应标准品对照指认，分析各特征峰物质分别为：峰2为升麻素苷，峰3为升麻素，峰4为5-O-甲基维斯阿米醇苷，峰5为亥茅酚苷。结果见表22。

表22、峰2～5物质及结构

峰号	分子量(m/z)	ESI-MS(+)	化合物
				峰2	468.1632	469.1700	升麻素苷
峰3	306.1103	307.1175	升麻素
				峰4	452.1682	453.1748	5-O-甲基维斯阿米醇苷
峰5	438.1526	439.1593	亥茅酚苷

实施例2、一种防风药材的质量检测方法

本实施例提供一种防风药材的质量检测方法，包括如下步骤：

1、溶液的制备、色谱条件同“实施例1”中的“2.色谱条件与供试品溶液的制备”项。

2、测定精密吸取供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

将待测防风药材特征图谱与防风药材对照特征图谱进行比较：该待测样品能检出5个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的5个特征峰相对应，与升麻素苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为：0.48(峰1)、1.14(峰3)、1.22(峰4)、1.53(峰5)；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定值为：0.10～0.75(峰1)，0.03～0.52(峰3)，0.39～1.16(峰4)，0.02～0.14(峰5)。

实施例3、野生防风与栽培防风药材的鉴别

本实施例提供一种对野生防风、栽培防风进行鉴别的方法，包括如下：

1、试药

表23、防风药材表

序号	药材批号	备注
			1	YSFF01	野生
2	YSFF02	野生
			2	YSFF03	野生
3	YSFF04	野生

2、溶液的制备、色谱条件同“实施例1”中的“2.色谱条件与供试品溶液的制备”项。

3、测定精密吸取供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

4、结果

4批野生防风样品能检出5个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的5个特征峰相对应，与升麻素苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，均在防风药材标准的规定范围内；峰1的相对峰面积范围是野生防风与栽培防风的区别点，防风药材标准中峰1的相对峰面积范围为0.10～0.75，4批野生防风药材峰1的相对峰面积范围在0.03～0.09，均小于0.10。所建立的防风药材UPLC特征图谱标准能区分栽培和野生防风药材。参见图6。

表24、4批野生防风药材特征图谱(相对保留时间)

表25、4批野生防风药材特征图谱(相对峰面积)

实施例4、防风伪品的鉴别

本实施例提供一种对真伪防风药材的鉴别方法，包括如下：

1、试药

表26、防风药材、标准汤剂批号、产地信息表

序号	药材批号	备注
			1	WFF01	西防风
2	WFF02	汉防风
			3	WFF03	水防风

2、溶液的制备同“实施例1”中的“2.色谱条件与供试品溶液的制备”项。

3、测定精密吸取供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得待测防风药材的特征图谱，所述色谱条件同实施例1中“2.1色谱条件”项。

4、结果

3批伪品对应的特征图谱和31批栽培防风药材特征图谱比较(见附图7)，其中汉防风和水防风的共有峰只有峰1，其余4个特征峰峰2(升麻素苷)、峰3(升麻素)、峰4(5-O-甲基维斯阿米醇苷)、峰5(亥茅酚苷)均没有检出。而西防风与防风特征图谱的对比发现，峰3(升麻素)为区分西防风和防风的关键特征峰。所建立的防风药材UPLC特征图谱标准的特征峰的数量和相对峰面积范围，及能有效区分防风常见的药材的真伪品。

整体上来讲，本发明：(1)采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，更加高效、快速、环保；(2)研究对象：本发明的原料来自全国防风产量较大的5个道地或主要产区共31批次栽培样品及相关伪品、野生品7批次，具有充分的代表性；研究对象为防风药材、饮片和标准汤剂；(3)特征峰：本发明研究防风的UPLC特征图谱，引入防风标准汤剂的特征图谱进行研究，针对其汤剂与药材共有的水溶性成分特征成分进行研究，并作为特征图谱特征峰确定的依据；采用UPLC-MS-MS及相关对照品确认其中4个水溶性特征成分，分别为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷成分；(4)标准的评价结果：定性差别方面，本发明同时采用了对照品、对照药材双重对照，可以有效克服液相条件指纹图谱固有存在的耐用性偏差问题，比较更加全面，实现了对野生与栽培品，真品与习用品、伪品的鉴别；定量评价方面：以含量测定峰(升麻素苷)作为参照峰，规定每个特征峰的相对保留时间和相对峰面积限量范围，实现多个特征成分的定量化，符合中药的整体作用理念。采用本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对防风药材多个特征成分的质量监控，既提升了防风药材的质量控制水平，又提升和稳定防风药材的内在质量；保持了防风药材与临床汤剂质量的一致性，为临床提供符合防风标准汤剂要求的原料，为防风相关的制剂工艺生产过程提供重要的多指标参数依据。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：

参照物溶液的制备：取防风对照药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；

供试品溶液的制备：取防风药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为药材供试品溶液；取防风标准汤剂，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为汤剂供试品溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、药材供试品溶液、汤剂供试品溶液，注入液相色谱仪，比较所得药材供试品图谱与汤剂供试品图谱，获得防风药材的UPLC特征图谱；

所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min~10min，流动相A1%→29%，流动相B99%→71%；10 min~11min，流动相A 29%→49%，流动相B 71%→51%；11 min~13min，流动相A 49%→99%，流动相B 51%→1%；13 min~13.1min，流动相A 99%→1%，流动相B 1%→99%；13.1min~17min，流动相A 1%，流动相B 99%；

参照物溶液的制备、供试品溶液的制备中：所述提取采用的溶剂选自水、体积分数为50%的甲醇溶液、甲醇或者体 积分数为50%的乙醇溶液。

2.根据权利要求1所述的防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：Waters CORTECS T3，100mm×2.1mm×1.6µm，或，WatersCSH柱，100mm×2.1mm×1.6µm；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min~10min，流动相A1%→29%，流动相B99%→71%；10 min~11min，流动相A 29%→49%，流动相B 71%→51%；11 min~13min，流动相A 49%→99%，流动相B 51%→1%；13 min~13.1min，流动相A 99%→1%，流动相B 1%→99%；13.1min~17min，流动相A 1%，流动相B 99%。

3.根据权利要求1或者2所述的防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：流速为0.3ml/min~0.5ml/min，柱温为30℃~40℃，检测波长为200nm~400nm。

4.根据权利要求3所述的防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：流速为0.4ml/min，柱温为30℃，检测波长为210nm。

5.根据权利要求1或者2所述的防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，参照物溶液的制备、供试品溶液的制备中：所述提取的方式采用超声、加热回流；所述溶解采用的溶剂为甲醇。

6.根据权利要求5所述的防风药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述提取采用的溶剂为体积分数为50%的甲醇溶液，所述提取的方式采用超声。

7.一种防风药材的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括如下步骤：

参照物溶液的制备：取防风对照药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为对照药材参照物溶液；取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为对照品参照物溶液；

供试品溶液的制备：取待测防风药材，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，获得所述待测防风药材的UPLC图谱；比较所述待测防风药材的UPLC图谱与权利要求1至6任一项所述构建方法获得的防风药材的UPLC特征图谱；

所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min~10min，流动相A1%→29%，流动相B99%→71%；10 min~11min，流动相A 29%→49%，流动相B 71%→51%；11 min~13min，流动相A 49%→99%，流动相B 51%→1%；13 min~13.1min，流动相A 99%→1%，流动相B 1%→99%；13.1min~17min，流动相A 1%，流动相B 99%；

参照物溶液的制备、供试品溶液的制备中：所述提取采用的溶剂选自水、体积分数为50%的甲醇溶液、甲醇或者体 积分数为50%的乙醇溶液。

8.根据权利要求7所述的防风药材的质量检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：Waters CORTECS T3，100mm×2.1mm×1.6µm，或，WatersCSH柱，100mm×2.1mm×1.6µm；

流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；

洗脱梯度包括：0min~10min，流动相A1%→29%，流动相B99%→71%；10 min~11min，流动相A 29%→49%，流动相B 71%→51%；11 min~13min，流动相A 49%→99%，流动相B 51%→1%；13 min~13.1min，流动相A 99%→1%，流动相B 1%→99%；13.1min~17min，流动相A 1%，流动相B 99%。

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