CN111679015A - 一种白及小分子特征指纹图谱分析方法 - Google Patents

一种白及小分子特征指纹图谱分析方法 Download PDF

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CN111679015A CN202010721182.7A CN202010721182A CN111679015A CN 111679015 A CN111679015 A CN 111679015A CN 202010721182 A CN202010721182 A CN 202010721182A CN 111679015 A CN111679015 A CN 111679015A
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Abstract

本发明提供了一种白及特征指纹图谱的建立方法以及白及的检测方法，获得白及特征指纹图谱。本发明方法条件简单，结果准确，重现性好，符合指纹图谱精密性试验要求，而且样品在24小时之内稳定性良好。故该方法能较为全面地反应白及药材中所含化学小分子成分的种类和数量。同时，选取的3个共有色谱峰能够客观地反映白及的内在品质，作为白及的质量控制性指标。

Description

一种白及小分子特征指纹图谱分析方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及中药材指纹图谱的建立方法，具体涉及一种白及小分子特征指纹图谱分析方法的建立，以及由此方法所得到的白及特征指纹图谱。
背景技术
白及为兰科植物白芨(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥块茎，别名良姜、紫兰。李时珍释其名曰：其根白色，连及而生，故曰白及。早在《神农本草经》就有记载，1963年以后成为各版药典收藏的品种之一。其味苦、甘、涩，性平偏凉，归肺、胃、肝经。白及具有补肺、止血、消肿、生肌、敛疮，白及功能主治肺伤咳血、外伤出血、疮疡肿毒、溃疡疼痛、烫火灼烧、手足皲裂、肛裂和乳头裂等。此外，白及多糖类成分具有抗菌、抗失血性休克、保护皮肤、延缓衰老等功效，同时也是目前药用辅料的研究热点。
较早研究白及化学成分的是日本Kyoritsu大学，主要分离得到了白及多糖类成分。随后日本Mukogawa女子大学药学院、Osaka大学药学院以及国内的第二军医大学药学院、南京大学生命科学院、解放军医院等对白及进行了更深入的化学成分研究，相继从中分离得到了菲类(phenanthrenes)、联菲类(biphenanthrenes)、联菲醚类(dihydrophenanthrene ethers)、联苄类(bibenzyls)、以及甾体(steroids)和三萜类(triterpenes)等化合物。
目前，关于白及药材的质量控制成为研究热点，例如，专利CN101502616B公开了一种白及药材的含量测定方法，其采用双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2异丁基苹果酸酯的标准溶液作为对照，然后采用高效液相色谱法测定双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2异丁基苹果酸酯的含量，用于白及药材的质量控制。
然而，医药学界普遍认为，中药是以其整体而非某个或某几个主要成分发挥作用的，因此，以某个或某几个主要成分的含量作为某中药材的质量控制标准是有违中药特性的，故以指纹图谱作为中药及其制剂的质量控制方法，能够更有效地控制中药质量。指纹图谱既可确认中药的真伪，又能判断中药质量的稳定与否。目前已广泛用于中草药及其各种制剂的质量控制。通过高效液相色谱仪分析检测白及样品，可以反应白及质量的真实性、优良性和稳定性，有效、客观的评价药材质量。专利CN103344717B公开了一种白及高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。但是该现有技术中并没有标准品的对照，液相的条件也完全不同，包括波长等，甚至得到的色谱峰也与本申请完全不同。
发明内容
本发明的目的是提供一种白及小分子特征指纹图谱的建立方法，通过此建立方法可控制白及药材的质量。采用特征指纹图谱质量控制方式以分析为手段，从中获取反映药用白及内在质量的信息，通过对指纹特征的分析比较，为白及质量控制提供参考。
本发明提供了一种白及特征指纹图谱的建立方法，包括：
提取待测白及样品溶液，采用高效液相色谱分析，获得白及特征指纹图谱，所述高效液相色谱分析的条件为：
检测波长：280nm，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，洗脱梯度：
Figure BDA0002600067380000021
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰。
优选的，所述的提取采用的溶剂为甲醇，其体积浓度为75％。
优选的，所述的提取中的料液比为1∶25(g/mL)。
优选的，所述的白及选自紫花白及、华白及、水白及或小白及。
优选的，所述提取的方式选自超声、回流或浸泡。
在本发明的一个具体实施方式中，所述提取的方式为超声。所述超声时间选自30-50min。所述的超声温度选自10-50℃。
在本发明的一个具体实施方式中，所述提取的方式为回流，优选为热回流。所述热回流的时间为30min。
优选的，所述的液相色谱柱为C18。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的液相色谱柱选自Allitma的C18、Shimadzu的C18、Agilent的C18、InertSustain的AQ-C18或Welch的XB-C18。
优选的，所述的色谱柱的柱温为25-45℃。
优选的，所述的流动相的流速为0.8-1.2mL/min。
优选的，所述的白及特征指纹图谱中含有3个特征峰，其中一个为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的特征峰。
进一步优选的，所述的白及特征指纹图谱中含有3个特征峰，保留时间分别为：24.39min、32.61min、和51.91min，其中，保留时间为32.61min的特征峰为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的建立方法包括如下步骤：
取白及、粉碎、过筛获得白及粉末，以料液比1∶25(g/mL)加入75％的甲醇，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，然后过滤得到待测白及样品溶液；
采用高效液相色谱分析待测白及样品溶液，所述高效液相色谱分析的条件为：
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，
检测波长：280nm，
柱温：35℃，
流速：1mL/min，
进样量：10μL，
洗脱梯度：
Figure BDA0002600067380000031
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算待测白及样品溶液的各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，获得白及特征指纹图谱。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的建立方法包括以下步骤：
(1)待测白及样品溶液的制备：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到待测白及样品溶液；
(2)高效液相色谱分析条件：
仪器型号：安捷伦1200LC高效液相色谱仪；
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；
流动相：二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸水，B相：乙腈；
检测波长：280nm；
柱温：35℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
洗脱梯度：
Figure BDA0002600067380000041
(3)特征指纹图谱的测定：精密吸取待测白及样品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算待测白及样品溶液的各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到白及特征指纹图谱。
本发明还提供了一种白及的检测方法，所述的方法包括：
提取待测样品溶液，采用高效液相色谱分析，所述高效液相色谱分析的条件为：
检测波长：280nm，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，洗脱梯度：
Figure BDA0002600067380000042
Figure BDA0002600067380000051
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰。
优选的，所述的检测方法包括确定不同样品是否是白及，或者确定样品中是否存在白及，或者确定样品中白及的含量，或者确定白及样品中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测方法检测不同样品是否是白及，即获得每个样品的特征指纹图谱，然后与白及的特征指纹图谱相同或特征峰相同的为白及。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测方法检测某个样品中白及的含量，即通过检测样品中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量，并计算指纹图谱中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量比例，换算出白及的含量。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测方法检测某个样品中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量，即通过确定样品的指纹图谱，然后与标准对照品中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的特征峰和含量对照、换算出样品中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的的含量。
优选的，所述的提取采用的溶剂为甲醇，其体积浓度为75％。
优选的，所述的提取中的料液比为1∶25(g/mL)。
优选的，所述的白及选自紫花白及、华白及、水白及或小白及。
优选的，所述提取的方式选自超声、回流或浸泡。
在本发明的一个具体实施方式中，所述提取的方式为超声。所述超声时间选自30-50min。所述的超声温度选自10-50℃。
在本发明的一个具体实施方式中，所述提取的方式为回流，优选为热回流。所述热回流的时间为30min。
优选的，所述的液相色谱柱为C18。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的液相色谱柱选自Allitma的C18、Shimadzu的C18、Agilent的C18、InertSustain的AQ-C18或Welch的XB-C18。
优选的，所述的色谱柱的柱温为25-45℃。
优选的，所述的流动相的流速为0.8-1.2mL/min。
优选的，所述的高效液相色谱分析结果中含有3个特征峰，其中一个为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的特征峰。
进一步优选的，所述的高效液相色谱分析结果中含有3个特征峰，保留时间分别为：24.39min、32.61min和51.91min，其中，保留时间为32.61min的特征峰为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测方法包括如下步骤：
取白及、粉碎、过筛获得白及粉末，以料液比1∶25(g/mL)加入75％的甲醇，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，然后过滤得到待测白及样品溶液；
采用高效液相色谱分析待测白及样品溶液，所述高效液相色谱分析的条件为：
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，
检测波长：280nm，
柱温：35℃，
流速：1mL/min，
进样量：10μL，
洗脱梯度：
Figure BDA0002600067380000061
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算待测白及样品溶液的各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，获得白及特征指纹图谱。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的建立方法包括以下步骤：
(1)待测白及样品溶液的制备：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到待测白及样品溶液；
(2)高效液相色谱分析条件：
仪器型号：安捷伦1200LC高效液相色谱仪；
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；
流动相：二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸水，B相：乙腈；
检测波长：280nm；
柱温：35℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
洗脱梯度：
Figure BDA0002600067380000071
(3)特征指纹图谱的测定：精密吸取待测白及样品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算待测白及样品溶液的各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到白及特征指纹图谱。
本发明所述的“料液比”指固体的质量与液体的体积之间的比例，即在本发明中为白及的质量与提取溶剂的体积之间的比例。其中，白及的质量优选为粉碎、过筛后的质量。
本发明所述的“紫花白及”为来源于紫花白芨的干燥块茎。
本发明所述的“华白及”为来源于华白芨的干燥块茎。
本发明所述的“水白及”为来源于水白芨的干燥块茎。
本发明所述的“小白及”为来源于小白芨的干燥块茎。
本发明提供了一种白及小分子特征指纹图谱的建立方法，其主要具有的有益效果为：与现有技术中的指纹图谱相比，本发明选用1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯为对照峰，对白及中的其他特征峰进行保留时间和峰面积归一化处理，扣除不同批次之间保留时间漂移、操作误差等影响，可以应用于药用白及的组培苗、白及鲜品、白及干品的质量分级及真伪鉴别。具体地：
(1)重现性良好，各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于0.1％；精密度实验中各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间小于0.1％，样品在24小时之内稳定性良好。表明各共有色谱峰能够客观地反映白及的内在品质，可以作为白及的质量控制性指标。
(2)白及特征指纹图谱的建立方法对供试样品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定性良好；
(3)高效液相色谱分析的精密度较高、重现性良好，分析时间较短，具有一定的专属性，所得指纹图谱中各指纹峰分离效果较好；
(4)本申请获得峰面积较大的共有峰作为特征指纹峰，通过特征指纹峰相对保留时间和相对峰面积的比较，能有效地表征药用白及的质量；
(5)本申请所建立的特征指纹图谱以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯为对照峰，确保各特质指纹峰的相对稳定性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：白及不同提取溶剂色谱图谱比较；
图2：白及不同甲醇浓度考察色谱图比较；
图3：白及不同料液比考察色谱图比较；
图4：三种提取方式(超声、热回流、静置)得到的白及色谱图比较；
图5：不同的超声时间得到的白及色谱图比较；
图6：不同的超声温度得到的白及色谱图比较；
图7：不同的超声次数得到的白及色谱图比较；
图8：不同柱温下白及色谱图比较；
图9：不同流速下白及色谱图比较；
图10：不同品牌色谱柱对白及指纹图谱比较；
图11：白及梯度洗脱色谱图；
图12：白及指纹图谱精密度试验色谱图；
图13：白及指纹图谱重复性试验色谱图；
图14：白及指纹图谱稳定性性试验色谱图；
图15：白及小分子特征指纹图谱色谱图；
图16：白及中苹果酸酯标准品色谱图；
图17：本发明实施例所述的紫花白及的指纹图谱；
图18：本发明实施例所述的水白及的指纹图谱；
图19：本发明实施例所述的华白及的指纹图谱；
图20：本发明实施例所述的小白及的指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了使本发明更容易理解，下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
仪器：Agilent1200 series高效液相色谱仪(包括低压二元梯度泵G1312A，柱温箱G1316A，二极管阵列检测器G1315B，Chemstation化学工作站，美国Agilent科技有限公司)，300g手提式粉碎机(广州旭朗机械设备有限公司)Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统(Millipore公司)，RQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，PB303-N电子天平(MEETTLER TOLEDO，0.001g)，XP205型电子天平(梅特勒-托利多公司)，N-EVAPTM112氮吹仪(美国Orgnomation公司)，S-3 0.355mm药典筛(绍兴市公路仪器设备有限公司)，0.45μm微孔滤头(津腾公司)。
试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher scientific公司)；其它试剂为分析纯；超纯水(MilliQ超纯水，过0.45μm微孔滤膜)；甲醇、乙醇(分析纯，北京化工厂)。
实施例1：白及供试样品溶液制备
(1)不同提取溶剂选择
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品三份，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，分别加入纯水、75％的甲醇、乙醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
②高效液相色谱分析条件：C18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸，B相：乙腈；检测波长280nm；柱温35℃；洗脱梯度如表1，流速1.0mL/min，进样量10μL。
表1白及洗脱梯度
Figure BDA0002600067380000101
③指纹图谱建立及结果分析：白及供试样品纯水提取成分偏少；乙醇提取峰面积响应值偏低；而甲醇不仅提取成分(峰数目)多，而且其峰面积响应值也高于其他两种溶剂，因此提取溶剂为甲醇较好。三种溶剂提取白及小分子色谱图比较结果见图1。
(2)提取溶剂浓度选择
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品四份，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，分别加入25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、纯甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
步骤②同(1)②。
③指纹图谱建立及结果分析：不论从响应峰的个数，还是响应值来看，75％甲醇的提取后效果较好，因此选择75％甲醇作为提取溶剂。四种溶剂浓度提取白及小分子色谱图比较结果见图2。
(3)提取溶剂用量选择
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品三份，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，分别加入75％的甲醇25mL(1∶25)、50mL(1∶50)、100mL(1∶100)，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
步骤②同(1)、②。
③指纹图谱建立及结果分析：不论从响应峰的个数，还是响应值来看，料液比为1：25效果较好，因此选择该比例。四种料液比提取白及小分子色谱图比较结果见图3。
(4)提取方式选择
①高效液相色谱分析条件：以75％甲醇为提取溶剂，其他条件均相同，以色谱图色谱峰个数和峰响应值为指标，考察超声、热回流及静置提取三种方式的提取效果，确定最佳提取方式。
超声萃取法：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
热回流法：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，加热回流30min(由蒸馏液滴下开始计时)，取出放冷，提取液转移到25mL容量瓶，用75％甲醇定容，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
浸泡法(静置)：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，分别加入75％的甲醇25mL，室温下浸泡30min，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
②指纹图谱建立及结果分析：超声提取法对白及样品的3个指标峰的响应较好，因此选择该提取方式。三种方式比提取白及小分子色谱图比较结果见图4。
(5)超声时间选取
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品三份，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下分别超声10min、30min、50min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
步骤②同(1)、②。
③指纹图谱建立及结果分析：超声时间为30min、50min总体对白及样品的3个指标峰的响应来说，相差不是很大，因此选取30min作为提取时间。不同超声时间提取白及小分子色谱图比较结果见图5。
(6)超声温度选择
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品三份，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，分别选择10℃、室温、50℃下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
步骤②同(1)、②。
③指纹图谱建立及结果分析：超声温度对白及样品影响不大，但为了操作简易，因此选择室温下超声较好。不同超声温度提取白及小分子色谱图比较结果见图6。
(7)超声次数选择
①供试样品溶液的制备：精密称定白及样品三份，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL。第一份室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，转移至25mL容量瓶中，加75％的甲醇定容，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得。第二份室温下超声30min后收集上清液，滤渣加入25mL 75％甲醇继续超声30min，取出，收集上清液。合并两次上清液，蒸干溶剂后用75％甲醇超声溶解，容量瓶定容至25mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。第三份室温下超声30min后收集上清液，滤渣加入25mL 75％甲醇继续超声30min，取出，取上清液，滤渣再次加入25mL 75％甲醇超30min，取出，收集上清液，合并三次上清液，蒸干溶剂后用75％甲醇超声复溶，用容量瓶定容至25mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
步骤②同(1)、②。
③指纹图谱建立及结果分析：从响应值来看，超声次数越多，反而降低了各峰响应，因此采用选用超声1次。不同超声次数提取白及小分子色谱图比较结果见图7。
(8)最终确定的白及供试样品溶液制备提取条件
供试样品溶液的制备：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
实施例2：白及色谱条件确定
(1)不同柱温选择
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
②高效液相色谱分析条件：比较不同柱温25℃、35℃、45℃对分离性能的影响，其它条件同实施例1(1)、②。
③指纹图谱建立及结果分析：温度越高，白及的指纹图谱色谱峰越好，但是考虑到较高的柱温会影响柱子的寿命。因此选择常规35℃作为测试。不同柱温下白及小分子特征指纹图谱比较结果见图8。
(2)不同流速选择
步骤①同实施例2(1)、①。
②高效液相色谱分析条件：比较0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min流速下白及色谱图，其它条件同实施例1(1)、②。
③指纹图谱建立及结果分析：0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min流速，各有优势；但是考虑到0.8mL/min的流速会造成色谱峰后移，分析时间相对会延长，而1.2mL/min的流速增加柱子的压力，因此采用常规流速1mL/min。不同流速下白及小分子特征指纹图谱比较结果见图9。
(3)不同品牌C18液相色谱柱的选择
步骤①同实施例2(1)、①。
②高效液相色谱分析条件：比较不同品牌的C18液相色谱柱对白及指纹图谱的影响，表2，其它条件同实施例1(1)、②。
表2不同品牌色谱柱
Figure BDA0002600067380000141
③指纹图谱建立及结果分析：不同品牌C18色谱柱下白及色谱图整体峰形相似，各色谱峰保留时间及峰面积相差不大，说明建立的指纹图谱分析方法对不同品牌C18色谱柱有普适性。不同色谱柱下白及小分子特征指纹图谱比较结果见图10。
(4)不同洗脱梯度的选择
步骤①同实施例2(1)、①。
②高效液相色谱分析条件：本实施例优化了3个洗脱梯度，其它条件同实施例1(1)、②。
表3洗脱梯度1
Figure BDA0002600067380000151
表4洗脱梯度2
Figure BDA0002600067380000152
表5洗脱梯度3
Figure BDA0002600067380000153
③指纹图谱建立及结果分析：经过白及指纹图谱色谱条件优化最终选择了洗脱梯度3，即色谱条件为安捷伦1200LC高效液相色谱仪；Stamsil-BpC18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸水，B相：乙腈；检测波长280nm；柱温35℃；流速1.0mL/min，进样量10μL。图11为选用的洗脱梯度(洗脱梯度3)的色谱图。
(5)最终确定的白及色谱条件
安捷伦1200LC高效液相色谱仪；Stamsil-BpC18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸水，B相：乙腈；检测波长280nm；柱温35℃；流速1.0mL/min，进样量10μL。白及洗脱梯度见表5。
实施例3：白及指纹图谱方法学确定
(1)白及指纹图谱精密度确定
①供试样品溶液制备：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液。
②高效液相色谱分析条件：安捷伦1200LC高效液相色谱仪；Stamsil-BpC18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸水，B相：乙腈；检测波长280nm；柱温35℃；洗脱梯度如表1，流速1.0mL/min，进样量10μL。
③取同一批白及样品，按供试样品溶液制备方法制备后，进样分析测定，连续进样6次，记录各色谱峰保留时间和峰面积，以白及2号色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算样品中主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并求出对应的相对标准偏差(RSD，n＝6)和平均值(Mean)。
④指纹图谱建立及结果分析：白及样品精密性试验6张图谱的相对保留时间(见表7)的RSD值均小于0.01％，相对峰面积(见表6)的RSD值均小于3％，符合指纹图谱精密性试验要求。白及小分子特征指纹图谱精密性试验色谱图见图12。
表6白及指纹图谱精密度试验(相对保留峰面积)
Figure BDA0002600067380000161
表7白及指纹图谱精密度试验(相对保留时间)
Figure BDA0002600067380000162
(2)白及指纹图谱精密度确定
①、②同实施例3(1)①、②。
③取同一批白及样品6份，分别按照供试样品溶液制备方法制备后，进样分析测定，记录各色谱峰保留时间和峰面积，以参照物色谱峰(2号色谱峰)的保留时间和峰面积为参照，计算样品中主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并求出对应的相对标准偏差(RSD，n＝6)和平均值(Mean)。
④指纹图谱建立及结果分析：白及样品重复性试验6张图谱的相对保留时间(见表9)的RSD值均小于0.1％，相对峰面积(见表8)的RSD值均小于5％，符合指纹图谱重复性试验要求。白及小分子特征指纹图谱重复性试验色谱图见图13。
表8白及指纹图谱重复性试验(相对保留峰面积)
Figure BDA0002600067380000171
表9白及指纹图谱重复性试验(相对保留峰时间)
Figure BDA0002600067380000172
(3)白及指纹图谱稳定性确定
①、②同实施例3(1)①、②。
③取白及样品1份，按照供试品溶液制备方法制备后，进样分析测定，记录各色谱峰保留时间和峰面积，以白及参照物色谱峰(2号色谱峰)的保留时间和峰面积为参照，计算样品中主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，并求出对应的相对标准偏差(RSD，n＝6)和平均值(Mean)。
④指纹图谱建立及结果分析：白及样品稳定性试验6张图谱的相对保留时间(见表11)的RSD值均小于0.1％，相对峰面积(见表10)的RSD值均小于3％，符合指纹图谱稳定性试验要求。白及小分子特征指纹图谱稳定性试验色谱图见图14。
表10白及指纹图谱稳定性试验(相对保留峰面积)
Figure BDA0002600067380000181
表11白及指纹图谱稳定性试验(相对保留峰时间)
Figure BDA0002600067380000182
(4)白及指纹图谱方法学最终确定结果
本发明重现性良好，各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于0.1％；精密度实验中各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间小于0.1％，样品在24小时之内稳定性良好。说明各共有色谱峰能够客观地反映白及的内在品质，可以作为白及的质量控制性指标。
实施例4：最终确立的白及小分子特征指纹图谱分析方法
(1)供试样品溶液的制备：精密称定白及样品，粉碎，过四号筛，得到白及粉末1.00g，置100mL具塞的锥形瓶中，加入75％的甲醇25mL，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，放冷，摇匀，0.45μm微孔膜过滤，即得到标准样品溶液；
(2)高效液相色谱分析条件：
仪器型号：安捷伦1200LC高效液相色谱仪；
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；
流动相：二元梯度洗脱系统，A相：0.2％甲酸水，B相：乙腈；
检测波长：280nm；
柱温：35℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
白及洗脱梯度见表5。
(3)标准指纹图谱的测定：选取3个色谱峰为白及指纹图谱特征峰，其中2号峰为参照峰，经标准品比对为1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)。所述白及的标准指纹图谱中的3个特征峰的保留时间分别为：24.39min、32.61min、和51.91min，其中，保留时间为32.61min的峰为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品的特征峰。白及小分子特征指纹图谱见图15。
实施例5：紫花白及小分子特征指纹图谱建立
(1)、(2)同实施例4(1)、(2)。
(3)标准指纹图谱的测定：按照本发明提供的方法，对10批紫花白及药材建立了HPLC指纹图谱，图17为其中一个批次紫花白及小分子特征指纹图谱。
实施例6：水白及小分子特征指纹图谱建立
(1)、(2)同实施例4(1)、(2)。
(3)标准指纹图谱的测定：按照本发明提供的方法，对10批水白及药材建立了HPLC指纹图谱，图18为其中一个批次水白及小分子特征指纹图谱。
实施例7：华白及小分子特征指纹图谱建立
(1)、(2)同实施例4(1)、(2)。
(3)标准指纹图谱的测定：按照本发明提供的方法，对22批华白及药材建立了HPLC指纹图谱，图19为其中一个批次华白及小分子特征指纹图谱。
实施例8：小白及小分子特征指纹图谱建立
(1)、(2)同实施例4(1)、(2)。
(3)标准指纹图谱的测定：按照本发明提供的方法，对53批小白及药材建立了HPLC指纹图谱，图20为其中一个批次小白及小分子特征指纹图谱。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种白及特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括：
提取待测白及样品溶液，采用高效液相色谱分析，获得白及特征指纹图谱，所述高效液相色谱分析的条件为：
检测波长：280nm，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，洗脱梯度：
Figure FDA0002600067370000011
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的提取采用的溶剂为甲醇，体积浓度为75％。
3.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于，所述的提取中的料液比为1∶25(g/mL)。
4.根据权利要求1-3任一所述的建立方法，其特征在于，所述的白及选自紫花白及、华白及、水白及或小白及。
5.根据权利要求1-4任一所述的建立方法，其特征在于，所述的白及特征指纹图谱中含有3个特征峰，其中一个为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的特征峰。
6.根据权利要求1-5任一所述的建立方法，其特征在于，所述的白及特征指纹图谱中含有3个特征峰，保留时间分别为：24.39min、32.61min、和51.91min，其中，保留时间为32.61min的特征峰为1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯。
7.根据权利要求1-6任一所述的建立方法，其特征在于，所述的建立方法包括如下步骤：
取白及、粉碎、过筛获得白及粉末，以料液比1∶25(g/mL)加入75％的甲醇，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，然后过滤得到待测白及样品溶液；
采用高效液相色谱分析待测白及样品溶液，所述高效液相色谱分析的条件为：
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，
检测波长：280nm，
柱温：35℃，
流速：1mL/min，
进样量：10μL，
洗脱梯度：
Figure FDA0002600067370000021
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算待测白及样品溶液的各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，获得白及特征指纹图谱。
8.一种白及的检测方法，其特征在于，所述的方法包括：
提取待测样品溶液，采用高效液相色谱分析，所述高效液相色谱分析的条件为：
检测波长：280nm，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，洗脱梯度：
Figure FDA0002600067370000022
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括确定不同样品是否是白及，或者确定样品中是否存在白及，或者确定样品中白及的含量，或者确定白及样品中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：
取白及、粉碎、过筛获得白及粉末，以料液比1∶25(g/mL)加入75％的甲醇，室温下超声30min，超声功率280W，频率40KHz，然后过滤得到待测白及样品溶液；
采用高效液相色谱分析待测白及样品溶液，所述高效液相色谱分析的条件为：
色谱柱：Stamsil-BpC18色谱柱，
流动相：A相为0.2％甲酸水，B相为乙腈，
检测波长：280nm，
柱温：35℃，
流速：1mL/min，
进样量：10μL，
洗脱梯度：
Figure FDA0002600067370000031
其中，以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算待测白及样品溶液的各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，获得白及特征指纹图谱。
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