CN115575551A - 白及的检测方法、白及对照提取物的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白及的检测方法、白及对照提取物的制备及其应用，该应用是通过制备白及对照提取物，利用白及对照提取物建立白及UPLC指纹图谱及含量测定的测定方法。共标定了17个共有峰，以主成分分析（PCA）得到对照提取物四个化合物，累计方差贡献率为83.709%，可在较大程度上反映白及药材或饮片的信息。同时，以所建立的UPLC指纹图谱条件进行白及药材及饮片的含量测定，与单一对照品进行含量测定结果相比无显著差异性，且经方法学考察，证明本方法重现性、精密度、稳定性、加样回收率及线性关系良好，可用于白及药材及饮片的含量测定。

Description

白及的检测方法、白及对照提取物的制备及其应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种白及的检测方法、白及对照提取物的制备及其应用。
背景技术
白及为兰科植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥块茎，又名“白芨”“白蔹”“白根”“甘根等。其味苦、甘、涩，性微寒，归肺、肝、胃经，具有收敛止血、消肿生肌的功效。主要用于治疗咯血、吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂等。被广泛的应用于医药、保健食品、日用化工、化妆品、胃镜保护剂、天然添加剂、膜化材料等各个领域。现代研究表明，白及化学成分多样，主要有联苄类、2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基苄酯类、糖苷类、菲类、酯类成分，具有止血、保护胃黏膜、抗溃疡、抗炎、抗菌、抗癌、免疫调节等药理作用。然而，由于白及药材质量控制水平低，在一定程度上制约了白及产业的发展。
目前，中药质量控制大多借鉴化学药品控制模式，但由于中药成分复杂，中药化学对照品制备技术和成本要求高，难以大量生产。此外，某些中药对照品不稳定，为使用、储存和运输造成困难，同时，多种化学对照品的使用，使得中药材质量控制成本大幅提高，现实可行性不强。中药对照提取物用于中药材质量控制的思路随即被提出，对照提取物指经特定提取工艺制备的含有多种主要有效成分或指标性成分，用于中药材(饮片)、提取物、中成药等鉴别或含量测定用的国家药品标准物质，可用于中药材的质量控制，对照提取物相比单一对照品制备方法更简单、检测成本更低、适用性更好。以对照提取物为基础建立中药材指纹图谱，可对中药材及其制剂质量的真实性、优良性和稳定性进行综合评价。同时，使用对照提取物代替单一对照品同时对药材及饮片多个成分进行含量测定，更能反映中药的整体质量。
基于此，本发明提供一种利用对照提取物建立白及指纹图谱、含量测定和薄层鉴别的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白及的检测方法、白及对照提取物的制备及其应用。
本发明的技术方案：
一种白及对照提取物的制备方法，包括如下步骤：取白及药材，粉碎，精密称定4.0～6.0g，以乙醇作为溶剂，料液比0.5～1.5g:30～50mL，超声，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏；将浸膏与PRP-512B型反相树脂上柱，依次以水、20％乙醇、40％乙醇进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物。
前述白及对照提取物的制备方法，包括如下步骤：取白及药材，粉碎，过三号筛，精密称定5.0g，以55％乙醇作为溶剂，料液比1g:40mL，超声56min，超声功率344W，超声频率40KHz，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏；将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱或将浸膏溶于纯水中充分溶解后湿法上样，依次以3个柱体积的水、2个柱体积的20％乙醇、3个柱体积的40％乙醇进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物。
一种白及的检验方法，对白及进行提取，得提取溶液，所述检测方法包括指纹图谱及含量测定方法，所述指纹图谱及含量测定方法包括对提取溶液中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的指纹图谱及含量测定。
前述dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的指纹图谱及含量测定按照以下步骤进行：
(1)供试品溶液的制备：取白及饮片样品，粉碎，精密称定0.1～0.3g，置于具塞锥形瓶中，加入40～60％乙醇5～15mL，塞紧瓶盖后，称定重量，超声提取，放冷后，称定，用乙醇补足损失，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；
(2)白及对照提取物溶液的制备：精密称取白及对照提取物4.50～5.50mg，置10mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照提取物溶液；
(3)混合对照品溶液的配制：分别精密称取dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine对照品适量，加乙醇溶解，配制成混合对照品溶液；
(4)色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1x100mm，1.8μm)；流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈；进行梯度洗脱；进样量2μL；流速0.15mL/min；柱温35℃；检测波长220nm；
(5)含量测定法：分别吸取白及对照提取物溶液、供试品溶液和混合对照品溶液，注入UPLC高效液相色谱仪，分别采用白及对照提取物法和单体对照品法计算样品中的dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine4个成分的含量。
(6)militarine作为《中国药典》2020年版评价白及质量的指标性成份，其峰面积较大，峰形较好，比较稳定，所以选择militarine作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，共有峰峰面积数据导入IBM SPSS Statistics 26软件，以降维因子对白及饮片样品进行主成分分析，根据特征值和累计贡献率，建立白及UPLC指纹图谱。
前述白及的检验方法，步骤(1)中，所述供试品溶液的制备：取白及饮片样品，粉碎后过四号筛，精密称定0.2g，置于具塞锥形瓶中，加入50％乙醇10mL，塞紧瓶盖后，称定重量，超声提取30min，超声功率400W，频率40kHz，放冷后，称定，用50％乙醇补足损失，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
前述白及的检验方法，步骤(2)中，所述白及对照提取物溶液的制备：精密称取白及对照提取物5.12mg，置10mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照提取物溶液。
前述白及的检验方法，步骤(3)中，所述混合对照品溶液的配制：分别精密称取dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine对照品适量，加50％乙醇溶解，配制成质量浓度分别为0.2004mg/mL、0.4000mg/mL、0.1050mg/mL、1.2100mg/mL的混合对照品溶液；
前述白及的检验方法，步骤(4)中，所述梯度洗脱程序为：0～2min，18％～20％B；2～3min，20％～20％B；3～6min，20％～22％B；6～7min，22％～23％B；7～9min，23％～24％B；9～12min，24％～26％B；12～16min，26％～28％B；16～20min，28％～100％B；20～24min，100％～100％B。
白及对照提取物在制备止血药物中的应用。
发明效果
本发明提供了一种基于UPLC的方法，建立了以对照提取物为基础的白及的指纹图谱共有模式，共标定了17个共有峰，以主成分分析(PCA)得到对照提取物四个化合物，累计方差贡献率为83.709％，可在较大程度上反映白及药材或饮片的信息。同时，以所建立的UPLC指纹图谱条件进行白及药材及饮片的含量测定，与单一对照品进行含量测定结果相比无显著差异性，且经方法学考察，证明本方法重现性、精密度、稳定性、加样回收率及线性关系良好，可用于白及药材及饮片的含量测定。
附图说明
图1小鼠止血实验结果；
图2 15批白及饮片UPLC指纹图谱；
图3白及饮片对照指纹图谱(R)；
图4对照提取物色谱图(8-dactylorhin A、9-gymnoside I、12-gymnoside Ⅲ、13-militarine)；
图5 15批白及OPLS-DA得分；
图6白及饮片成分VIP图；
图7混合对照品(A)、药材(B)和对照提取物(C)的UPLC图(1-dactylorhin A、2-gymnoside I、3-gymnoside Ⅲ、4-militarine)；
图8混合对照品(A)、药材(B)和对照提取物(C)的UPLC图(1-dactylorhin A、2-gymnoside I、3-gymnoside Ⅲ、4-militarine)；
图9白及饮片的TLC：1：白及对照提取物(A:dactylorhin A、B:gymnoside Ⅲ、C:militarine、D:gymnoside I)；2～18：不同批次白及样品。
具体实施方式
实施例1：
白及对照提取物的制备方法：取白及药材，粉碎，过三号筛，精密称定5.0g，以55％乙醇作为溶剂，料液比1g:40mL，超声56min，超声功率344W，超声频率40KHz，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏；将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱或将浸膏溶于纯水中充分溶解后湿法上样，依次以3个柱体积的水、2个柱体积的20％乙醇、3个柱体积的40％乙醇进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物。
白及的检验方法，对白及进行提取，得提取溶液，使用指纹图谱及含量测定方法，对提取溶液中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的指纹图谱及含量测定，按照以下步骤进行：
(1)供试品溶液的制备：取白及饮片样品，粉碎后过四号筛，精密称定0.2g，置于具塞锥形瓶中，加入50％乙醇10mL，塞紧瓶盖后，称定重量，超声提取30min，超声功率400W，频率40kHz，放冷后，称定，用50％乙醇补足损失，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；
(2)白及对照提取物溶液的制备：精密称取白及对照提取物5.12mg，置10mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照提取物溶液；
(3)混合对照品溶液的配制：分别精密称取dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine对照品适量，加50％乙醇溶解，配制成质量浓度分别为0.2004mg/mL、0.4000mg/mL、0.1050mg/mL、1.2100mg/mL的混合对照品溶液；
(4)色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1x100mm，1.8μm)；流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈；进行梯度洗脱；进样量2μL；流速0.15mL/min；柱温35℃；检测波长220nm；梯度洗脱程序为：0～2min，18％～20％B；2～3min，20％～20％B；3～6min，20％～22％B；6～7min，22％～23％B；7～9min，23％～24％B；9～12min，24％～26％B；12～16min，26％～28％B；16～20min，28％～100％B；20～24min，100％～100％B；
(5)含量测定法：分别吸取白及对照提取物溶液、供试品溶液和混合对照品溶液，注入UPLC高效液相色谱仪，分别采用白及对照提取物法和单体对照品法计算样品中的dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine4个成分的含量。
(6)militarine作为《中国药典》2020年版评价白及质量的指标性成份，其峰面积较大，峰形较好，比较稳定，所以选择militarine作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，共有峰峰面积数据导入IBM SPSS Statistics 26软件，以降维因子对白及饮片样品进行主成分分析，根据特征值和累计贡献率，建立白及UPLC指纹图谱。发明人为验证本发明的效果进行了以下实验：
实验例：
一、对照提取物制备方法
1.1试验材料与试剂仪器
1.1.1试验材料
白及药材(分别购自四川润渎中藏药业有限公司、贵阳市花果园太升中药市场三楼A23、贵州铜仁、云南普洱、安徽)；1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)对照品(成都洛玛生物科技有限公司，批号：CHB160626，纯度：98％以上)；1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-(6-O-乙酰基)葡萄糖苷(gymnoside III)对照品(成都克洛玛生物科技有限公司，批号：PRF10102503，纯度：98％以上)；1-[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(gymnoside I)和1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷(dactylorhin A)由本课题组从白及药材中分离得到，质量分数均大于98％。
1.1.2试验试剂
色谱乙腈(美国TEDIA公司)；甲酸(美国TEDIA公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(均购自重庆川东化工有限公司)
1.1.3试验仪器
Agilent 1290 infinityⅡ超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括二元梯度泵，高能自动进样器，DAD检测器和色谱工作站；DRHH-2型数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)；FA2204B型万分之一电子天平(上海天美天平仪器有限公司)；MS205DU型十万分之一电子天平(北京中仪汇丰瑞士梅特勒托利多仪器(中国)有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器场)；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RHP-750A型多功能粉碎机(浙江荣浩工贸有限公司)。药典检验筛(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司，GB6003-85)
1.2试验方法
1.2.2对照提取物制备方法(萃取法)
示例1：
取白及药材(购自四川润渎中藏药业有限公司)，粉碎，过三号筛，精密称取10.0g，以50％(v/v)乙醇作为溶剂，料液比1:8(g:mL)，80℃回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至无醇味，加蒸馏水混悬，依次用石油醚乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，合并正丁醇层萃取溶液，减压浓缩干燥，得白及对照提取物0.51g。经测定对照提取物中militarine、dactylorhin A、gymnoside Ⅲ、gymnoside I四种化合物成分含量之和为62％。
示例2：
取白及药材(购自贵阳市花果园太升中药市场三楼A23)，粉碎，过三号筛，精密称取10.0g，以50％(v/v)乙醇作为溶剂，料液比1:8(g:mL)，80℃回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至无醇味，加蒸馏水混悬，依次用石油醚乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，合并正丁醇层萃取溶液，减压浓缩干燥，得白及对照提取物0.49g经测定对照提取物中militarine、dactylorhin A、gymnoside Ⅲ、gymnoside I四种化合物成分含量之和为72.1％。
1.2.3对照提取物制备方法(反相树脂分离法)
示例1：
取白及药材(购自贵州铜仁)，粉碎，过三号筛，精密称定5.0g，以55％(v/v)乙醇作为溶剂，料液比1:40(g:mL)，超声(功率：344W；频率：40KHz)56min，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏。将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱(或将浸膏溶于纯水中，充分溶解后湿法上样)，分别以水(3个柱体积)、20％乙醇(2个柱体积)、40％乙醇(3个柱体积)进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物0.44g。经测定对照提取物中militarine、dactylorhin A、gymnoside Ⅲ、gymnoside I四种化合物成分含量之和为85.3％。
示例2：
取白及药材(购自贵州铜仁)，粉碎，过三号筛，精密称定10.0g，以50％(v/v)乙醇作为溶剂，料液比1:8(g:mL)，80℃回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏。将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱(或将浸膏溶于纯水中，充分溶解后湿法上样)，分别以水(3个柱体积)、20％乙醇(2个柱体积)、40％乙醇(3个柱体积)进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物0.47g。经测定对照提取物中militarine、dactylorhin A、gymnoside Ⅲ、gymnoside I四种化合物成分含量之和为80.1％。
示例3：
取白及药材(购自云南普洱)，粉碎，过三号筛，精密称定5.0g，以55％(v/v)乙醇作为溶剂，料液比1:40(g:mL)，超声(功率：344W；频率：40KHz)56min，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏。将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱(或将浸膏溶于纯水中，充分溶解后湿法上样)，分别以水(3个柱体积)、20％乙醇(2个柱体积)、40％乙醇(3个柱体积)进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物0.45g。经测定对照提取物中militarine、dactylorhin A、gymnoside Ⅲ、gymnoside I四种化合物成分含量之和为86.79％。
示例4：
取白及药材(购自安徽)，粉碎，过三号筛，精密称定5.0g，以55％(v/v)乙醇作为溶剂，料液比1:40(g:mL)，超声(功率：344W；频率：40KHz)56min，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏。将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱(或将浸膏溶于纯水中，充分溶解后湿法上样)，分别以水(3个柱体积)、20％乙醇(2个柱体积)、40％乙醇(3个柱体积)进行梯度洗脱，收集40％乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物0.46g，经测定对照提取物中militarine、dactylorhin A、gymnoside Ⅲ、gymnoside I四种化合物成分含量之和为85.76％。
二、药理实验
2.1试验材料
KM小鼠,体重18～22g,雌雄各半共100只；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：2BA2202)；载玻片；毛细管(规格0.9-1.1×120mm，宏新新材料科技有限公司)；羧甲基纤维素(福晨化学试剂有限公司，批号：20220304)。
2.2对小鼠凝血时间的影响(毛细玻管法)
小鼠100只,共分空白对照组(等体积的0.1％-CMC钠溶液)、云南白药组(即阳性对照组,0.75g/kg)，对照提取物组(2.5g生药/kg)，共4组,试验小鼠每个剂量组10只,雌雄各半。每日灌胃给药2次,两次间隔6h以上，连续5d。末次给药后30min,用内径1mm、长10cm的毛细玻管插入小鼠内毗球后静脉丛取血,深约4∽5mm,轻轻转动再缩回。自血流入管内开始记时,每隔30s折断毛细玻管一小截,检查有无血凝丝出现。记录从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间,此即为凝血时间。见表1
表1 毛细玻管法实验结果
组别 剂量 凝血时间
空白对照组 0 105.00±5.67<sup>*</sup>
云南白药组 0.5g/kg 71.25±5.49
对照提取物组 2.5g生药/kg 67.50±4.91
注：与云南白药阳性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.3对小鼠凝血时间的影响(玻片法)
分组及给药情况同2,末次给药后30min,用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球即有血液流出,于载玻片上滴1滴血,血滴直径约5mm,立即记时,每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1次,并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止,所历时间即为凝血时间。见表2
表2 毛细玻管法实验结果
组别 剂量 凝血时间
空白对照组 0 123.00±9.43<sup>*</sup>
云南白药组 0.5g/kg 78.00±8.00
对照提取物组 2.5g生药/kg 69.00±9.00
注：与云南白药阳性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.4对小鼠出血时间的影响(尾静脉出血法)
分组及给药情况同2,末次给药后30min,将小鼠固定,露鼠尾于外,用手术刀于距小鼠尾尖0.5cm处割断，待血液自行溢出时开始计时，每隔30s用滤纸吸附血滴1次，直至滤纸吸附无血迹。人工形成创面到出血停止所经时间为小鼠出血时间。见表3
表3 毛细玻管法实验结果
组别 剂量 出血时间
空白对照组 0 375.00±33.54<sup>**</sup>
云南白药组 0.5g/kg 202.50±43.08
对照提取物组 2.5g生药/kg 93.75±8.85<sup>**</sup>
注：与云南白药阳性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
经药理实验验证，对照提取物组小鼠凝血、止血时间与空白对照组相比均有显著的缩短；与云南白药组止血作用相当，甚至在某些指标上显著优于云南白药组。
三、建立白及UPLC指纹图谱、UPLC含量测定和薄层鉴别的测定方法
3.1仪器
1290 infinityⅡ超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括二元梯度泵，高能自动进样器，DAD检测器和色谱工作站；FA2204B电子天平(上海天美天平仪器有限公司)；AG135电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；DZ-2BCIV真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SB-4200DTD型超声波清洗机(宁波薪芝超声设备有限公司)；SHZ-DⅢ循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RHP-750A多功能粉碎机(浙江荣浩工贸有限公司)。
3.2药品与试剂
1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)对照品(成都洛玛生物科技有限公司，批号：CHB160626，纯度：98％以上)；1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-(6-O-乙酰基)葡萄糖苷(gymnoside III)对照品(成都克洛玛生物科技有限公司，批号：PRF10102503，纯度：98％以上)；1-[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(gymnoside I)和1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷(dactylorhin A)由本课题组从白及药材中分离得到，质量分数均大于98％。白及对照提取物自制(militarine、gymnoside III、gymnoside I和dactylorhin A含量之和大于70％)，色谱乙腈(美国TEDIA公司)；磷酸(重庆川东化工有限公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其余试剂均为分析纯。
3.3色谱条件
色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1x100mm，1.8μm)；流动相为0.05％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱程序为：0～2min，18％～20％B；2～3min，20％～20％B；3～6min，20％～22％B；6～7min，22％～23％B；7～9min，23％～24％B；9～12min，24％～26％B；12～16min，26％～28％B；16～20min，28％～100％B；20～24min，100％～100％B；进样量2μL；流速0.15mL/min；柱温35℃；检测波长220nm。
3.4供试品溶液的制备
取15批白及饮片样品，粉碎后过四号筛，精密称定0.2g，置于具塞锥形瓶中，加入50％乙醇10mL，塞紧瓶盖后，称定重量。超声提取30min(功率400W，频率40kHz)。放冷后，称定，用50％乙醇补足损失。摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
3.5白及对照提取物溶液的制备
精密称取白及对照提取物5.12mg，置10mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine浓度分别为0.07898mg/mL、0.02307mg/mL、0.04955mg/mL、0.30197mg/mL的对照提取物溶液。
3.6白及饮片指纹图谱的建立
3.6.1药材来源
15批不同来源的白及药材，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，15批白及饮片收集信息祥见表4。
表4 白及饮片收集信息
药材编号 药材产地 购买公司/店铺 产品批号
S1 湖北 深圳市民心大药房连锁有限公司海昌街分店 170801
S2 昆明 安徽合肥药缘大药房 190401
S3 贵州铜仁 深圳市南北药行连锁有限公司-南北药行花果山二分店 180802--03
S4 四川 深圳市文华区医药海昌药店 20181101
S5 云南 广东天城中药饮片有限公司 180901
S6 安徽 晋江市弘德国医馆 /
S7 贵州 晋江市阳光大药房宝龙分店 180801
S8 云南 安国市远光药业有限公司 220191001
S9 云南普洱 亳州市永刚饮片厂有限公司 190613
S10 广西 山西太原仁和中药房 /
S11 四川 贵州一品药业 160101
S12 贵州 贵州同济堂 /
S13 贵州 北京同仁堂 /
S14 贵州 北京京芝堂润丰药业 /
S15 广东 北京金象大药业 /
3.6.2参照峰的选择
Militarism作为《中国药典》2020年版评价白及质量的指标性成份，其峰面积较大，峰形较好，比较稳定，所以选择militarine作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。
3.6.3精密度实验
取S13白及供试品溶液，按照“3.3”项下色谱条件连续进样6次，以militarine作为参照峰，记录各共有峰相对保留时间及相对峰面积，利用Excel内置函数，分别算出RSD值。结果显示各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.45％，相对峰面积RSD值均小于1.21％，证明仪器精密度良好。
3.6.4稳定性实验
取S13白及供试品溶液，分别在放置0、4、8、12、16、24h时按照“3.3”项下色谱条件进行分析，以militarine作为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，利用Excel内置函数，分别算出RSD值。结果显示各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.46％，相对峰面积RSD值均小于1.79％，证明所制得样品溶液于24h之内稳定性良好。
3.6.5重复性实验
取S13白及饮片样品，分别精密称定6份每份0.2g，平行制备6份供试品溶液，按照“3.3”项下色谱条件进行分析，以militarine作为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，利用Excel内置函数，分别算出RSD值。结果显示各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.37％，相对峰面积RSD值均小于1.94％，证明该方法重复性良好。
3.6.6 15批药材指纹图谱的建立
取采集到的15批白及样品，按照“3.4”项下方法制备供试品溶液，照“3”项下色谱条件进样，记录色谱图，将色谱图上各个峰以手动积分对各个峰进行积分。将色谱图以AIA格式导出，输入至中药指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，以S13样品的色谱图作为参照色谱，生成对照图谱，并进行相似度评价。结果15批白及药材共标定17个共有峰，15批白及UPLC指纹图谱如图2所示，对照指纹图谱如图3所示，混合对照品图谱如图4所示。相似度评价结果，15批白及饮片UPLC指纹图谱的相似度在0.961∽1.000范围内，见表5。
表5 15批白及药材指纹图谱相似度评价结
Figure BDA0003855469450000111
Figure BDA0003855469450000121
3.6.7偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)
本实验采用SIMCA 14.1软件，以监督模式识别方法进行了各组间的OPLS-DA，来观察各组间差异。结果如图5所示，将15批白及样品分为4类，其中S1、S6、S9、S15号白及样品为第一类，S2、S3、S4、S5、S7、S10为第二类，S8、S11为第三类，S12、S13、S14为第四类。
为了反映白及UPLC指纹图谱17个共有峰，对白及饮片共性表征的重要度，利用SIMCA14.1绘制了17个共有峰的VIP图，如图6所示。以15批白及饮片17个共有峰相对峰面积的数据差异进行整体分析，得到变重权重重要性排序预测值，一般认为VIP值越大越重要，当VIP值大于1的变量为较重要值，小于0.5的变量为不重要值，筛选得到具有统计学意义的8个成分。17个共有峰影响程度依次为峰13>峰8>峰12>峰3>峰9>峰6>峰4>峰5>峰7>峰15>峰2>峰17>峰11>峰10>峰16>峰1>峰14。其中VIP值大于0.5的有峰13、峰8、峰12、峰3、峰9、峰6、峰4、峰5这8个成分，但由于峰3与其它峰分离度较差，且保留时间与溶剂峰保留时间相近，峰面积存在叠加，难以测定其真实峰面积，故舍弃3号峰。剩余7个成分可指认其中的4个，分别为峰13(militarine)、峰8(dactylorhin A)、峰12(gymnoside Ⅲ)和峰9(gymnoside I)，其中峰13、峰8、峰12的VIP值均大于1，峰9的VIP值大于0.75，以此为基础可筛选出白及饮片中4个具有代表性成分。
3.6.8主成分分析(PCA)
将15批不同来源白及饮片药材17个共有峰峰面积数据导入IBM SPSS Statistics26软件，以降维因子对15批白及饮片样品进行主成分分析，特征值和累计贡献率见表6。由表6可知，特征根大于1的前5个主成分，其累计方差贡献率为91.069％大于了90％，主成分1的特征值为7.337，贡献率为43.161％；主成分2的特征值为3.745，贡献率为22.032％；主成分3的特征值为2.087，贡献率为12.279％；主成分4的特征值为1.251，贡献率为7.36％；主成分5的特征值为1.06，贡献率为6.237％。主成分分析中特征值的变化曲线存在明显的过渡点，说明前5个主成分的分析结果可以基本显示不同批次白及饮片药材之间的相似度和差异性。结合OPLS-DA分析可知，主成分1为13号峰(militarine)、主成分2为8号峰(dactylorhin A)、主成分3为12号峰(gymnoside Ⅲ)、主成分4为3号峰、主成分5为9号峰(gymnoside I)，剔除分离度较差、峰面积存在叠加的3号峰，其余4个主成分的累计贡献率达到83.709％，能比较全面地反映白及饮片药材指纹图谱共有峰的大部分信息。
表6 特征值和累计贡献率
Figure BDA0003855469450000131
3.7应用对照提取物对白及药材及饮片进行含量测定
3.7.1白及对照提取物标定
以dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine对照品为对照，测定白及对照提取物中4个指标成分的含量。
3.7.1.1色谱条件
色谱条件同“3.3”，混合对照品、药材和白及对照提取物色谱图见图7。
3.7.1.2混合对照品溶液的配制
分别精密称取dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine对照品适量，加50％乙醇溶解，配制成质量浓度分别为0.2004mg/mL、0.4000mg/mL、0.1050mg/mL、1.2100mg/mL的混合对照品溶液A。
3.7.1.3对照提取物供试品溶液配制
精密称取白及对照提取物5.12mg，置10mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度、摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.7.1.4线性关系考察
将上述混合照品溶液A分别稀释10倍、50倍得到混合对照品溶液B、C；按“3.3”项下色谱条件，混合对照品溶液A分别进样1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，混合对照品溶液B分别进样1μL、3μL、5μL，混合对照品溶液C分别进样1μL、2μL、3μL，测定各成分的峰面积，以各成分的进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程，相关系数(r)均大于0.9999，线性关系良好；以色谱图中信噪比(S/N)约为3时的进样量为最小检测限(LOD)，信噪比(S/N)约为10时的进样量为最低定量限(LOQ)。结果见表7。
表7 4个指标成分的回归方程及线性范围
化合物 线性回归方程 r 线性范围/(μg) LOQ/(ng) LOD/(ng)
dactylorhin A Y＝8518.3X+1.1098 1.0000 0.00401～1.002 0.20040 0.08016
gymnoside Ⅰ Y＝7621.7X+7.4229 1.0000 0.00800～2.000 0.24000 0.08000
gymnoside Ⅲ Y＝7600.9X-0.2938 1.0000 0.0021～0.5250 0.10500 0.04200
militarine Y＝9294.9X+87.351 0.9999 0.0242～3.6300 0.24200 0.14520
3.7.1.5精密度试验
精密吸取“3.7.1.2”项下的混合对照品溶液，按“3.3”项下色谱条件连续进样6次，测定dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的峰面积，计算峰面积的RSD值，结果分别为0.13％、0.20％、0.38％、0.11％，表明仪器精密度良好，结果见表8。
表8 精密度试验
Figure BDA0003855469450000141
Figure BDA0003855469450000151
3.7.1.6重复性试验
取白及对照提取物按“3.7.1.3”项下方法平行制备6份白及对照提取物供试品溶液，按照“3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积。计算供试品溶液中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的质量分数，其平均值分别为15.21％、4.47％、9.50％、58.22％，RSD值分别为1.08％、1.26％、1.08％、0.91％，表明该方法重复性良好，结果见表9。
表9 重复性试验(％)
制备次数 1 2 3 4 5 6 RSD/％
dactylorhin A 15.12 15.42 15.11 15.43 15.08 15.11 1.08
gymnoside Ⅰ 4.54 4.49 4.45 4.51 4.46 4.37 1.26
gymnoside Ⅲ 9.45 9.55 9.45 9.68 9.47 9.39 1.08
militarine 58.01 58.75 58.10 58.98 57.91 57.59 0.91
3.7.1.7稳定性试验
按“3.7.1.3”项下方法制备白及对照提取物供试品溶液1份，按照“3.3”项下色谱条件，分别于0h、2h、6h、8h、10h、24h进样测定，记录峰面积。计算供试品溶液中dactylorhinA、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的峰面积的RSD值，分别为0.35％、0.14％、0.39％、0.28％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，结果见表10。
表10 稳定性试验
进样时间/h 0 2 6 8 10 24 RSD/％
dactylorhin A 1314.9 1322.2 1324.0 1328.0 1323.7 1326.7 0.66
gymnoside Ⅰ 349.2 348.3 351.6 355.4 357.2 353.0 0.66
gymnoside Ⅲ 731.5 738.2 743.6 740.8 742.7 740.5 0.67
militarine 5564.0 5582.7 5612.2 5622.2 5625.4 5634.1 0.35
3.7.1.8加样回收率试验
取同一批已知含量的白及对照提取物5.25mg，精密称定，置10mL容量瓶中，平行6份，分别精密加入不同浓度的dactylorhin A(0.76700mg/mL)、gymnoside I(0.2200mg/mL)、gymnoside Ⅲ(0.48480mg/mL)、militarine(2.98400mg/mL)对照品溶液各1mL，再加入50％乙醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过。按“3.6.2.1.1”项下的色谱条件进样，记录各成分峰面积，计算dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的加样回收率分别97.16％、97.78％、104.10％、96.10％，RSD值分别为2.23％、2.99％、2.02％、1.17％，表明该方法准确度良好，结果见表11。
表11加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0003855469450000161
3.7.1.9白及对照提取物标定结果
精密称取白及对照提取物5.12mg，置10mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，取适宜续滤液按“3.3”项下色谱条件进样检测，测定白及对照提取物中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的含量分别为15.10％、4.42％、9.43％、57.75％。
3.7.2对照提取物在白及药材质量控制中的应用
以白及对照提取物为对照，测定白及药材中dactylorhin A、gymnoside I、gymnosideⅢ、militarine共4个成分的含量，并与单体对照品测得的结果进行比较，考察对照提取物用于药材质量控制的科学性和可行性。
3.7.2.1对照提取物溶液制备
精密称取白及对照提取物5.12mg，置10mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine浓度分别为0.07898mg/mL、0.02307mg/mL、0.04955mg/mL、0.30197mg/mL的对照提取物溶液A；将上述对照提取物溶液A分别稀释10倍、50倍，作为白及对照提取物溶液B、C。
3.7.2.2白及药材供试品溶液制备
取药材粉末约0.20g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液10mL，称定重量，超声(400W,40kHz)处理30min，放冷。再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.7.2.3色谱条件
色谱条件同“3.3”项下条件。对照提取物和白及药材样品色谱图见图8。
3.7.2.4线性关系
将“3.7.2.1”项下的对照提取物溶液A分别进1μL、2μL、3μL、4μL、5μL；对照提取物溶液B分别进1μL、2μL；对照提取物溶液C进2μL；以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程，相关系数(r)均大于0.9999，线性关系良好；以色谱图中信噪比(S/N)约为3时的进样量为最小检测限(LOD)，信噪比(S/N)约为10时的进样量为最低定量限(LOQ)；结果见表12。
表12 对照提取物线性关系考察
指标成分 线性回归方程 r 线性范围/(μg)
dactylorhin A Y＝8470.7X+0.2917 1.0000 0.00316～0.39489
gymnoside Ⅰ Y＝7712.5X+1.0852 0.9999 0.00092～0.11537
gymnoside Ⅲ Y＝7562.4X+0.1996 1.0000 0.00198～0.24775
militarine Y＝9446.1X-6.4627 1.0000 0.01208～1.50984
3.7.2.5精密度试验
精密吸取“3.7.2.1”项下的对照提取物溶液，按“3.3”项下色谱条件连续进样6次，测定dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的峰面积，计算峰面积的RSD值，结果分别为0.28％、0.32％、0.58％、0.001％，表明仪器精密度良好，结果见表13。
表13 精密度试验
进样次数 1 2 3 4 5 6 RSD/％
dactylorhin A 1314.9 1314.2 1317.1 1314.9 1322.2 1322.0 0.28
gymnoside Ⅰ 349.2 350.5 349.1 351.4 348.3 349.4 0.32
gymnoside Ⅲ 731.5 734.7 732.4 735.8 738.2 743.3 0.58
militarine 5564.0 5564.6 5574.2 5573.1 5582.2 5575.5 0.001
3.7.2.6稳定性试验
取白及药材样品粉末，按“3.7.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“3.6.2.2.3”项下色谱条件，分别于0h、2h、6h、8h、24h、48h进样测定，记录峰面积。计算供试品溶液中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的峰面积RSD值，分别为0.66％、0.66％、0.67％、0.35％，表明供试品溶液在48h内稳定，结果见表14。
表14 稳定性试验
进样时间/h 0 2 6 8 24 48 RSD/％
dactylorhin A 1762.8 1722.1 1731.2 1732.7 1729.7 1741.7 0.66
gymnoside Ⅰ 436.3 436.1 437.7 436.8 429.6 438.5 0.66
gymnoside Ⅲ 1057.4 1070.5 1078.6 1071.1 1077.0 1081.9 0.67
militarine 7490.2 7518.2 7544.5 7546.8 7547.2 7551.8 0.35
3.7.2.7重复性试验
取同一批白及药材样品粉末，按“3.7.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积。计算供试品溶液中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的质量分数，其平均值分别为5.03mg/g、1.39mg/g、3.55mg/g、19.95mg/g，RSD值分别为0.48％、0.27％、0.53％、0.30％，表明该方法重复性良好，结果见表15。
表15 重复性试验(mg/g)
制备次数 1 2 3 4 5 6 RSD/％
dactylorhin A 5.04 5.05 4.99 5.04 5.06 5.03 0.48
gymnoside Ⅰ 1.39 1.40 1.39 1.39 1.39 1.39 0.27
gymnoside Ⅲ 3.52 3.58 3.56 3.56 3.55 3.56 0.53
militarine 19.93 20.05 19.91 19.87 19.96 19.96 0.30
3.7.2.8加样回收率试验
取已知含量的同一批白及药材样品粉末约0.10g，精密称定，置于10mL具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液9mL，称定重量，超声(400W,40kHz)处理30min，放冷。再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，再精密加入配制好的白及对照提取物溶液1mL，摇匀，平行制备6份。按“3.3”项下的色谱条件进样测定各成分含量，计算其回收率分别101.53％、98.42％、101.44％、99.59％，RSD值分别为1.06％、1.25％、1.47％、0.75％，表明建立的含量测定方法准确度好。结果见表16。
表16 加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0003855469450000181
Figure BDA0003855469450000191
3.7.2.9药材含量测定
取18批购买的白及药材(样品信息见表15)，精密称定，按“3.7.2.2”项下方法制备白及供试品溶液，按“3.3”色谱条件，进样测定峰面积，分别采用白及对照提取物法和单体对照品法计算样品中的(A:dactylorhin A；B:gymnoside I；C:gymnoside Ⅲ；D:militarine)4个成分的含量，结果见表17。
表17 药材信息
Figure BDA0003855469450000192
Figure BDA0003855469450000201
表16 两种方法测定药材中4个指标成分的含量(mg/g)
Figure BDA0003855469450000202
根据表17中的结果，取两种方法测定的不同来源药材中4个成分含量及4个成分含量总和的平均值(对照提取物法：5.85mg/g、1.70mg/g、3.55mg/g、24.60mg/g、35.70mg/g；单体对照品法：5.81mg/g、1.70mg/g、3.53mg/g、24.75mg/g、35.79mg/g)，用SPSS 25.0进行配对样本T检验，在配对样本相关性结果中P<0.05，两组数据有显著的相关性，可进行配对T检验。由配对样本T检验的结果知P＝0.376，P>0.05，说明两组数据无显著差异，两种检测方法结果具备一致性，进一步验证了白及对照提取物可替代单体对照品进行白及药材的含量测定的可行性。
3.8白及对照提取物在薄层鉴别中的应用
取白及粉末(过三号筛)0.2g，加入50％乙醇10mL，超声处理(功率400W，频率40kHz)30min，滤过，滤液蒸干，残渣加入1mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取白及对照提取物配制成33mg/mL的溶液。对照薄层色谱法(通则0502)试验。吸取供试品溶液、对照提取物溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6.5:3.5:1)下层加入0.1mL甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.9讨论
本研究提供的UPLC指纹图谱与含量测定方法，检测时长仅需20分钟，得到的指纹图谱标定出了17个共有峰，并对其中4个主要成分进行了归属，4个主要成分均属于白及对照提取物中的化合物，且均为白及药材中特有的2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基苄酯类化合物，保证了白及药材指纹图谱检测的专属性。同时，以对照提取物建立的含量测定方法与单一对照品相比无显著差异，进一步证明了应用对照提取物建立的指纹图谱和含量测定方法可用于白及药材及饮片的质量控制。
基于对照提取物建立的指纹图谱特征峰多，峰形好，易于鉴别，相似程度高，对照提取物中的成分在谱图峰面积中占比大，可在较大程度上表现出药材的信息，结果准确可靠。本研究所述方法对供试品溶液的制备、色谱条件、测定过程、数据采集、处理、分析均做出了详细的限定，保证了不同操作者、不同实验环境重复作出的结果都在可允许的误差范围内，体现了所述方法的通用性、实用性和重现性。
本研究提供的对照提取物在白及指纹图谱、含量测定和薄层鉴别中应用方法，能有效表征白及中的大部分特征信息，有利于全面监控药材质量，从而确保临床疗效的安全和稳定性。

Claims (9)

1.一种白及对照提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：取白及药材，粉碎，精密称定4.0~6.0g，以乙醇作为溶剂，料液比0.5~1.5g:30~50mL，超声，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏；将浸膏与PRP-512B型反相树脂上柱，依次以水、20%乙醇、40%乙醇进行梯度洗脱，收集40%乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物。
2.根据权利要求1所述白及对照提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：取白及药材，粉碎，过三号筛，精密称定5.0g，以55%乙醇作为溶剂，料液比1g:40mL，超声56 min，超声功率344 W，超声频率40KHz，滤过，减压浓缩药液，置水浴锅上挥干溶剂得浸膏；将浸膏与PRP-512B型反相树脂充分混匀后干法上柱或将浸膏溶于纯水中充分溶解后湿法上样，依次以3个柱体积的水、2个柱体积的20%乙醇、3个柱体积的40%乙醇进行梯度洗脱，收集40%乙醇段流分，减压浓缩干燥，得白及对照提取物。
3.一种白及的检验方法，其特征在于：对白及进行提取，得提取溶液，所述检测方法包括指纹图谱及含量测定方法，所述指纹图谱及含量测定方法包括对提取溶液中dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine的指纹图谱及含量测定。
4.根据权利要求3所述白及的检验方法，其特征在于：所述dactylorhin A、gymnosideI、gymnoside Ⅲ、militarine的指纹图谱及含量测定按照以下步骤进行：
（1）供试品溶液的制备：取白及饮片样品，粉碎，精密称定0.1~0.3 g，置于具塞锥形瓶中，加入40~60%乙醇5~15mL，塞紧瓶盖后，称定重量，超声提取，放冷后，称定，用乙醇补足损失，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；
（2）白及对照提取物溶液的制备：精密称取白及对照提取物4.50~5.50 mg，置10 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照提取物溶液；
（3）混合对照品溶液的配制：分别精密称取dactylorhin A、gymnoside I、gymnosideⅢ、militarine对照品适量，加乙醇溶解，配制成混合对照品溶液；
（4）色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1x100mm，1.8μm)；流动相A为0.05%磷酸水溶液，流动相B为乙腈；进行梯度洗脱；进样量2 μL；流速0.15 mL/min；柱温35℃；检测波长220 nm；
（5）含量测定法：分别吸取白及对照提取物溶液、供试品溶液和混合对照品溶液，注入UPLC高效液相色谱仪，分别采用白及对照提取物法和单体对照品法计算样品中的dactylorhin A、 gymnoside I、 gymnoside Ⅲ、militarine4个成分的含量;
（6）militarine作为《中国药典》2020年版评价白及质量的指标性成份，其峰面积较大，峰形较好，比较稳定，所以选择militarine作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，共有峰峰面积数据导入IBM SPSS Statistics 26软件，以降维因子对白及饮片样品进行主成分分析，根据特征值和累计贡献率，建立白及UPLC指纹图谱。
5.根据权利要求4所述白及的检验方法，其特征在于：步骤（1）中，所述供试品溶液的制备：取白及饮片样品，粉碎后过四号筛，精密称定0.2 g，置于具塞锥形瓶中，加入50%乙醇10mL，塞紧瓶盖后，称定重量，超声提取30 min，超声功率400 W，频率40 kHz，放冷后，称定，用50%乙醇补足损失，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
6.根据权利要求4所述白及的检验方法，其特征在于：步骤（2）中，所述白及对照提取物溶液的制备：精密称取白及对照提取物5.12 mg，置10 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照提取物溶液。
7.根据权利要求4所述白及的检验方法，其特征在于：步骤（3）中，所述混合对照品溶液的配制：分别精密称取dactylorhin A、gymnoside I、gymnoside Ⅲ、militarine对照品适量，加50%乙醇溶解，配制成质量浓度分别为0.2004 mg/mL、0.4000 mg/mL、0.1050 mg/mL、1.2100 mg/mL的混合对照品溶液。
8.根据权利要求4所述白及的检验方法，其特征在于：步骤（4）中，所述梯度洗脱程序为：0~2min，18%~20%B；2~3 min，20%~20%B；3~6 min，20%~22%B；6~7 min，22%~23%B；7~9min，23%~24%B；9~12 min，24%~26%B；12~16 min，26%~28%B；16~20 min，28%~100%B；20~24min，100%~100%B。
9.根据权利要求1或2所述白及对照提取物在制备止血药物中的应用。
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